Name: whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (R01 HD093778 ל- E.B-F ו- T32 HD007065 ל- R.B). אנו מודים לזאכרי בוצ'ר על עזרתו בניסוי הקרינה. אנו מודים למרי אן הנדל על הקריאה הביקורתית בכתב היד. אנו מודים תודה על תרומתם של סוניה ארטופוזה ושירות הליבה של המיקרוסקופיה במעבדת ג'קסון על סיוע מומחה בעבודת המיקרוסקופיה המתוארת בפרסום זה וג'ארק טרפסו משירותי המכשירים המדעיים במעבדת ג'קסון לתכנון שקופית המתאם המודפסת בתלת-ממד.

כל העכברים שבהם נעשה שימוש היו מהזן הגנטי C57BL/6J (ראו טבלת החומרים). זן זה רוצף באופן מלא והוא סטנדרטי למחקרים רבים על מבנה ותפקוד השחלות. עכברים שוכנו על פי הנחיות NIH, והנהלים שבוצעו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדת ג'קסון. ריאגנטים וקומפוזיציות המשמשים בפ...

מאמר זה מציג פרוטוקול חיסון והדמיה תלת-ממדי מפורט לשחלות טרום לידתיות ואחרי לידתיות למחקרים בתפוקה גבוהה והשוואתיות לכימות תאי נבט ולוקליזציה של חלבונים. פיתחנו את הפרוטוקול הזה כדי לנתח את מספרי הביציות בשחלות (N=6-12) בשש נקודות זמן התפתחותיות ב-10-16 זנים שונים, כאשר 2-4 לוחות 24-well מעובדים בד?...

רוב נקבות היונקים נולדות עם מספר סופי של ביציות שנעצרו במיוטיות המאוחסנות בתוך זקיקים ראשוניים, המהוות את שמורת השחלות (OR)1,2. ה- OR קובע את תוחלת החיים הכוללת של הרבייה הנשית ואתבריאותה 3. ה-OR בדרך כלל יורד בגודלו עם ההזדקנות וניתן לרוקן אותו בטרם עת עם חשיפה לחומרים גנוטוקסיים מסוימים (הקרנות/כימותרפיה) ולחצים סביבתיים (תת-תזונה), מה שמוביל לאי פוריות 4,5,6. לעתים קרובות ניתן לייחס אי פוריות נשית אידיופטית לאיכות הגנטית והפיזיולוגית של ביציות המתפתחות מה-OR ונשארות לא מובנות היטב 7,8. מכיוון שהקדשת זקיק נקבה נקבעת במידה רבה מראש על ידי לידה, חיוני להבין את מנגנוני הרגולציה המעורבים בהקמה ובתחזוקה של OR.
בעכברים, היווצרות OR מתחילה במפרט של תאי נבט ראשוניים (PGCs) סביב היום העוברי (E) 7.52. המחשבים נודדים לרכסי איברי המין, שם הם ישכנו על ידי כ- E10.59. ההתרבות הנרחבת הבאה מתרחשת עם ציטוקינזיזה לא שלמה וכתוצאה מכך נוצרות ציסטות שיתפרקו בהמשך ההתפתחות10,11. בסביבות E12.5, נקבע מין גונדלי, והתפשטות PGC נעצרת בשחלות. אצל נקבות, מחשבים אישיים, כיום ביציות, נכנסים לפרופאזה מיוטית I (MPI) בסביבות E13.512,13. ביציות מתקדמות דרך MPI ממושך ונעצרות בשלב ההכתבה סביב זמן הלידה. במהלך השבוע הראשון לאחר הלידה, כל ביצית שנעצרה מוקפת בתאי גרנולוזה, ובכך יוצרת זקיק קדמוני.
