Name: whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse at JoVE.com

이 작업은 국립 보건원 보조금 (R01 HD093778에서 E.B-F로, T32 HD007065에서 R.B로)에 의해 지원되었습니다. 방사선 실험에 도움을 주신 Zachary Boucher에게 감사드립니다. 우리는 원고를 비판적으로 읽은 Mary Ann Handel에게 감사드립니다. 우리는 Sonia Erattupuzha와 Jackson Laboratory의 Microscopy Core Service가 본 간행물에 설명 된 현미경 검사에 대한 전문가의 도움과 잭슨 연구소의 과학 기기 서비스 (Scientific Instrument Services)의 Jarek Trapszo가 3D 인쇄 어댑터 슬라이드를 설계한 것에 대해 감사하게 생각합니다.

사용된 모든 마우스는 C57BL/6J 유전자 균주 중 하나였다( 표 참조). 이 균주는 완전히 서열화되었으며 난소 구조와 기능에 대한 많은 연구의 표준입니다. 마우스는 NIH 지침에 따라 수용되었으며, 수행 된 절차는 잭슨 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용된 시약 및 조성물은 각각 표 및 표 1에 열거되어 있다.
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이 기사에서는 생식 세포 정량화 및 단백질 국소화에 대한 높은 처리량 및 비교 연구를 위해 산전 및 산후 난소에 대한 상세한 3D 면역 염색 및 이미징 프로토콜을 제시합니다. 우리는 10-16 개의 다른 균주에서 6 개의 발달 시점에서 난소 (N = 6-12)의 난자 수를 분석하기 위해이 프로토콜을 개발했으며, 2-4 개의 24 웰 플레이트는 일반적으로 한 번에 처리됩니다. 이 방법은 다른 기관 또는 세포 마커에 ?...

