Name: whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grants (R01 HD093778 til E.B-F og T32 HD007065 til R.B). Vi takker Zachary Boucher for hans hjelp med strålingseksperiment. Vi takker Mary Ann Handel for kritisk lesning av manuskriptet. Vi anerkjenner takknemlig bidraget fra Sonia Erattupuzha og Microscopy Core Service ved Jackson Laboratory for eksperthjelp med mikroskopiarbeidet beskrevet i denne publikasjonen og Jarek Trapszo fra Scientific Instrument Services ved Jackson Laboratory for å designe det 3D-trykte adapterlyset.

Alle musene som ble brukt var av den genetiske stammen C57BL/6J (se materialtabellen). Denne stammen har blitt fullstendig sekvensert og er standard for mange studier på eggstokkstruktur og funksjon. Mus ble plassert i henhold til NIH-retningslinjer, og prosedyrer utført ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of The Jackson Laboratory. Reagenser og komposisjoner som brukes i denne protokollen er oppført i henholdsvis Tabell over materialer og Tabell 1</str...

Denne artikkelen presenterer en detaljert 3D-immuniserings- og bildeprotokoll for prenatal og postnatal eggstokkene for høy gjennomstrømning og komparative studier for kvantifisering av bakterieceller og proteinlokalisering. Vi utviklet denne protokollen for å analysere oocytttall i eggstokkene (N = 6-12) på seks utviklingstidspunkter i 10-16 forskjellige stammer, hvor 2-4 24-brønnsplater vanligvis behandles på en gang. Denne metoden kan tilpasses andre organer eller cellulære markører. For eksempel kan denne pro...