מספר הזקיקים הבראשיתיים ב-OR של נקבה תלוי בכמה ביציות שרדו את גלי סילוק הביציות המתרחשים לפני ובמהלך מעצר MPI באמצעות אפופטוזיס, אוטופגיה או נמק14,15. הגל הראשון מתרחש במהלך התפתחות העובר וידוע בשם FOA. FOA הוא תהליך שמור מבחינה אבולוציונית אצל נקבות (יונקים ולא יונקים), לפיו כ-50-80% מהביציות מסולקות בהתאם למין הנקבה 16,17,18,19. בעכברים, FOA מתרחש במהלך E15.5 עד E18.5 ויוחס להפעלה מחדש ולביטוי של רצפי LINE-1 רטרו-טרנספוזונים הגורמים למוות של ביציות20,21. הגל השני של חיסול ביציות מתרחש דרך מחסום מיוטי שמחסל ביציות עם פגמים מיוטיים כמו שברים דו-גדיליים של דנ"א שלא תוקן (DSBs)22,23. הגל הבא של חיסול ביציות מתרחש במהלך התמוטטות ציסטה, ומגיע לשיאו במהלך היווצרות של זקיקים ראשוניים, שכל אחד מהם מכיל ביצית אחת 10,11,24,25.
בעכברים, עתודת הזקיקים הבראשיתית הוקמה במידה רבה על ידי גיל ההתבגרות, ולאחר מכן היא פוחתת כאשר זקיקים ראשוניים מופעלים לצמיחה במהלך מחזורי רבייה רגילים. גודל OR משתנה בין נשים בודדות ובין זנים גנטיים שונים של עכברים; עם זאת, הוויסות הגנטי של גודל OR אינו מובן היטב 26,27,28,29. מחקרים גנטיים של ויסות OR נפגעים על ידי היעדר פרוטוקולים סטנדרטיים לחקור את גלי חיסול הביציות במהלך התפתחות טרום לידתית ואחרי לידה. מספר מתודולוגיות לכימות ביציות פותחו בעכברים, כאשר הנפוצה והנפוצה ביותר היא הערכה היסטומורפיתמטרית של חלקים היסטולוגיים30,31. בטכניקה זו, ביציות מזוהות בקטעים סדרתיים עם כתמים היסטולוגיים, כגון המטוקסילין ואוזין (H&E) וחומצה מחזורית-שיף (PAS) או סמנים פלואורסצנטיים. טכניקה זו אמינה אם כל התנאים נשארים קבועים, כולל עובי חתך, התאוששות יעילה של כל החלקים לאורך השחלה, ואת תוכניות הספירה של מעבדות בודדות. עם זאת, המספרים המדווחים על ידי מעבדות שונות לעתים קרובות שונים באופן משמעותי ולכן אינם ניתנים להשוואה בקלות.
יתר על כן, בהינתן הבדלים גנטיים, השימוש בזני עכברים שונים יכול גם להשפיע על ספירת הביציות. גישות חישוביות נוספות פותחו להערכה היסטומורפיתמטרית וכוללות זיהוי אוטומטי של ביציות באמצעות גישת השבר, ספירה אוטומטית באמצעות אלגוריתמים חישוביים ושחזור תלת-ממדי של תמונות היסטולוגיות כדי למנוע ספירות מרובות של אותה ביציה 31,32,33,34,35,36 . גם כאשר שיפורים אלה מתווספים להערכה היסטומומורפומטרית, הטכניקה היא יחסית עתירת עבודה, במיוחד עבור מחקרים בקנה מידה גדול ותפוקה גבוהה. ייתכן שהנתונים שנאספו לא יהיו ניתנים לשחזור ולהשוואה בין מחקרים בשל הבדלים בסכמות הספירה, באלגוריתמים הממוחשבים ובתוכנות שבהן נעשה שימוש.
לאחרונה, מואצת על ידי פיתוח של מיקרוסקופיית מולטיפוטונים ויריעות אור חדשות ברזולוציה בינונית ושיטות ניקוי רקמות אופטיות, טכניקות מידול וניתוח תלת-ממדיות לשחלות שלמות הופכות לשיטה המועדפת לכימות יעיל של מספרי ביציות וחקר לוקליזציה ודינמיקה של חלבונים37,38. שיטות תלת-ממדיות אלה הן בדרך כלל יתרון בהשוואה לשיטות היסטולוגיות, שכן רקמות ואיברים נשמרים טוב יותר ונשמרים ללא פגע. יתר על כן, ניתוח ומידול תלת-ממדיים מספקים תובנות נוספות לגבי תפקוד ואינטראקציות בתוך ובין נישות תאים או תת-מבנים בתוך האיבר שעלולים להחמיץ בניתוח דו-ממדי.