대부분의 포유류 암컷은 원시적 난포 내에 저장된 유한한 수의 meiotically arrested 난모세포로 태어나 난소 예비군 (OR)1,2를 구성합니다. OR은 전체 여성의 생식 수명과 건강을 결정합니다3. OR은 일반적으로 노화와 함께 크기가 감소하고 특정 유전 독성제 (방사선 / 화학 요법) 및 환경 스트레스 (영양 실조)에 노출되면 조기에 고갈 될 수 있으며 불임 4,5,6으로 이어질 수 있습니다. 특발성 여성 불임은 종종 OR에서 발생하는 난자의 유전 적 및 생리적 품질에 기인 할 수 있으며 잘 이해되지 않는 상태로 남아 있습니다 7,8. 여성 여포 기부는 출생에 의해 크게 미리 결정되기 때문에 OR 설립 및 유지 보수와 관련된 규제 메커니즘을 이해하는 것이 필수적입니다.
마우스에서, OR 형성은 배아일(E) 7.52 주위의 원발생식세포(PGCs)의 사양으로 시작한다. PGC는 생식기 능선으로 이동하여 약 E10.59에 거주합니다. 다음과 같은 광범위한 증식은 불완전한 사이토 카인 (cytokinesis)으로 발생하여 나중에 발달10,11에서 분해 될 낭종의 형성을 초래합니다. 대략 E12.5에서, 생식선 성관계가 결정되고, PGC 증식은 난소에서 정지된다. 암컷에서, 현재 난모세포인 PGCs는 대략 E13.512,13에서 meiotic prophase I (MPI)에 들어간다. 난모세포는 연장 된 MPI를 통해 진행되며 출생 시점 주변의 지시 단계에서 체포됩니다. 출생 후 첫 주 동안, 체포 된 각 난모세포는 과립 세포에 둘러싸여있어 원시적 인 여포를 형성합니다.
여성의 OR에서 원시적 인 여포의 수는 아폽토시스, 자가포식 또는 괴사를 통해 MPI 체포 전과 중에 발생하는 난모세포 제거의 파동에서 얼마나 많은 난모세포가 살아남 았는지에 달려 있습니다14,15. 첫 번째 파동은 태아 발달 중에 발생하며 FOA로 알려져 있습니다. FOA는 암컷 (포유류 및 비 포유류)에서 진화적으로 보존 된 과정으로, 여성 종 16,17,18,19에 따라 난모세포의 약 50-80 %가 제거됩니다. 마우스에서, FOA는 E15.5 내지 E18.5 동안 발생하며, 난모세포 사멸을 야기하는 레트로트랜스포존 LINE-1 서열의 재활성화 및 발현에 기인한다20,21. 난모세포 제거의 두 번째 파동은 복구되지 않은 DNA 이중 가닥 파단 (DSBs)22,23과 같은 meiotic 결함이있는 난모세포를 제거하는 meiotic 체크 포인트를 통해 발생합니다. 난모세포 제거의 다음 파동은 낭종 붕괴 중에 발생하며, 원시적 인 난포가 형성되는 동안 절정에 달하며, 각각은 단일 난모세포10,11,24,25를 포함합니다.
생쥐에서, 원시적 인 여포 예비는 사춘기에 의해 크게 확립되며, 그 후에 원시적 인 여포가 규칙적인 생식주기 동안 성장을 위해 활성화됨에 따라 감소합니다. OR 크기는 개별 여성 및 마우스의 다른 유전 적 균주에 따라 다릅니다. 그러나, OR 크기의 유전적 조절은 잘 이해되지 않는다26,27,28,29. OR 조절에 대한 유전 연구는 산전 및 산후 발달 동안 난모세포 제거의 파동을 연구하기위한 표준화 된 프로토콜의 부족으로 인해 방해받습니다. 몇몇 난모세포 정량화 방법론이 마우스에서 개발되었으며, 가장 보편적이고 널리 사용되는 것은 조직학적 절편30,31의 조직형태학적 평가이다. 이 기술에서, 난모세포는 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 및 주기적 산 쉬프 (PAS) 또는 형광 마커와 같은 조직 학적 얼룩이있는 연속 절편에서 확인됩니다. 이 기술은 단면 두께, 난소 전체의 모든 섹션의 효율적인 회복 및 개별 실험실의 계수 체계를 포함하여 모든 조건이 일정하게 유지되면 신뢰할 수 있습니다. 그러나 다른 실험실에서보고 된 숫자는 종종 크게 다르므로 쉽게 비교할 수 없습니다.
또한, 유전 적 차이를 감안할 때, 다른 마우스 균주의 사용은 또한 난모세포 수에 영향을 줄 수 있습니다. 조직 형태 평가를 위해 추가 전산 접근법이 개발되었으며 분별기 접근법을 사용한 난모세포의 자동 검출, 계산 알고리즘을 사용한 자동 계산 및 동일한 난모세포의 다중 카운트를 방지하기 위한 조직학적 이미지의 3D 재구성 31,32,33,34,35,36 . 이러한 개선이 조직 형태 측정법 평가에 추가되더라도이 기술은 특히 대규모 및 고처리량 연구의 경우 상대적으로 노동 집약적입니다. 수집 된 데이터는 계산 체계, 컴퓨터 알고리즘 및 사용 된 소프트웨어의 차이로 인해 연구 간에 재현 가능하고 비교할 수 없을 수 있습니다.
최근에, 새로운 중간 분해능 다중 광자 및 광 시트 현미경 및 광학 조직 제거 방법의 개발에 의해 가속화되고, 온전한 난소에 대한 3D 모델링 및 분석 기술은 난모세포 수를 효율적으로 정량화하고 단백질 국소화 및 역학을 연구하기 위한 선택의 방법이 되고 있다(37,38). 이러한 3D 방법은 일반적으로 조직 및 장기가 더 잘 보존되고 온전하게 유지되기 때문에 조직학적 방법에 비해 유리합니다. 또한 3D 분석 및 모델링은 2D 분석에서 놓칠 수있는 기관 내의 세포 틈새 또는 하위 구조 내와 세포 간의 기능 및 상호 작용에 대한 추가 통찰력을 제공합니다.
전체 장기의 3D 분석에는 조직 왜곡이나 손상 없이 난소와 같은 개별 장기에 대한 고정, 면역 염색 및 광학 클리어링 프로토콜의 최적화가 필요합니다. 이미징을 위한 샘플 마운팅의 추가적인 최적화는 고해상도 현미경 검사에 필요하며 사용 가능한 이미징 플랫폼에 따라 달라질 수 있습니다. 마지막으로, 전체 손상되지 않은 난소의 이미징은 후속 계산 분석을 위해 많은 양의 데이터를 생성합니다. 따라서 비교 연구 및 발달 단계에 걸쳐 난모세포를 계수하기위한 표준화 된 3D 방법을 개발할 필요가 있습니다.
