Name: whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00
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この研究は、国立衛生研究所の助成金(R01 HD093778からE.B-FおよびT32 HD007065からR.B)によって支援されました。放射線実験に協力してくれたザカリー・ブーシェに感謝します。原稿を批判的に読んでくれたメアリー・アン・ヘンデルに感謝します。私たちは、この出版物に記載されている顕微鏡検査作業の専門家の支援に対するジャクソン研究所のSonia Erattupuzhaと顕微鏡コアサービス、および3Dプリントされたアダプタースライドの設計のためのジャクソン研究所の科学機器サービスのJarek Trapszoの貢献に感謝します。

使用した全てのマウスは、遺伝子株C57BL/6Jのものであった( 材料表参照)。この株は完全に配列決定されており、卵巣の構造と機能に関する多くの研究の標準です。マウスはNIHガイドラインに従って飼育され、実施された手順はジャクソン研究所の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された。このプロトコールで使用される試薬および組成物は、それぞれ 材料...

この記事では、生殖細胞定量とタンパク質局在化のためのハイスループットおよび比較研究のための出生前および出生後の卵巣の詳細な3D免疫染色およびイメージングプロトコルを紹介します。我々は、卵巣(N=6-12)の卵母細胞数を、2-4個の24ウェルプレートが通常一度に処理される10-16個の異なる株の6つの発生時点で分析するために開発した。この方法は、他の器官または細胞マーカーに適合?...