ניתוח תלת-ממדי של איברים שלמים דורש אופטימיזציה של קיבוע, חיסון ופרוטוקולי ניקוי אופטיים עבור איברים בודדים, כגון שחלות, ללא עיוות או נזק לרקמות. אופטימיזציה נוספת של הרכבה לדוגמה להדמיה נדרשת למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה ועשויה להיות תלויה בפלטפורמת ההדמיה הזמינה. לבסוף, הדמיה של השחלה השלמה כולה מייצרת כמות גדולה של נתונים עבור ניתוחים חישוביים מאוחרים יותר. לכן, יש צורך לפתח שיטות תלת-ממדיות סטנדרטיות לספירת ביציות למחקרים השוואתיים ולשלבים התפתחותיים שונים.
פרוטוקול זה משתמש בפרוטוקולי סילוק חיסוני סטנדרטיים ודווחו בעבר, תוך התמקדות בגישה פשוטה, ידידותית למשתמש ותפוקה גבוהה 38,39,40,41. הפרוטוקול מותאם לניתוח מספר גדול של שחלות טרום לידתיות ואחרי לידה עד ליום 28 שלאחר הלידה (P28) וגדלים משתנים של שחלות מרקע גנטי שונה של עכברים. הצעדים החיסוניים דומים לכל השלבים; עם זאת, פרוטוקולי הסליקה שונים עבור שחלות ההתבגרות בשל גודלן הגדול יותר, ScaleS4(0) ו- CUBIC עבור שחלות קטנות וגדולות, בהתאמה40,41. יתר על כן, זלוף של כל הגוף מבוצע בעכברי P28 לפני הקיבוע כדי למנוע אוטופלואורסצנציה מתאי הדם. מיקרוסקופ מולטי-פוטון נבנה על פלטפורמת Leica DIVE/4Tune כחלופה למיקרוסקופ יריעות אור כדי להשיג תמונות, ותוכנת ההדמיה והניתוח התלת-ממדית של IMARIS עם כלים אנליטיים שונים נבחרה לפרוטוקול זה. פרוטוקול זה פשוט למעקב ופחות מעשי, ומכאן חיסכון בזמן. יתר על כן, כימות הביציות הוא מהיר יחסית, בהתאם לגודל השחלה וסידור הביציות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchtop Incubator</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H2200-H</td>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>mouse inbred strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1435</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastWells Reagent Barriers</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>664113</td>
			<td>Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21246</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21434</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Version 9.7.0</td>
			<td>Image visualization and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight X3</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight&#160;X3 Tunable Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Version 3.5.6</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406</td>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Pump Controller</td>
			<td>SPW Industrial</td>
			<td>Model: 7553-50</td>
			<td>Peristaltic pump for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14010-17</td>
			<td>5&#8221; &#8211;7&#8221; blunt/blunt scissors for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini BioMixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D1020</td>
			<td>shaker/nutator for 37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ergonomic SMZ1270</td>
			<td>Leica</td>
			<td>&#160;SMZ1270</td>
			<td>stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>Dissolve in Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ICN1670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DDX4/MVH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27591</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LINE-1 ORF1p</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab216324</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-TRA98/GCNA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82527</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tekmar Orbital Shaker</td>
			<td>Bimedis</td>
			<td>VXR-S10</td>
			<td>shaker for room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNOLOK Infusion Set</td>
			<td>MYCO Medical</td>
			<td>7001-23</td>
			<td>needles for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>97061-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120LED</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>S/N XT640-W-0147</td>
			<td>low-power LED fluorescence lamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse

פוריות הנקבה ותוחלת חיי הרבייה תלויים באיכות ובכמות של עתודת הביציות השחלתית. על פי הערכות, כ-80% מתאי הנבט הנקביים הנכנסים לפרופאזה מיוטית אני מסולקים במהלך התשה של ביציות עובריות (FOA) ובשבוע הראשון לחיים שלאחר הלידה. שלושה מנגנונים עיקריים מווסתים את מספר הביציות ששורדות במהלך ההתפתחות ומבססות את עתודת השחלות אצל נקבות הנכנסות לגיל ההתבגרות. בגל הראשון של אובדן ביציות, 30-50% מהביציות מסולקות במהלך FOA מוקדם, תופעה המיוחסת לביטוי גבוה של יסוד גרעיני משולב ארוך-1 (LINE-1). הגל השני של אובדן ביציות הוא חיסול ביציות עם פגמים מיוטיים על ידי מחסום איכות מיוטי. הגל השלישי של אובדן ביציות מתרחש באופן פרינטלי במהלך היווצרות זקיקים קדמוניים כאשר חלק מהביציות אינן מצליחות ליצור זקיקים. עדיין לא ברור מה מווסת כל אחד משלושת הגלים האלה של אובדן ביציות וכיצד הם מעצבים את שמורת השחלות בעכברים או בבני אדם.