이 프로토콜은 표준 면역 염색 및 이전에 보고된 클리어링 프로토콜을 사용하며, 단순하고 사용자 친화적이며 높은 처리량 접근법 38,39,40,41에 초점을 맞춥니다. 이 프로토콜은 산후 28 일 (P28)까지의 많은 수의 산전 및 산후 난소와 다양한 마우스 유전 적 배경의 다양한 크기의 난소를 분석하도록 최적화되어 있습니다. 면역염색 단계는 모든 단계에 대해 유사하고; 그러나 사춘기 난소의 경우 클리어링 프로토콜이 더 큰 크기 인 ScaleS4 (0) 및 소형 난소의 경우 CUVIC이 각각40,41 개로 인해 다릅니다. 또한, 전신 관류는 혈액 세포로부터의 자기 형광을 방지하기 위해 고정 전에 P28 마우스에서 수행된다. 다중 광자 현미경은 이미지를 얻기 위해 라이트 시트 현미경의 대안으로 라이카 DIVE/4Tune 플랫폼에 구축되었으며, 다양한 분석 도구를 갖춘 IMARIS 3D 시각화 및 분석 소프트웨어가 이 프로토콜을 위해 선택되었습니다. 이 프로토콜은 따르기 쉽고 실습이 적기 때문에 시간을 절약 할 수 있습니다. 또한, 난모세포 정량화는 난소의 크기와 난모세포의 배열에 따라 상대적으로 빠릅니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchtop Incubator</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H2200-H</td>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>mouse inbred strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1435</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastWells Reagent Barriers</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>664113</td>
			<td>Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21246</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21434</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Version 9.7.0</td>
			<td>Image visualization and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight X3</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight&#160;X3 Tunable Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Version 3.5.6</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406</td>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Pump Controller</td>
			<td>SPW Industrial</td>
			<td>Model: 7553-50</td>
			<td>Peristaltic pump for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14010-17</td>
			<td>5&#8221; &#8211;7&#8221; blunt/blunt scissors for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini BioMixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D1020</td>
			<td>shaker/nutator for 37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ergonomic SMZ1270</td>
			<td>Leica</td>
			<td>&#160;SMZ1270</td>
			<td>stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>Dissolve in Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ICN1670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DDX4/MVH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27591</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LINE-1 ORF1p</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab216324</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-TRA98/GCNA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82527</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tekmar Orbital Shaker</td>
			<td>Bimedis</td>
			<td>VXR-S10</td>
			<td>shaker for room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNOLOK Infusion Set</td>
			<td>MYCO Medical</td>
			<td>7001-23</td>
			<td>needles for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>97061-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120LED</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>S/N XT640-W-0147</td>
			<td>low-power LED fluorescence lamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse

여성의 생식력과 생식 수명은 난소 난모세포 예비의 질과 양에 달려 있습니다. meiotic prophase I에 들어가는 여성 생식 세포의 약 80 %는 태아 난모세포 감소 (FOA)와 산후 생후 첫 주 동안 제거됩니다. 세 가지 주요 메커니즘은 발달 중에 생존하는 난모세포의 수를 조절하고 사춘기에 들어가는 여성의 난소 예비를 확립합니다. 난모세포 손실의 첫 번째 파동에서, 난모세포의 30-50 %가 초기 FOA 동안 제거되며, 이는 높은 Long interspersed 핵 요소 -1 (LINE-1) 발현에 기인하는 현상입니다. 난모세포 손실의 두 번째 물결은 meiotic 품질 체크 포인트에 의해 meiotic 결함이있는 난모세포를 제거하는 것입니다. 난모세포 손실의 세 번째 파동은 일부 난모세포가 모낭을 형성하지 못할 때 원시적 인 난포 형성 중에 주산기적으로 발생합니다. 난모세포 손실의이 세 가지 파동 각각을 조절하는 것이 무엇인지, 그리고 그들이 쥐 나 인간에서 난소 예비를 어떻게 형성하는지는 분명하지 않습니다.
면역 형광 및 3D 시각화는 덜 유익한 2D 섹션보다는 전체 난소의 맥락에서 난모세포 발달을 이미지화하고 분석 할 수있는 새로운 길을 열었습니다. 이 기사에서는 전체 난소 면역 염색 및 광학 클리어링을위한 포괄적 인 프로토콜을 제공하여 다중 광자 현미경을 사용한 이미징 및 상용 소프트웨어를 사용한 3D 모델링 제제를 제공합니다. 이 방법을 사용하여 C57BL / 6J 마우스에서 난소 발달 중 난모세포 감소의 역학을 보여주고 난모세포 제거의 세 가지 파동 동안 난모세포 손실을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 난모세포 시각화 및 정량화뿐만 아니라 다른 정량적 접근법을 위해 산전 및 산후 산후 난소에 적용될 수 있습니다. 중요하게도, 이 프로토콜은 독성학, 임상 진단 및 난소 기능의 게놈 분석의 요구를 충족시킬 수 있는 높은 처리량, 신뢰성 및 반복 가능한 처리를 수용하기 위해 전략적으로 개발되었습니다.