ほとんどの哺乳類の雌は、卵巣予備(OR)を構成する原始卵胞内に貯蔵された有限数の減数的に停止した卵母細胞で生まれます1,2。ORは、女性の全体的な生殖寿命と健康状態を決定します3.ORは通常、加齢とともにサイズが減少し、特定の遺伝毒性物質(放射線/化学療法)および環境ストレス(栄養失調)への曝露により早期に枯渇し、不妊症につながる可能性がある4,5,6。特発性女性不妊症は、ORから発達する卵の遺伝的および生理学的品質に起因することが多く、あまり理解されていない7,8。雌卵胞の授乳は出生によって大部分があらかじめ決められているため、ORの確立と維持に関与する調節メカニズムを理解することが不可欠です。
マウスにおいて、OR形成は、胚日(E)7.52の周りの始原生殖細胞(PGC)の仕様から始まる。PGCは生殖器の隆起に移動し、そこで約E10.59が常駐します。以下の広範な増殖は、不完全なサイトカイン作用で起こり、その結果、嚢胞の形成が起こり、それは開発の後半で分解される10,11。約E12.5で、性腺の性別が決定され、卵巣におけるPGC増殖が停止する。女性では、PGC(現在は卵母細胞)は、約E13.512,13で減数分裂前期I(MPI)に入る。卵母細胞は、拡張MPIを介して進行し、出生時の周りの指示段階で逮捕する。生後最初の1週間の間に、逮捕された各卵母細胞は顆粒膜細胞に囲まれ、それによって原始卵胞を形成する。
女性のORにおける始原卵胞の数は、アポトーシス、オートファジー、または壊死によるMPI停止の前および最中に起こる卵母細胞排除の波を生き残った卵母細胞の数に依存する14,15。第1波は胎児の発育中に発生し、FOAとして知られています。FOAは、雌(哺乳類および非哺乳類)における進化的に保存されたプロセスであり、それによって、雌種に応じて卵母細胞の推定50〜80%が排除される16、17、18、19。マウスでは、FOAはE15.5からE18.5の間に発生し、レトロトランスポゾンLINE-1配列の再活性化および発現が卵母細胞死を引き起こすことに起因している20,21。卵母細胞除去の第2波は、修復されていないDNA二本鎖切断(DSB)22,23などの減数分裂欠損を有する卵母細胞を排除する減数分裂チェックポイントを介して起こる。卵母細胞排除の次の波は、嚢胞の分解中に起こり、それぞれが単一の卵母細胞10、11、24、25を含む原始卵胞の形成中に最高潮に達する。
マウスでは、始原卵胞予備は思春期までに大部分が確立され、その後、始原卵胞が定期的な生殖サイクル中に成長のために活性化されるにつれて減少する。ORサイズは、個々の女性間およびマウスの異なる遺伝的系統間で異なる。しかし、ORサイズの遺伝的調節はよく理解されていない26,27,28,29。OR調節の遺伝学的研究は、出生前および出生後の発達中の卵母細胞除去の波を研究するための標準化されたプロトコルの欠如によって妨げられている。いくつかの卵母細胞定量化方法論がマウスにおいて開発されており、最も一般的で広く使用されているのは、組織学的切片30、31の組織形態学的評価である。この技術では、卵母細胞は、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)および過ヨウ素酸シッフ(PAS)または蛍光マーカーなどの組織学的染色を有する連続切片上で同定される。この技術は、切片の厚さ、卵巣全体のすべての切片の効率的な回収、および個々の実験室の計数スキームを含む、すべての条件が一定であれば信頼性が高い。しかし、異なる研究所によって報告された数字はしばしば大きく異なるため、容易に比較することはできません。
さらに、遺伝的差異を考えると、異なるマウス系統の使用も卵母細胞数に影響を及ぼし得る。組織形態評価のために追加の計算アプローチが開発されており、フラクショメータアプローチを用いた卵母細胞の自動検出、計算アルゴリズムを用いた自動計数、および同じ卵母細胞の複数の計数を防止するための組織学的画像の3D再構成31、32、33、34、35、36が含まれる。.これらの改善が組織形態評価に追加されても、この技術は、特に大規模でハイスループットな研究では、比較的労働集約的である。収集されたデータは、計数スキーム、コンピュータアルゴリズム、および使用されるソフトウェアの違いにより、研究間で再現性および比較できない場合があります。
近年、新しい中分解能多光子および光シート顕微鏡法および光学組織透明化法の開発によって加速され、無傷の卵巣の3Dモデリングおよび解析技術は、卵母細胞数を効率的に定量し、タンパク質の局在およびダイナミクスを研究するための選択方法になりつつある37,38。これらの3D方法は、組織および器官がよりよく保存され、無傷で維持されるため、組織学的方法と比較して典型的に有利である。さらに、3D解析とモデリングは、2D解析では見逃される可能性のある臓器内の細胞ニッチまたは下部構造内および細胞ニッチまたは下部構造間の機能および相互作用に関する追加の洞察を提供します。
臓器全体の3D解析では、組織の歪みや損傷なしに、卵巣などの個々の臓器の固定、免疫染色、および光学的クリアリングプロトコルを最適化する必要があります。高解像度顕微鏡では、イメージングのためのサンプルマウントの追加最適化が必要であり、利用可能なイメージングプラットフォームに依存する場合があります。最後に、無傷の卵巣全体をイメージングすると、その後の計算分析のために大量のデータが生成されます。したがって、比較研究のために、および発生段階にわたって卵母細胞を計数するための標準化された3D方法を開発する必要がある。
このプロトコルは、標準的な免疫染色および以前に報告されたクリアリングプロトコルを使用し、シンプルでユーザーフレンドリーでハイスループットなアプローチに焦点を当てています38,39,40,41。このプロトコルは、出生後28日目(P28)までの多数の出生前および出生後の卵巣、および異なるマウス遺伝的背景からの様々なサイズの卵巣を分析するように最適化されている。免疫染色ステップは、すべてのステージで類似している。しかし、開嚢プロトコルは、そのサイズが大きいため、思春期卵巣では異なり、ScaleS4(0)およびCUBICは、それぞれ40,41の小卵巣および大型卵巣の場合である。さらに、全身灌流は、血球からの自己蛍光を防ぐために、固定前にP28マウスにおいて行われる。画像を取得するためのライトシート顕微鏡の代替として、Leica DIVE/4Tuneプラットフォーム上に多光子顕微鏡が構築され、このプロトコルにはさまざまな分析ツールを備えたIMARISの3D視覚化および分析ソフトウェアが選択されました。このプロトコルは従うのが簡単で、実践的ではないため、時間を節約できます。さらに、卵母細胞の定量化は、卵巣のサイズおよび卵母細胞の配置に依存して、比較的迅速である。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchtop Incubator</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H2200-H</td>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>mouse inbred strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1435</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastWells Reagent Barriers</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>664113</td>
			<td>Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21246</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21434</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Version 9.7.0</td>
			<td>Image visualization and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight X3</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight&#160;X3 Tunable Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Version 3.5.6</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406</td>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Pump Controller</td>
			<td>SPW Industrial</td>
			<td>Model: 7553-50</td>
			<td>Peristaltic pump for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14010-17</td>
			<td>5&#8221; &#8211;7&#8221; blunt/blunt scissors for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini BioMixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D1020</td>
			<td>shaker/nutator for 37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ergonomic SMZ1270</td>
			<td>Leica</td>
			<td>&#160;SMZ1270</td>
			<td>stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>Dissolve in Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ICN1670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DDX4/MVH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27591</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LINE-1 ORF1p</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab216324</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-TRA98/GCNA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82527</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tekmar Orbital Shaker</td>
			<td>Bimedis</td>
			<td>VXR-S10</td>
			<td>shaker for room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNOLOK Infusion Set</td>
			<td>MYCO Medical</td>
			<td>7001-23</td>
			<td>needles for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>97061-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120LED</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>S/N XT640-W-0147</td>
			<td>low-power LED fluorescence lamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse

女性の生殖能力と生殖寿命は、卵巣卵母細胞予備の質と量に依存します。減数分裂前期Iに入る雌生殖細胞の推定80%は、胎児卵母細胞消耗(FOA)および出生後生の最初の週に排除される。3つの主要なメカニズムは、発達中に生存し、思春期に入る女性の卵巣予備能を確立する卵母細胞の数を調節する。卵母細胞喪失の第1波では、卵母細胞の30〜50%が初期のFOA中に排除され、これは高い長い散在核元素-1(LINE-1)発現に起因する現象である。卵母細胞喪失の第2の波は、減数分裂品質チェックポイントによる減数分裂欠損を有する卵母細胞の排除である。卵母細胞喪失の第3波は、いくつかの卵母細胞が卵胞を形成できないときに、原始卵胞形成中に周産期に起こる。卵母細胞喪失のこれら3つの波のそれぞれを調節するものと、それらがマウスまたはヒトのいずれかの卵巣予備をどのように形成するかは不明のままである。
免疫蛍光と3Dビジュアライゼーションは、あまり情報量の少ない2Dセクションではなく、卵巣全体のコンテキストで卵母細胞の発生を画像化および分析するための新しい道を開きました。この記事では、全卵巣免疫染色および光学的クリアリングのための包括的なプロトコルを提供し、多光子顕微鏡を使用したイメージングおよび市販のソフトウェアを使用した3Dモデリングのための調製物を得る。C57BL/6Jマウスにおける卵巣発生中の卵母細胞消耗のダイナミクスを示し、卵母細胞排除の3つの波の間の卵母細胞喪失を定量化するために、この方法をどのように使用できるかを示す。このプロトコルは、卵母細胞の視覚化および定量化、ならびに他の定量的アプローチのために、出生前および出生後卵巣に適用することができる。重要なことに、このプロトコルは、毒物学、臨床診断、および卵巣機能のゲノムアッセイにおけるニーズを満たすことができる、高スループットで信頼性が高く、再現性のある処理に対応するために戦略的に開発されました。

卵巣全体の免疫染色およびイメージングは、同じ技術およびマーカーを使用して、異なる発生段階における卵巣における卵母細胞またはタンパク質発現の可視化および定量を可能にする(図3)。このプロトコルは、複数の段階での卵巣の分析と複数のマウス系統からの卵巣の分析が必要な大規模プロジェクトのために開発されました。ここでは、遺伝子解析の標準株であ?...

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Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

ここでは、ホールマウント免疫染色、多光子顕微鏡、および3D可視化および分析を使用した定量的および定性的な分析のために、卵巣全体をイメージングするための最適化されたプロトコルを紹介します。このプロトコルは、毒物学、臨床診断、および卵巣機能のゲノムアッセイに適用可能な、高スループットで信頼性が高く、再現性のある処理に対応します。