אימונופלואורסצנציה והדמיה תלת-ממדית פתחו אפיק חדש לדימוי ולניתוח התפתחות הביציות בהקשר של השחלה כולה ולא בקטעים דו-ממדיים פחות אינפורמטיביים. מאמר זה מספק פרוטוקול מקיף לחיסון שחלות שלם וסליקה אופטית, המניב הכנות להדמיה באמצעות מיקרוסקופיית מולטיפוטונים ומידול תלת-ממדי באמצעות תוכנה זמינה מסחרית. הוא מראה כיצד ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להראות את הדינמיקה של התשה של ביציות במהלך התפתחות השחלות בעכברי C57BL/6J ולכמת את אובדן הביציות במהלך שלושת הגלים של חיסול הביציות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על שחלות טרום לידתיות ומוקדם לאחר הלידה עבור הדמיה וכימות של ביציות, כמו גם גישות כמותיות אחרות. חשוב לציין שהפרוטוקול פותח באופן אסטרטגי כדי להתאים לעיבוד בעל תפוקה גבוהה, אמין וניתן לחזרה שיכול לענות על הצרכים בטוקסיקולוגיה, אבחון קליני ובדיקות גנומיות של תפקוד השחלות.

חיסון והדמיה של השחלה כולה מאפשרים הדמיה וכימות של ביציות או ביטוי חלבונים בשחלות בשלבים התפתחותיים שונים באמצעות אותה טכניקה וסמנים (איור 3). פרוטוקול זה פותח עבור פרויקט בקנה מידה גדול שבו נדרש ניתוח של שחלות בשלבים מרובים ומזני עכברים מרובים. כאן אנו מציגים נתונים שנאספ...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse at JoVE.com

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם להדמיית שחלות שלמות לניתוחים כמותיים ואיכותיים באמצעות שמירה חיסונית בהרכבה מלאה, מיקרוסקופיית מולטי-פוטון והדמיה וניתוח תלת-ממדיים. פרוטוקול זה מתאים לעיבוד בעל תפוקה גבוהה, אמין וניתן לחזרה, החל על טוקסיקולוגיה, אבחון קליני ובדיקות גנומיות של תפקוד השחלות.