De fleste pattedyrhunner er født med et begrenset antall meiotisk arresterte oocytter lagret i primordiale follikler, som utgjør eggstokkreservatet (OR) 1,2. OR bestemmer den generelle kvinnelige reproduktive levetiden og helsen3. OR avtar normalt i størrelse med aldring og kan for tidlig utarmes ved eksponering for visse gentoksiske midler (stråling / kjemoterapi) og miljøspenninger (underernæring), noe som fører til ufruktbarhet 4,5,6. Idiopatisk kvinnelig infertilitet kan ofte tilskrives den genetiske og fysiologiske kvaliteten på egg som utvikler seg fra OR og forblir dårlig forstått 7,8. Fordi kvinnelig follikkelbegavelse i stor grad er forhåndsbestemt ved fødselen, er det viktig å forstå reguleringsmekanismene som er involvert i OR-etableringen og vedlikeholdet.
Hos mus starter OR-formasjonen med spesifikasjonen av primordiale bakterieceller (PGCer) rundt embryonal dag (E) 7,52. PGC-ene migrerer til kjønnsryggene, hvor de vil ligge ved ca. E10,59. Følgende omfattende spredning skjer med ufullstendig cytokinesis som resulterer i dannelse av cyster som vil bli brutt ned senere i utviklingen10,11. På ca E12.5 bestemmes gonadalsex, og PGC-spredning stopper i eggstokkene. Hos kvinner går PGCer, nå oocytter, inn i meiotisk profase I (MPI) på omtrent E13,512,13. Oocytter utvikler seg gjennom utvidet MPI og arrestasjon på dictyate scenen rundt fødselstidspunktet. I løpet av den første uken etter fødselen er hver arresterte oocytt omgitt av granulosa-celler, og danner dermed en primordial follikkel.
Antallet primordiale follikler i OR av en kvinne avhenger av hvor mange oocytter som overlevde bølgene av oocytt eliminering som oppstår før og under MPI-arrestasjon gjennom apoptose, autofagi eller nekrose14,15. Den første bølgen oppstår under fosterutvikling og er kjent som FOA. FOA er en evolusjonært bevart prosess hos kvinner (pattedyr og ikke-pattedyr), hvorved anslagsvis 50-80% av oocyttene elimineres avhengig av den kvinnelige arten 16,17,18,19. Hos mus oppstår FOA under E15,5 til E18,5 og har blitt tilskrevet reaktivering og uttrykk for retrotransposon LINE-1-sekvenser som forårsaker oocyttdød20,21. Den andre bølgen av oocytt eliminering skjer gjennom et meiotisk sjekkpunkt som eliminerer oocytter med meiotiske defekter som upred DNA double-strand breaks (DSBs)22,23. Den neste bølgen av oocytt eliminering skjer under cyste sammenbrudd, som kulminerer under dannelsen av primordiale follikler, som hver inneholder en enkelt oocytt 10,11,24,25.
Hos mus er det opprinnelige follikkelreservatet i stor grad etablert av puberteten, hvorpå det avtar når primordiale follikler aktiveres for vekst under vanlige reproduktive sykluser. OR-størrelsen varierer mellom individuelle kvinner og blant forskjellige genetiske stammer av mus; Likevel er den genetiske reguleringen av OR-størrelse ikke godt forstått 26,27,28,29. Genetiske studier av OR-regulering hindres av mangelen på standardiserte protokoller for å studere bølgene av oocytt eliminering under prenatal og postnatal utvikling. Flere oocytt kvantifiseringsmetoder er utviklet hos mus, med den vanligste og mest brukte er histomorfometrisk evaluering av histomorfometriske seksjoner30,31. I denne teknikken identifiseres oocytter på serielle seksjoner med histologiske flekker, som hematoksylin og eosin (H&E) og periodiske acid-Schiff (PAS) eller fluorescerende markører. Denne teknikken er pålitelig hvis alle forhold forblir konstante, inkludert seksjonstykkelse, effektiv gjenoppretting av alle seksjoner gjennom eggstokken, og telleordningene til individuelle laboratorier. Tall rapportert av forskjellige laboratorier varierer imidlertid ofte betydelig og er derfor ikke lett sammenlignbare.
Videre, gitt genetiske forskjeller, kan bruk av forskjellige musestammer også påvirke oocytttall. Ytterligere beregningsmetoder er utviklet for histomorfometrisk evaluering og inkluderer automatisert deteksjon av oocytter ved hjelp av fraksjonatortilnærming, automatisk telling ved hjelp av beregningsalgoritmer og 3D-rekonstruksjon av histologiske bilder for å forhindre flere tellinger av samme oocytt 31,32,33,34,35,36 . Selv med disse forbedringene lagt til histomorfometrisk evaluering, er teknikken relativt arbeidskrevende, spesielt for store og høygjennomstrømningsstudier. Dataene som samles inn, kan ikke reproduseres og sammenlignes mellom studier på grunn av forskjeller i telleordninger, dataalgoritmer og programvare som brukes.