マウスの発達中の卵巣保護区の定量的3D分析のための全卵巣免疫蛍光、クリアリング、および多光子顕微鏡

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

この方法は、生殖分野における重要な質問の1つ、すなわち、遺伝的に調節されたプロセスが卵巣予備の大きさにどのように影響するか、すなわち、女性、生殖寿命にどのように影響するかという重要な質問の1つに答えるのに役立ち得、このプロトコルは、異なる発達段階からの無傷の卵巣に対して同じ技術を使用する大規模な研究に採用することができる。生殖細胞の効率的な定量化を提供することによって生産可能なデータを生成します。同種の遺伝的に多様な動物に適用されるこの方法は、生殖細胞および卵巣の発生ならびに他の発達器官の遺伝的要因を直接的に知ることができる。手順を実演するのは、私の研究室の研究インターンであるNathaniel Boechatです 豊富なステップの場所から始めて、麻酔をかけられた思春期の雌マウスを背中に固定し、足パッドを通してすべての脚をボードにリラックスした位置で優しく固定します。マウスの胸腔を開くには、肩甲骨のすぐ下の胸骨の両側の肋骨を慎重に切断し、肺の穿刺を避け、鉗子で皮膚または肋骨フラップをつかみ、フラップを固定して内臓を露出させ、解剖ハサミを使用して心臓の右心房を切り取り、システムから血液を放出する。次に、鉗子で心臓を保持することにより、左心室に灌流針を挿入し、穏やかで一定の圧力でPBSの10ミリリットルをポンプで送ります。肝臓の腎臓や生殖管などの組織がピンク色から白色に変わったら、PBSを新しく作った1%パラホルムアルデヒドまたはPFAに置き換え、約10ミリリットルのPFAで灌流を続けます。次に、腎臓の下の卵巣を持つ脂肪パッドを見つけ、脂肪パッドの卵巣と子宮角を含む生殖管全体を静かに解剖して、4%PFAのバイアルに入れます。4%PFAを70%エタノールで置き換える前に、卵巣を室温で16〜24時間固定する。染色の日に免疫染色を進める前に卵巣をトリミングする。免疫染色プロトコールの1日目に、1ウェル当たり1ミリリットルのPBSを清浄な24ウェルプレート中の所望の数のウェルにピペットする。1000マイクロリットルのピペットチップの先端を切り取って広い開口部を作り、広い先端を使用してバイアルから思春期卵巣を70%エタノールでウェルに穏やかに移し、ウェル内のPBSを新鮮な0.8ミリリットルのPBSで交換し、翌日ウェルからPBSを吸引し、ウェルあたり0.8ミリリットルの透過バッファーに置き換えます。プレートを室温でシェーカー上で4時間インキュベートした後、3日目に透過緩衝液をブロッキング緩衝液に交換し、ブロッキング緩衝液で希釈することにより一次抗体を調製する。卵母細胞を視覚化するために、出生前および思春期前の卵巣を卵母細胞マーカーと共にインキュベートする。8日目にサンプルを新鮮な洗浄バッファーで2時間洗浄し、洗浄バッファーをブロッキングバッファーで希釈した0.5ミリリットルの二次抗体ミックスと交換します。蒸発を防ぐためにプレートをパラフィルムでシールし、室温の暗所で3日間サンプルをインキュベートします。免疫染色洗浄後11日目に、洗浄バッファーを吸引し、0.8ミリリットルのスケール立方体1溶液と共にサンプルを37°Cで暗所で3日間インキュベートする。スケールを1次的に1つの溶液に毎日変更する。15日目に、サンプルを室温で10分間および0.8ミリリットルのPBSで穏やかに振とうしながら3回洗浄する。次いで、PBSをPBSで調製したばかりの脱気20%スクロースの0.8ミリリットルと交換し、続いて室温で穏やかに振とうした。1時間後、20%スクロース溶液を交換して、前述のように、サンプルを0.8ミリリットルのスケール立方体2溶液で4〜5日間処理する。セットアップされたサンプルを調製するには、先端がカットオフされた200マイクロリットルのピペットチップを使用して、15〜20マイクロリットルのスケール立方体2溶液で思春期卵巣を接着剤ウェルの中央に移す。卵巣が透明化溶液の滴で個々のウェルに移されたら、接着剤ウェルにカバーガラスを静かに置き、プレスして、サンプルと透明化溶液を2つのカバースリップの間に挟むシールを作成する。撮像場所については、3Dプリントされた顕微鏡アダプタスライドでカバースリップサンドイッチする。顕微鏡コアまたは製造元の仕様に従って、画像取得用のパラメータを設定します。可能であれば、双方向画像取得を使用してスキャン時間を短縮し、効率を向上させます。ソフトウェアでライン平均、フレーム平均、フレーム累積を調整します。開始位置と終了位置を特定してZスタックを設定し、思春期前卵巣の場合は2マイクロメートル、思春期卵巣の場合は5マイクロメートルのZステップサイズを選択します。次に、Z補正機能と励起ゲインを有効にします。サンプルの下部と上部の両方にレーザー強度を選択して、Z補正を設定します。タイリングモードは、単一の視野でキャプチャできない大きなサンプルに使用します。画像ナビゲーターをアクティブにし、長方形のマーキング ツールを使用してサンプル全体をキャプチャするために必要なタイルの数を指定します。