אימונופלואורסצנציה של השחלה כולה, ניקוי ומיקרוסקופיה מרובת פוטון לניתוח תלת-ממדי כמותי של עתודת השחלות המתפתחות בעכבר

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על אחת משאלות המפתח בתחום הרבייה, כלומר כיצד ומתי תהליכים מווסתים גנטית משפיעים על גודל השמורה השחלתית שאנו יודעים שמשפיעים על נקבות, אריכות ימים רבייתית פרוטוקול זה ניתן לאמץ למחקרים בקנה מידה גדול תוך שימוש באותן טכניקות עבור שחלות שלמות משלבים התפתחותיים שונים. הוא מייצר נתונים הניתנים לייצור על ידי מתן כימות יעיל של תאי נבט. שיטה זו המיושמת על בעלי חיים מגוונים מבחינה גנטית מאותו המין יכולה לספק תובנה לגבי הגורמים הגנטיים ישירות להתפתחות תאי נבט ושחלות ואיברי התפתחות אחרים.המדגים את ההליך יהיה נתנאל בוחט, מתמחה מחקר מהמעבדה שלי כדי להתחיל עם שלב השפע ולאבטח את העכברה הנשית המורדמת על גבה על ידי הצמדה עדינה של כל הרגליים דרך כריות הכפות בתנוחה רגועה על לוח. כדי לפתוח את חלל החזה של העכבר, חותכים בזהירות את הצלעות משני צידי עצם החזה ממש מתחת לעצם השכמה, תוך הימנעות מניקוב הריאות תופסות את העור או דשי הצלעות עם המלקחיים ומצמידים את הדשים כדי לחשוף את האיברים הפנימיים משתמשים במספריים של דיסקציה כדי לחתוך את האטריום הימני של הלב ולשחרר דם מהמערכת. לאחר מכן על ידי החזקת הלב עם מלקחיים להכניס מחט פרפוזיה לתוך החדר השמאלי ולשאוב 10 מיליליטרים של PBS בלחץ עדין וקבוע.כאשר הרקמות כגון כליות הכבד ומערכת הרבייה הפכו מוורוד ללבן החליפו את ה- PBS ב- 1% paraformaldehyde או PFA שזה עתה נוצרו וממשיכים לזלוף עם כ -10 מיליליטרים של PFA. לאחר מכן אתרו את כרית השומן עם השחלות מתחת לכליה ונתחו בעדינות את כל מערכת הרבייה כולל השחלות של כרית השומן וקרני הרחם כדי להניח אותה בבקבוקון עם 4% PFA. תקן את השחלות בטמפרטורת החדר במשך 16 עד 24 שעות לפני שתחליף את ה- 4% PFA ב- 70% אתנול.ביום הכתם לקצץ את השחלות לפני שממשיכים עם הכתם החיסוני. ביום הראשון של פרוטוקול הכתמת החיסון פיפטה מיליליטר אחד של PBS לכל באר לתוך מספר הבארות הרצוי בצלחת נקייה של 24 בארות. חתכו את קצהו של קצה פיפטה 1000 מיקרוליטר כדי ליצור פתח רחב והשתמשו בקצה הרחב כדי להעביר בעדינות את השחלות ההתבגרותיות מבקבוקונים עם 70% אתנול לתוך הבארות, ואז החליפו את PBS בבאר עם 0.8 מיליליטר טריים של PBS למחרת שאפתו PBS מהבארות כדי להחליף אותו ב-0.8 מיליליטר של חיץ החדירה לכל באר.לאחר דגירה של הצלחות על השייקר בטמפרטורת החדר במשך ארבע שעות החליפו את מאגר החדירה בחיץ חסימה ביום השלישי, הכינו את הנוגדנים העיקריים על ידי דילול במאגר החסימה. כדי לדמיין את הביציות הדגירה של השחלות הטרום לידתיות והקדם-פוברטליות עם סמני הביציות. ביום השמיני שוטפים את הדגימות עם מאגר כביסה טרי למשך שעתיים ואז מחליפים את מאגר הכביסה ב-0.5 מיליליטר של תערובות הנוגדנים המשניות המדוללות במאגר חוסם.אטמו את הצלחת בפרפילם כדי למנוע אידוי ודגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר בחושך במשך שלושה ימים. ביום ה-11 לאחר שטיפת הכתם החיסוני, שאפו את מאגר הכביסה ודגרו את הדגימות עם 0.8 מיליליטר של תמיסת תמיסה אחת מעוקב בקנה מידה של 37 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים בחושך. שינוי קנה המידה של פתרון אחד מעוקב אחד מדי יום.