전체 난소의 면역 염색 및 이미징은 동일한 기술 및 마커를 사용하여 다양한 발달 단계에서 난소에서 난모세포 또는 단백질 발현의 시각화 및 정량화를 가능하게합니다 (그림 3). 이 프로토콜은 여러 단계의 난소 분석과 여러 마우스 균주의 분석이 필요한 대규모 프로젝트를 위해 개발되었습니다. 여기에서는 유전자 분석을 위한 표준 균주인 C57BL6/J 균주에 대해 수집된 데이?...

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Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

여기에서는 전체 탑재 면역 염색, 다중 광자 현미경 검사, 3D 시각화 및 분석을 사용하여 정량적 및 정성적 분석을 위해 전체 난소를 이미징하는 데 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 독성학, 임상 진단 및 난소 기능의 게놈 분석에 적용 할 수있는 높은 처리량, 신뢰성 및 반복 가능한 처리를 수용합니다.

전체 난소 면역 형광, 클리어링 및 마우스에서 난소 예비의 정량적 3D 분석을위한 다중 광자 현미경 검사

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

이 방법은 생식 분야의 주요 질문 중 하나, 즉 유전자 조절 과정이 여성에게 영향을 미치는 난소 보호 구역의 크기에 어떻게 그리고 언제 영향을 미치는지, 생식 수명에 대한 답변을 도울 수 있습니다.이 프로토콜은 다른 발달 단계의 온전한 난소에 대해 동일한 기술을 사용하여 대규모 연구에 채택 될 수 있습니다. 그것은 생식 세포의 효율적인 정량화를 제공함으로써 생산 가능한 데이터를 생성합니다. 동일한 종의 유전적으로 다양한 동물에 적용된이 방법은 생식 세포 및 난소 발달 및 기타 개발 기관에 직접 유전 적 요인에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 인턴 인 Nathaniel Boechat이 될 것입니다 증식 단계 장소로 시작하여 마취 된 사춘기 여성 마우스를 뒤쪽에 고정시켜 발 패드를 통해 모든 다리를 부드럽게 보드에 고정시킵니다. 마우스의 흉강을 열려면 견갑골 바로 아래의 흉골 양쪽에있는 갈비뼈를 조심스럽게 자르고 폐에 구멍을 뚫지 말고 포셉으로 피부나 갈비뼈 플랩을 잡고 플랩을 고정하여 내부 장기를 노출시킵니다 해부 가위를 사용하여 심장의 오른쪽 심방을 자르고 시스템에서 혈액을 방출하십시오. 그런 다음 포셉으로 심장을 잡고 관류 바늘을 좌심실에 넣고 부드럽고 일정한 압력으로 PBS 10 밀리리터를 펌핑하십시오.간 신장 및 생식관과 같은 조직이 분홍색에서 흰색으로 변하면 PBS를 갓 만든 1 % 파라 포름 알데히드 또는 PFA로 교체하고 약 10 밀리리터의 PFA로 관류를 계속하십시오. 다음으로 신장 아래의 난소가있는 지방 패드를 찾아 지방 패드 난소와 자궁 뿔을 포함한 전체 생식관을 부드럽게 해부하여 4 % PFA가있는 바이알에 넣으십시오. 4 % PFA를 70 % 에탄올로 교체하기 전에 난소를 실온에서 16 ~ 24 시간 동안 고정하십시오.염색 당일에 면역 염색을 진행하기 전에 난소를 다듬는다. 면역염색 프로토콜의 첫째 날에 웰 당 PBS의 밀리리터 하나를 깨끗한 24 웰 플레이트 내의 원하는 수의 웰에 피펫팅한다. 1000 마이크로리터 피펫 팁의 팁을 잘라 넓은 개구부를 만들고 넓은 팁을 사용하여 70 % 에탄올을 함유 한 바이알에서 사춘기 난소를 웰스로 부드럽게 옮긴 다음 우물의 PBS를 신선한 0.8 밀리리터의 PBS로 교체하십시오 다음날 웰에서 PBS를 흡인하여 웰 당 0.8 밀리리터의 투과 버퍼로 교체하십시오.플레이트를 실온에서 네 시간 동안 진탕기 상에서 인큐베이션한 후 투과 완충액을 블로킹 완충액으로 교체한 후, 셋째 날에, 블로킹 완충액에 희석하여 일차 항체를 준비한다. 난모세포를 시각화하기 위해 난모세포 마커와 함께 산전 및 전즙 난소를 배양한다. 