Nylig, akselerert av utviklingen av nye medium-resolution multiphoton og lys ark mikroskopi og optisk vev clearing metoder, 3D modellering og analyse teknikker for intakt eggstokkene blir metoden for valg for effektivt å kvantifisere oocytt tall og studere protein lokalisering og dynamikk37,38. Disse 3D-metodene er vanligvis fordelaktige sammenlignet med histologiske metoder, da vev og organer er bedre bevart og holdt intakte. Videre gir 3D-analyse og modellering ytterligere innsikt i funksjon og interaksjoner i og mellom cellenisjer eller understrukturer i orgelet som kan gå glipp av i 2D-analyse.
3D-analyse av hele organer krever optimalisering av fiksering, immunstaining og optiske clearingprotokoller for individuelle organer, for eksempel eggstokkene, uten vevsforvrengning eller skade. Ytterligere optimalisering av prøvemontering for avbildning er nødvendig for mikroskopi med høy oppløsning og kan avhenge av hvilken bildeplattform som er tilgjengelig. Til slutt genererer avbildning av hele den intakte eggstokken en stor mengde data for etterfølgende beregningsanalyser. Derfor er det behov for å utvikle standardiserte 3D-metoder for å telle oocytter for komparative studier og på tvers av utviklingsstadier.
Denne protokollen bruker standard immunoppnåelse og tidligere rapporterte clearingprotokoller, med fokus på en enkel, brukervennlig og høy gjennomstrømningstilnærming 38,39,40,41. Protokollen er optimalisert for å analysere et stort antall prenatal og postnatal eggstokkene opp til postnatal dag 28 (P28) og varierende størrelser av eggstokkene fra forskjellige musen genetiske bakgrunner. Immunstainingstrinnene er like for alle stadier; Imidlertid varierer clearingprotokollene for pubertal eggstokkene på grunn av deres større størrelse, ScaleS4 (0) og CUBIC for små og store eggstokkene, henholdsvis40,41. Videre utføres perfusjon av hele kroppen hos P28-mus før fiksering for å forhindre autofluorescens fra blodceller. Et multifotonmikroskop ble bygget på Leica DIVE/4Tune-plattformen som et alternativ til lysarkmikroskopi for å skaffe bilder, og IMARIS 3D Visualization and Analysis-programvare med ulike analytiske verktøy ble valgt for denne protokollen. Denne protokollen er enkel å følge og mindre praktisk, og dermed tidsbesparende. Videre er oocytt kvantifisering relativt rask, avhengig av størrelsen på eggstokken og arrangementet av oocytter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchtop Incubator</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H2200-H</td>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>mouse inbred strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1435</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastWells Reagent Barriers</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>664113</td>
			<td>Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21246</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21434</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Version 9.7.0</td>
			<td>Image visualization and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight X3</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight&#160;X3 Tunable Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Version 3.5.6</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406</td>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Pump Controller</td>
			<td>SPW Industrial</td>
			<td>Model: 7553-50</td>
			<td>Peristaltic pump for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14010-17</td>
			<td>5&#8221; &#8211;7&#8221; blunt/blunt scissors for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini BioMixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D1020</td>
			<td>shaker/nutator for 37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ergonomic SMZ1270</td>
			<td>Leica</td>
			<td>&#160;SMZ1270</td>
			<td>stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>Dissolve in Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ICN1670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DDX4/MVH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27591</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LINE-1 ORF1p</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab216324</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-TRA98/GCNA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82527</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tekmar Orbital Shaker</td>
			<td>Bimedis</td>
			<td>VXR-S10</td>
			<td>shaker for room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNOLOK Infusion Set</td>
			<td>MYCO Medical</td>
			<td>7001-23</td>
			<td>needles for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>97061-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120LED</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>S/N XT640-W-0147</td>
			<td>low-power LED fluorescence lamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse

Kvinnelig fruktbarhet og reproduktiv levetid avhenger av kvaliteten og mengden av ovarie oocyttreservatet. Anslagsvis 80% av kvinnelige bakterieceller som kommer inn i meiotisk profase, blir jeg eliminert under Fetal Oocyte Attrition (FOA) og den første uken av barsellivet. Tre store mekanismer regulerer antall oocytter som overlever under utvikling og etablerer eggstokkreservatet hos kvinner som kommer inn i puberteten. I den første bølgen av oocytttap elimineres 30-50% av oocyttene under tidlig FOA, et fenomen som tilskrives høyt Langt ispedd kjernefysisk element-1 (LINE-1) uttrykk. Den andre bølgen av oocytttap er eliminering av oocytter med meiotiske feil ved et meiotisk kvalitetskontrollpunkt. Den tredje bølgen av oocytttap oppstår perinatalt under primordial follikkeldannelse når noen oocytter ikke klarer å danne follikler. Det er fortsatt uklart hva som regulerer hver av disse tre bølgene av oocytttap og hvordan de former eggstokkreservatet hos enten mus eller mennesker.
Immunfluorescens og 3D-visualisering har åpnet en ny vei for å avbilde og analysere oocyttutvikling i sammenheng med hele eggstokken i stedet for i mindre informative 2D-seksjoner. Denne artikkelen gir en omfattende protokoll for hel eggstokkimmunisering og optisk rydding, noe som gir preparater for avbildning ved hjelp av multifotonmikroskopi og 3D-modellering ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare. Den viser hvordan denne metoden kan brukes til å vise dynamikken i oocytt utmattelse under ovarial utvikling i C57BL / 6J mus og kvantifisere oocytt tap under de tre bølgene av oocytt eliminering. Denne protokollen kan brukes på prenatal og tidlig postnatal eggstokkene for oocytt visualisering og kvantifisering, samt andre kvantitative tilnærminger. Viktigst, protokollen ble strategisk utviklet for å imøtekomme høy gjennomstrømning, pålitelig og repeterbar behandling som kan møte behovene i toksikologi, klinisk diagnostikk og genomiske analyser av ovarialfunksjon.