設定が完了したら、複数のタイルを持つ画像の画像取得から開始し、ナビゲータで画像取得を開始してすべてのタイルをキャプチャします。画像取得後、すべての画像を保存します。また、複数のタイルが取得された場合は、モザイク結合ツールを実行してタイルを 1 つの画像にマージします。卵母細胞のサイズを決定するには、画像を開き、スライスオプションを選択してZsスタック画像を開きます。[線]オプションと測定パネルを選択し、卵母細胞またはマーカーの一方のエッジから最も広い点で他方のエッジまで線を引いて距離を測定し、卵母細胞のX Y直径を決定します。スタック内を移動し、同じタイプの複数の卵母細胞の直径の範囲を取得します。卵母細胞数のサイズ選択基準として最短の長さを使用します。次に、3D ビューオプションで、スポットフィーチャーを選択します。シーンパネルで、新しいスポットの追加機能を有効にして、アルゴリズムパネルを開きます。次に、先に取得した卵母細胞サイズを持つサイズ選択フィルタとしてすべてのアルゴリズム設定の選択を解除します。チャンネルの順方向矢印をクリックして、ソースチャンネルに移動します。次に、優先マーカーを持つチャンネルを選択し、推定X、Y直径に取得した直径を入力します。サイズ選択後、自動的に決定されるモデルPSFの伸びとバックグラウンド減算をアクティブにします。次に、単一の進む矢印を選択してフィルタースポットパネルに移動し、品質フィルターを追加してしきい値を決定します。卵母細胞数の正確な推定を確実にするために、画像を拡大する。後で、二重矢印をクリックして自動カウントを終了します。[編集]タブを使用して、欠落した卵母細胞を手動で選択するか、自動しきい値で選択した非卵母細胞粒子の選択を解除します。完了したら、さらに分析するために、全体タブの下の [統計] タブにデータを記録します。総卵母細胞数および損傷した卵巣を推定するには、MRSで無傷の卵巣の画像を開き、フレーム特徴を選択する。フレーム設定で、ボックスグリッドのチェックボックスとアクセスラベルを選択します。「XYZ」位置タブで「200 マイクロム」を選択して、すべての XYZ 位置に 200 マイクロメートルのスペースを持つ目盛りを生成します。200マイクロメートルの目盛りを使用して、各卵巣の体積の50%以内に収まる卵母細胞を選択します。斑点特徴をクリックし、編集ラベルを選択して、50%領域内にある卵母細胞を色で分類します。代表的なグレースケールでは、非灌流および灌流卵巣の多光子画像において、細胞質DDX4染色の薄層を有する原始卵胞中の小さな卵母細胞が見られた。さらに、成長している卵胞内のより大きな卵母細胞が発見された。出生前卵巣と出生後の卵巣の多光子画像からの3Dレンダリングが研究された。生後28日目において、対照非照射雌由来の卵巣は、原始卵胞内に小さな卵母細胞の大きな集団を含んでいた。対照的に、0.5グレイのガンマ線を照射された雌からの卵巣は、初代卵胞に小さな卵母細胞を完全に欠いていた。しかし、より大きな卵母細胞はまだ存在していた。卵母細胞の定量化のために、3Dマルチフォトン画像をグーシアンフィルターを使用してMRSソフトウェアで処理し、スポット特徴を使用して大小サイズの卵母細胞を同定および定量化した。次に、卵母細胞の平均百分率を、E15.5とE18.5の間で急激に減少した最初期ステージに存在する平均数と比較して各ステージで算出したE15.5およびE18.5胎児卵母細胞は、多光子画像に見られるようにライン1または1Pを発現した。強度分析では、E15.5よりもE18.5における卵母細胞当たりのライン1またはf1Pのより高い発現を示した。損傷の少ない卵巣を解析に使用することができます。総卵母細胞数は、計算補正を用いて決定される。代表的なモデルは、E 15.5卵巣におけるG CNA陽性卵母細胞を示し、5つの10%領域が無傷の卵巣において強調表示されている。同様に、卵巣の50%まで欠落している10%増分領域を有するシミュレートされた卵巣が生成された。総卵母細胞数およびシミュレートされた卵巣を、元の無傷の卵巣と比較した。そしてその差は、良好な灌流が良好な画質をもたらす偏差パーセントとして提示した。したがって、PFAに切り替える前に、すべての組織がPBSでクリアされていることを確認してください。余分な組織をトリミングして卵巣が完全に露出していることを確認してください。このプロトコルは、多数のサンプルの効率的な分析を可能にし、協調交配または多様性出力などの遺伝的参照集団から得られた定量データは、卵母細胞発生および卵母細胞数の遺伝子修飾因子の同定に役立つであろう。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

文化と共培養マウスの卵巣と卵胞

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

の胚性血管新生の可視化と定量分析<em&gt;ツメガエル</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

「マウス卵巣における現象を可視化する卵巣の組織培養

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...