ביום ה-15, שטפו את הדגימות שלוש פעמים במשך 10 דקות ו-0.8 מיליליטר של PBS בטמפרטורת החדר עם טלטולים עדינים. לאחר מכן החליפו את ה-PBS ב-0.8 מיליליטרים של 20% סוכרוז מגז טרי עם PBS ולאחר מכן רעידות עדינות בטמפרטורת החדר. לאחר שעה אחת להחליף את תמיסת 20% סוכרוז לטיפול בדגימות עם 0.8 מיליליטר של תמיסת שניים מעוקב בקנה מידה במשך ארבעה עד חמישה ימים, כפי שהוסבר קודם לכן.כדי להכין מערך דגימה, השתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר עם חתך הקצה כדי להעביר את השחלות ההתבגרותיות עם 15 עד 20 מיקרוליטרים של תמיסה מעוקב שתיים בקנה מידה גדול לאמצע באר ההדבקה. לאחר העברת השחלות לבאר הבודדת עם טיפה של תמיסת ניקוי הניחו בעדינות כיסוי על באר הדבק ולחצו כדי ליצור אטם הכרוך בדגימות ותמיסת ניקוי בין שני תלושי כיסוי. למקום ההדמיה, כריך החלקת הכיסוי בשקופית מתאם מיקרוסקופ מודפסת בתלת-ממד.הגדר את הפרמטרים לרכישת תמונה בהתאם לליבות המיקרוסקופיה או מפרט היצרן. אם היא זמינה, השתמש ברכישת תמונה דו-כיוונית כדי לקצר את זמן הסריקה ולשפר את היעילות. התאם את ממוצע הקווים, ממוצע המסגרות וצבירת המסגרות בתוכנה.הגדר את מחסנית Z על ידי זיהוי מיקום ההתחלה והסוף, ולאחר מכן בחר גודל צעד Z של שני מיקרומטרים עבור שחלות פרה-פוברטליות וחמישה מיקרומטרים עבור השחלות המתבגרות. לאחר מכן הפעל את תכונת הפיצוי Z ואת רווח העירור. הגדר את פיצוי Z עבור החלק התחתון והחלק העליון של הדגימה על ידי בחירת עוצמת לייזר עבור שניהם.השתמש במצב ריצוף עבור דגימות גדולות יותר שלא ניתן ללכוד בשדה ראייה יחיד. הפעל את נווט התמונה וציין את מספר האריחים הדרושים ללכידת הדגימה כולה באמצעות כלי הסימון המלבני. לאחר סיום ההגדרה, התחל ברכישת התמונה עבור התמונות עם אריחים מרובים, התחל ברכישת תמונה עם הנווט כדי ללכוד את כל האריחים.לאחר רכישת התמונה, שמור את כל התמונות. ואם נרכשו אריחים מרובים, הפעל את הכלי הממוזג בפסיפס כדי למזג את האריחים לתמונה אחת. כדי לקבוע את גודל הביציות, פתח את התמונה ובחר באפשרות פרוסה כדי לפתוח את תמונת מחסנית Zs.בחר את אפשרות הקו ואת לוח המדידה ומדוד את המרחק על ידי ציור קו מקצה אחד של ביצית או סמן לקצה השני בנקודה הרחבה ביותר כדי לקבוע את קוטר X Y של הביצית. לעבור דרך הערימה ולקבל את טווח הקטרים עבור מספר ביציות מאותו סוג. השתמש באורך הקצר ביותר כאשר קריטריון בחירת הגודל עבור ביציות נחשב.לאחר מכן, באפשרות תצוגה תלת-ממדית, בחר את תכונת הנקודות. בחלונית הסצנה הפעל את פונקציית הוספת הכתמים החדשים כדי לפתוח את לוח האלגוריתם. לאחר מכן בטל את הבחירה בכל הגדרות האלגוריתם כמסנן בחירת הגודל עם גודל הביציות שהתקבל קודם לכן.לחץ על החץ קדימה של הערוץ כדי לעבור לערוץ המקור. לאחר מכן בחר את הערוץ עם הסמן המועדף והקלד את הקוטר הנרכש בקוטר המשוער X, Y. לאחר בחירת הגודל הפעל את התארכות ה- PSF של הדגם וחיסור הרקע אשר נקבעים באופן אוטומטי.