Immunstaining og avbildning av hele eggstokken muliggjør visualisering og kvantifisering av oocytter eller proteinuttrykk i eggstokkene i ulike utviklingsstadier ved hjelp av samme teknikk og markører (figur 3). Denne protokollen ble utviklet for et stort prosjekt der analyse av eggstokkene på flere stadier og fra flere musestammer var nødvendig. Her presenterer vi data samlet inn for C57BL6/J-stammen, en standardstamme for genetisk analyse. Teknikken som presenteres her er grei, resulta...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse at JoVE.com

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Her presenterer vi en optimalisert protokoll for avbildning av hele eggstokkene for kvantitative og kvalitative analyser ved hjelp av helmontert immunstaining, multifotonmikroskopi og 3D-visualisering og analyse. Denne protokollen har plass til høy gjennomstrømning, pålitelig og repeterbar behandling som gjelder for toksikologi, klinisk diagnostikk og genomiske analyser av eggstokkfunksjonen.

Hel eggstokkimofluorescens, rydding og multifotonmikroskopi for kvantitativ 3D-analyse av det utviklende ovariereservatet i musen

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Denne metoden kan bidra til å svare på et av de viktigste spørsmålene i reproduktive feltet, nemlig hvordan og når genetisk regulerte prosesser påvirker størrelsen på eggstokkreservatet som vi vet påvirker kvinner, reproduktiv levetid Denne protokollen kan vedtas for storskalastudier ved hjelp av de samme teknikkene for intakte eggstokkene fra forskjellige utviklingsstadier. Det genererer produserbare data ved å gi en effektiv kvantifisering av bakterieceller. Denne metoden som brukes på genetisk forskjellige dyr av samme art, kan gi innsikt i de genetiske faktorene direkte bakteriecelle- og eggstokkutvikling og andre utviklingsorganer.Demonstrere prosedyren vil være Nathaniel Boechat, en forsknings praktikant fra mitt laboratorium For å starte med profusion trinn sted og sikre bedøvet pubertal kvinnelig mus på ryggen ved forsiktig å feste alle ben gjennom pote pads i en avslappet posisjon på et brett. For å åpne musens thoraxhule, kutt forsiktig ribbenene på begge sider av brystbenet like under scapulaen, unngå å punktere lungene griper huden eller ribbeklaffene med tangene og fester klaffene for å eksponere de indre organene, bruk disseksjonssaks for å klippe høyre atrium i hjertet og frigjøre blod fra systemet. Deretter setter du inn en perfusjonsnål i venstre ventrikel ved å holde hjertet med tang inn i venstre ventrikel og pumpe 10 milliliter PBS med et forsiktig og konstant trykk.Når vev som lever nyrer og reproduktive kanalen slått fra rosa til hvit erstatte PBS med nylaget 1% paraformaldehyd eller PFA og fortsette perfusjon med ca 10 milliliter PFA. Deretter finner du fettputen med eggstokkene under nyrene og forsiktig dissekerer hele reproduktive kanalen, inkludert fettputeovaries og livmorhorn for å plassere den i et hetteglass med 4% PFA. Fest eggstokkene ved romtemperatur i 16 til 24 timer før du bytter ut 4% PFA med 70% etanol.På dagen for farging trim eggstokkene før du fortsetter med immuno farging. På dag én av immunfargingsprotokollen pipette en milliliter PBS per brønn inn i ønsket antall brønner i en ren 24 brønnplate. Klipp av spissen av en pipettespiss på 1000 mikroliter for å lage en bred åpning og bruk den brede spissen til forsiktig å overføre pubertalovaries fra hetteglass med 70% etanol inn i brønnene, og erstatt deretter PBS i brønnen med friske 0,8 milliliter PBS Neste dag aspirerer PBS fra brønnene for å erstatte den med 0,8 milliliter permeasjonsbuffer per brønn.Etter inkubering av platene på shakeren ved romtemperatur i fire timer, bytt permeasjonsbufferen med blokkeringsbuffer På dag tre, forbered de primære antistoffene ved fortynning i blokkeringsbufferen. For å visualisere oocyttene inkubere prenatal og prepubertal eggstokkene med oocyttmarkørene. På dag åtte vasker prøvene med en fersk vaskebuffer i to timer, og erstatt deretter vaskebufferen med 0,5 milliliter av de sekundære antistoffblandingene fortynnet i en blokkeringsbuffer.Forsegle platen med en parafilm for å forhindre fordampning og inkubere prøvene ved romtemperatur i mørket i tre dager. På dag 11 etter immunoppfatningsvasken aspirerer du vaskebufferen og inkuberer prøvene med 0,8 milliliter av skalaen kubikk en løsning ved 37 grader Celsius i tre dager i mørket. Endre skalaen kubikk en løsning daglig.På dag 15, vask prøvene tre ganger i 10 minutter og 0,8 milliliter PBS ved romtemperatur med mild risting. Bytt deretter PBS med 0,8 milliliter av de nylagde avgassede 20% sukrose med PBS etterfulgt av skånsom risting ved romtemperatur. Etter en time erstatte 20%sukrose løsning for å behandle prøvene med 0,8 milliliter av skalaen kubikk to løsning i fire til fem dager, som forklart tidligere.For å forberede et prøveoppsett, bruk en 200 mikroliter pipettespiss med spissen avskåret for å overføre pubertal eggstokkene med 15 til 20 mikroliter skala kubikk to løsning inn i midten av limbrønnen. Når eggstokkene er overført til den enkelte brønn med en dråpe clearingløsning, legg forsiktig et dekselglass på limbrønnen og trykk for å lage en tetning som smører prøvene og ryddeløsningen mellom to dekselslipper. For bildebehandlingssted glir dekselsklien i en 3D-trykt mikroskopadapter.Definer parameterne for bildeanskaffelse i henhold til mikroskopikjernene eller produsentens spesifikasjoner. Hvis tilgjengelig, bruk den toveis bildeanskaffelsen for å redusere skannetiden og forbedre effektiviteten. Juster linjegjennomsnittet, rammegjennomsnittet og bildeakkumuleringen i programvaren.Sett opp Z-stabelen ved å identifisere begynnelsen og sluttposisjonen, og velg deretter en Z-trinnstørrelse på to mikrometer for prepubertale eggstokkene og fem mikrometer for pubertalovaries. Aktiver deretter Z-kompensasjonsfunksjonen og eksitasjonsgevinsten. Angi Z-kompensasjonen for bunnen og toppen av prøven ved å velge en laserintensitet for