여덟 번째 날에 샘플을 두 시간 동안 신선한 세척 완충액으로 세척한 다음, 세척 완충액을 블로킹 완충액에 희석된 0.5 밀리리터의 이차 항체 혼합물로 교체한다.증발을 방지하기 위해 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 샘플을 어둠 속에서 실온에서 사흘 동안 인큐베이션한다. 면역염색 세척 후 11일째에, 세척 완충액을 흡인하고, 샘플을 암흑 속에서 3일 동안 섭씨 37도에서 0.8 밀리리터의 스케일 입방 용액으로 인큐베이션한다. 스케일 입방 한 용액을 매일 바꿉니다.15일째에, 샘플을 10분 동안 세 번 세척하고, 실온에서 0.8 밀리리터의 PBS를 부드럽게 진탕하면서 세척한다. 이어서, PBS를 PBS로 교체하고 갓 제조된 탈기된 20%sucrose의 0.8 밀리리터를 PBS로 교체한 다음, 실온에서 부드럽게 진탕시켰다. 한 시간 후 20 % sucrose 용액을 교체하여 앞에서 설명한 것처럼 0.8 밀리리터의 스케일 입방 두 용액으로 샘플을 4 ~ 5 일 동안 처리하십시오.샘플 셋업을 준비하려면, 팁 컷오프와 함께 200 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 15 내지 20 마이크로리터의 스케일 입방 2 용액으로 사춘기 난소를 접착제 웰의 중간으로 옮깁니다. 난소가 클리어링 용액 한 방울로 개별 웰로 옮겨지면 접착제 웰에 커버 글라스를 부드럽게 놓고 프레스하여 두 개의 커버 슬립 사이에 샘플을 샌드위치하고 용액을 클리어링하는 씰을 만듭니다. 이미징 장소의 경우, 커버 슬립 샌드위치를 3D 프린팅된 현미경 어댑터 슬라이드에 넣습니다.현미경 코어 또는 제조업체의 사양에 따라 이미지 수집을 위한 파라미터를 설정합니다. 사용 가능한 경우 양방향 이미지 수집을 사용하여 스캐닝 시간을 줄이고 효율성을 향상시킵니다. 소프트웨어에서 라인 평균, 프레임 평균 및 프레임 누적을 조정하십시오.시작과 끝 위치를 식별하여 Z 스택을 설정 한 다음 사춘기 난소의 경우 두 마이크로 미터의 Z 단계 크기를 선택하고 사춘기 난소의 경우 다섯 마이크로 미터를 선택하십시오. 그런 다음 Z 보정 기능과 여기 게인을 활성화하십시오. 두 가지 모두에 대해 레이저 강도를 선택하여 샘플의 아래쪽과 위쪽에 대한 Z 보정을 설정합니다.단일 시야각에서 캡처할 수 없는 더 큰 샘플의 경우 바둑판식 모드를 사용합니다. 이미지 네비게이터를 활성화하고 직사각형 표시 도구를 사용하여 전체 샘플을 캡처하는 데 필요한 타일 수를 표시합니다. 설정이 완료되면 여러 타일이있는 이미지의 이미지 수집부터 시작하여 네비게이터로 이미지 수집을 시작하여 모든 타일을 캡처하십시오.이미지 수집 후 모든 이미지를 저장합니다. 여러 타일을 획득한 경우 모자이크 병합 도구를 실행하여 타일을 단일 이미지로 병합합니다. 난모세포의 크기를 결정하려면 이미지를 열고 슬라이스 옵션을 선택하여 Zs 스택 이미지를 엽니다.선 옵션과 측정 패널을 선택하고 난모세포 또는 마커의 한쪽 가장자리에서 가장 넓은 지점에서 다른 가장자리까지 선을 그려 거리를 측정하여 난모세포의 X Y 직경을 결정합니다. 스택을 통해 이동하고 동일한 유형의 여러 난모세포에 대한 직경 범위를 구하십시오. 난모세포의 크기 선택 기준이 계산됨에 따라 가장 짧은 길이를 사용하십시오.그런 다음 3D 보기 옵션에서 스팟 피쳐를 선택합니다. 장면 패널에서 새 스팟 추가 기능을 활성화하여 알고리즘 패널을 엽니다. 그런 다음 이전에 얻은 난모세포 크기를 가진 크기 선택 필터로 모든 알고리즘 설정을 선택 취소하십시오.채널 앞으로 화살표를 클릭하여 소스 채널로 이동합니다. 그런 다음 선호하는 마커가있는 채널을 선택하고 추정 된 X, Y 직경에 획득 된 직경을 입력하십시오. 크기 선택 후 모델 PSF 신장 및 배경 뺄셈을 활성화하여 자동으로 결정됩니다.그런 다음 단일 앞으로 화살표를 선택하여 필터 스팟 패널로 이동하고 품질 필터를 추가하여 임계값을 결정합니다. 난모세포 수의 정확한 추정을 보장하기 위해 이미지를 확대한다. 