לאחר מכן, בחר את החץ הבודד קדימה כדי לעבור לחלונית כתמי המסנן והוסף את מסנן האיכות כדי לקבוע סף. כדי להבטיח את ההערכה המדויקת של מספרי הביציות להגדיל את התמונה. מאוחר יותר, לחץ על החץ הכפול כדי לסיים ספירות אוטומטיות.השתמש בכרטיסיית העריכה כדי לבחור באופן ידני ביציות שהוחמצו או לבטל את הבחירה בחלקיקים שאינם קוציצים שנבחרו על ידי הסף האוטומטי. בסיום, רשום את הנתונים בכרטיסייה נתונים סטטיסטיים תחת הכרטיסייה הכוללת לניתוח נוסף. כדי להעריך את מספרי הביציות הכוללים ואת השחלות הפגומות, פתחו תמונות של השחלות השלמות עם MRS ובחרו את תכונת המסגרת.תחת הגדרות המסגרת, בחר את סימני הסימון של רשת התיבה וגישה לתוויות. במיקום XYZ הכרטיסייה בחר 200 microme כדי ליצור סימני תקתוק עם 200 מרחבי מיקרומטר בכל מיקומי XYZ. באמצעות סימני קרציות של 200 מיקרומטר, בחר ביציות שנופלות בטווח של 50% מנפח כל שחלה.לחץ על תכונת הכתמים ובחר את תוויות העריכה כדי לסווג את הביציות שנמצאות באזור 50% לפי צבע. בתמונות האפורות הייצוגיות, מרובות הפוטונים, של השחלות שאינן מחוררות וחדורות, ניתן היה לראות את הביציות הקטנות בזקיקים קדמוניים עם השכבה הדקה של צביעת DDX4 ציטופלסמית. בנוסף, נצפו הביציות הגדולות יותר בתוך הזקיקים הגדלים.ההדמיות התלת-ממדיות מהתמונות הרב-פוטוניות של השחלות הטרום-לידתיות והשחלות שלאחר הלידה נחקרו. ביום שלאחר הלידה 28, השחלה מהנקבה הלא מוקרנת הכילה אוכלוסייה גדולה של ביציות קטנות בזקיקים הראשוניים. לעומת זאת, השחלות של הנקבה המוקרנת עם 0.5 אפור של קרינת הגמא היו נטולות לחלוטין של ביציות קטנות בזקיקים הראשוניים.אבל ביציות גדולות יותר עדיין היו קיימות. לצורך כימות הביציות, תמונות הפוטונים הרב-ממדיות התלת-ממדיות עובדו בתוכנת MRS באמצעות המסנן הגוציאני והביציות בגדלים קטנים וגדולים זוהו וכומתו באמצעות תכונת הכתם. לאחר מכן, האחוז הממוצע של הביציות חושב בכל שלב בהשוואה למספר הממוצע הנוכחי בשלב המוקדם ביותר E 15.5 מספרי הביציות ירדו בחדות בין E 15.5 ל- E 18.5 ה- E 15.5 ו- E 18.5 ביציות עובריות ביטאו קו אחד אוF אחד P כפי שניתן לראות בתמונות מרובות הפוטונים.ניתוח העוצמה הראה ביטויים גבוהים יותר של קו 1 או P אחד לכל ביצית ב-E 18.5 מאשר E 15.5. השחלות עם נזק קטן יכול לשמש לניתוח. המספרים הכוללים של הביציות נקבעים באמצעות תיקון חישובי.המודל הייצוגי מראה ביציות חיוביות G CNA בשחלה E 15.5 עם חמישה אזורים של 10% המודגשים בשחלה שלמה. באופן דומה, נוצרה שחלה מדומה עם 10% אזורים מצטברים שחסרים בה עד 50% מהשחלה. מספרי הביציות הכוללים והשחלות המדומות הושוו לשחלות השלמות המקוריות.וההבדל הוצג כסטיית האחוזים פרפוזיה טובה מביאה לאיכות תמונה טובה. לכן ודאו שכל הרקמות מנוקות באמצעות PBS לפני המעבר ל-PFA. יש לוודא כי השחלות חשופות לחלוטין על ידי חיתוך הרקמה הנוספת.הפרוטוקול מאפשר ניתוח יעיל של מספר רב של דגימות, נתונים כמותיים המתקבלים מאוכלוסיות ייחוס גנטיות כגון תפוקה צולבת או גיוון שיתופית יסייעו בזיהוי משנים גנטיים של התפתחות ביציות ומספרי ביציות.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

תרבות איברים שלמים הר Immunofluorescence מכתים של עכבר Wolffian צינוריות

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...