begge.Bruk flismodus for større prøver som ikke kan tas opp i ett enkelt synsfelt. Aktiver bildenavigatoren og angi antall fliser som trengs for å ta hele prøven med det rektangulære markeringsverktøyet. Når innstillingen er fullført, starter du med bildeanskaffelsen for bildene med flere fliser, og begynner bildeinnhentingen med navigatøren for å fange opp alle flisene.Etter bildeinnhentingen lagrer du alle bildene. Og hvis flere fliser ble anskaffet, kjører du det mosaikkfusjonerte verktøyet for å slå sammen flisene til ett enkelt bilde. Hvis du vil finne størrelsen på oocyttene, åpner du bildet og velger stykkealternativet for å åpne Zs-stakkbildet.Velg linjealternativet og målepanelet, og mål avstanden ved å tegne en linje fra den ene kanten av en oocytter eller markør til den andre kanten på det bredeste punktet for å bestemme X Y-diameteren på oocytten. Beveg deg gjennom stabelen og oppnå diameterområdet for flere oocytter av samme type. Bruk den korteste lengden som størrelsesvalgkriterium for antall oocytter.Velg deretter spots-funksjonen i 3D-visningsalternativet. I scenepanelet aktiverer du funksjonen legg til nye flekker for å åpne algoritmepanelet. Fjern deretter merket for alle algoritmeinnstillingene som størrelsesvalgfilter med oocytterstørrelsen oppnådd tidligere.Klikk på pilen for kanal fremover for å gå til kildekanalen. Velg deretter kanalen med den foretrukne markøren og skriv inn den oppkjøpte diameteren i estimert X, Y-diameter. Etter størrelsesvalget aktiveres modellen PSF forlengelse og bakgrunn subtraksjon som bestemmes automatisk.Velg deretter pilen for enkel fremover for å gå til filterflekker-panelet og legge til kvalitetsfilteret for å bestemme en terskel. For å sikre nøyaktig estimering av oocytter forstørrer tallene bildet. Senere klikker du på dobbeltpilen for å fullføre automatiserte tellinger.Bruk redigeringsfanen til å manuelt velge tapte oocytter eller fjerne merkingen av ikke-oocyttpartikler som er valgt av den automatiske terskelen. Når du er ferdig, registrerer du dataene i statistikkfanen under den generelle fanen for videre analyse. For å estimere de totale oocytttallene og de skadede eggstokkene, åpne bilder av de intakte eggstokkene med MRS og velg rammefunksjonen.Merk av for aksemerker i boksrutenettet under rammeinnstillingene, og få tilgang til etiketter. I kategorien XYZ velger du 200 mikrome for å generere aksemerker med 200 mikrometer mellomrom i alle XYZ-posisjoner. Bruk aksemerkene på 200 mikrometer til å velge oocytter som faller innenfor 50 % av volumet for hver eggstokk.Klikk på spots-funksjonen og velg redigeringsetikettene for å klassifisere oocyttene som faller innenfor 50% -regionen etter farge. I den representative gråtonen, multi foton bilder av de ikke perfused og perfused eggstokkene, de små oocytter i primordial follicles med det tynne laget av cytoplasmatiske DDX4 farging kunne sees. I tillegg ble de større oocyttene i de voksende folliklene oppdaget.3D-gjengivelsene fra de mange fotonbildene av prenatal og postnatal eggstokkene ble studert. På barseldagen 28 inneholdt eggstokken fra kontrollen ikke bestrålet kvinne en stor befolkning av små oocytter i de opprinnelige folliklene. I kontrast var eggstokkene fra den bestrålede kvinnen med 0,5 grå av gammastrålingen helt blottet for små oocytter i de primære folliklene.Men større oocytter var fortsatt til stede. For kvantifiseringen av oocyttene ble 3D-fotonbildene behandlet i MRS-programvaren ved hjelp av goucianfilteret, og oocyttene av små og store størrelser ble identifisert og kvantifisert ved hjelp av spotfunksjonen. Deretter ble den gjennomsnittlige prosentandelen av oocyttene beregnet på hvert trinn sammenlignet med gjennomsnittstallet som var tilstede på det tidligste stadiet E 15,5 oocytter, falt kraftig mellom E 15,5 og E 18,5 E 15,5 og E 18,5 fetal oocytter uttrykte linje en eller en P sett i multifotonbildene.Intensitetsanalysen viste høyere uttrykk for linje en orf en P per oocytter på E 18,5 enn E 15,5. Eggstokkene med liten skade kan brukes til analyse. Totalt antall oocytter bestemmes ved hjelp av beregningskorrigering.Den representative modellen viser G CNA positive oocytter i E 15.5 eggstokk med en fem 10% regioner uthevet i en intakt eggstokk. På samme måte ble en simulert eggstokk med 10% inkrementelle regioner som mangler opptil 50% av eggstokken generert. De totale oocyttene og de simulerte eggstokkene ble sammenlignet med de opprinnelige intakte eggstokkene.Og forskjellen ble presentert som prosentavviket God perfusjon resulterer i god bildekvalitet. Så sørg for at alle vev er ryddet med PBS før du bytter til PFA. Forsikre deg om at eggstokkene er helt utsatt ved å trimme bort det ekstra vevet.Protokollen tillater effektiv analyse av et stort antall prøver, kvantitative data hentet fra genetiske referansepopulasjoner som samarbeidskors eller mangfoldsproduksjon vil bidra til å identifisere genetiske modifikatorer av oocytter utvikling og oocytter tall.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Kultur og Co-Culture of Mouse Eggstokkene og ovariefollikler

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse av cardiomyocyte Development hjelp Immunfluorescens i Embryonic Mouse Hjerte

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Kultur og Whole Mount Immunofluorescensanalyse Farging av Muse Wolffian Kanaler

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse av embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Correlative super-oppløsning og elektronmikroskop løse Protein lokalisering i sebrafisk netthinnen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Hele-mount Clearing og flekker av Arabidopsis blomst organer og Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hele Mount Immunofluorescence og hårsekken kvantifisering av kultivert musen eggstokkene

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Ovarian vev kultur visualisere fenomener i musen eggstokk

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...