나중에 이중 화살표를 클릭하여 자동 카운트를 완료합니다.편집 탭을 사용하여 놓친 난모세포를 수동으로 선택하거나 자동 임계값으로 선택한 비난모세포 입자를 선택 취소합니다. 완료되면 추가 분석을 위해 전체 탭 아래의 통계 탭에 데이터를 기록합니다. 총 난모세포 수와 손상된 난소를 추정하려면 MRS로 손상되지 않은 난소의 이미지를 열고 프레임 특징을 선택하십시오.프레임 설정에서 상자 격자 눈금 표시를 선택하고 레이블에 액세스합니다. 위치 XYZ 탭에서 200마이크로미터를 선택하여 모든 XYZ 위치에 200마이크로미터 공간이 있는 눈금 표시를 생성합니다. 200 마이크로 미터 틱 마크를 사용하여 각 난소 부피의 50 % 이내에있는 난모세포를 선택하십시오.반점 특징을 클릭하고 편집 라벨을 선택하여 50 % 영역에 속하는 난모세포를 색상으로 분류하십시오. 비관류 및 관류 난소의 대표적인 회색조, 다중 광자 이미지에서, 세포질 DDX4 염색의 얇은 층과 함께 원시성 난포에 있는 작은 난모세포가 보여질 수 있었다. 또한, 성장하는 난포 내에서 더 큰 난모세포가 발견되었습니다.산전 및 산후 난소의 다중 광자 이미지로부터의 3D 렌더링이 연구되었다. 출생 후 28일째에, 대조군 비조사된 여성으로부터의 난소는 원시적 난포에 작은 난모세포의 큰 집단을 함유하였다. 대조적으로, 감마 방사선의 0.5 회색을 가진 조사 된 암컷으로부터의 난소는 원발성 난포에 작은 난모세포가 전혀 결여되어 있었다.그러나 더 큰 난모세포는 여전히 존재했다. 난모세포의 정량화를 위해, 3D 다중 광자 이미지를 구시안 필터를 사용하여 MRS 소프트웨어에서 처리하고 작고 큰 크기의 난모세포를 스팟 특징을 사용하여 식별하고 정량화했습니다. 다음으로, 난모세포의 평균 백분율은 다중 광자 이미지에서 볼 수 있는 바와 같이 E15.5 및 E 18.5 사이에서 급격히 감소한 E 15.5 및 E 18.5 태아 난모세포 발현 라인일 orf일 P에 존재하는 평균 수와 비교하여 각 단계에서 계산되었다.강도 분석은 E 15.5보다 E 18.5에서 난모세포 당 하나의 orf 1P의 선 1의 더 높은 발현을 나타냈다. 작은 손상이있는 난소는 분석에 사용할 수 있습니다. 총 난모세포 수는 계산 보정을 사용하여 결정됩니다.대표적인 모델은 E15.5 난소에서 G CNA 양성 난모세포를 나타내며 무손상 난소에서 강조 표시된 5 개의 10 % 영역을 가지고 있습니다. 유사하게, 난소의 최대 50%까지 누락된 10% 증분 영역을 갖는 시뮬레이션된 난소가 생성되었다. 총 난모세포 수 및 시뮬레이션된 난소를 원래의 온전한 난소와 비교하였다.그리고 그 차이는 퍼센트 편차로 제시되었다 좋은 관류 결과는 좋은 화질에서 결과이다. 따라서 PFA로 전환하기 전에 PBS로 모든 조직을 제거해야합니다. 여분의 조직을 트리밍하여 난소가 완전히 노출되었는지 확인하십시오.이 프로토콜은 많은 수의 샘플의 효율적인 분석을 허용하며, 협업 교차 또는 다양성 출력과 같은 유전 참조 집단으로부터 얻은 정량적 데이터는 난모세포 발달 및 난모세포 수의 유전 적 변형자를 식별하는 데 도움이 될 것입니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

문화 공동 문화 마우스의 난소와 난소

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

연구

발생학

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

오르간 문화와 마우스 Wolffian 덕트의 전체 마운트 면역 형광 염색법

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

전체-마운트 고 애기 꽃 기관 및 Siliques의 얼룩

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

난소 조직 문화 현상을 마우스 난소에서 시각화 하

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...