Name: whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00
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Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01 HD093778 para E.B-F e T32 HD007065 a R.B). Agradecemos zachary Boucher por sua ajuda com experimento de radiação. Agradecemos a Mary Ann Handel pela leitura crítica do manuscrito. Agradecemos a contribuição de Sonia Erattupuzha e do Serviço núcleo de microscopia do Laboratório Jackson para assistência especializada com o trabalho de microscopia descrito nesta publicação e Jarek Trapszo, do Scientific Instrument Services do Laboratório Jackson, para projetar o slide adaptador impresso em 3D.

Todos os camundongos utilizados foram da cepa genética C57BL/6J (ver a Tabela de Materiais). Esta cepa foi totalmente sequenciada e é padrão para muitos estudos sobre estrutura ovariana e função. Os camundongos foram alojados de acordo com as diretrizes do NIH, e os procedimentos realizados foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Laboratório Jackson. Os reagentes e composições utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais e <...

Este artigo apresenta um protocolo detalhado de imunostaining 3D e de imagem para ovários pré-natais e pós-natais para estudos de alta produtividade e comparativos para quantificação de células germinativas e localização de proteínas. Desenvolvemos este protocolo para analisar os números de oócitos em ovários (N=6-12) em seis pontos de tempo de desenvolvimento em 10-16 cepas diferentes, onde 2-4 placas de 24 poços são tipicamente processadas ao mesmo tempo. Este método pode ser adaptado para outros órgão...

A maioria das fêmeas de mamíferos nasce com um número finito de oócitos presos por meioticamente armazenados dentro de folículos primordiais, constituindo a reserva ovariana (OR)1,2. O BO determina a vida reprodutiva geral feminina e a saúde3. O OR normalmente diminui de tamanho com o envelhecimento e pode ser prematuramente esgotado após a exposição a certos agentes genotoxicos (radiação/quimioterapia) e estresses ambientais (desnutrição), levando à infertilidade 4,5,6. A infertilidade feminina idiopática pode muitas vezes ser atribuída à qualidade genética e fisiológica dos ovos que se desenvolvem a partir do BO e permanece mal compreendida 7,8. Como a dotação do folículo feminino é em grande parte predeterminada pelo nascimento, é essencial compreender os mecanismos regulatórios envolvidos no estabelecimento e manutenção do OR.
Em camundongos, a formação de OR começa com a especificação de células germinativas primordiais (PGCs) em torno do dia embrionário (E) 7,52. Os PGCs migram para os cumes genitais, onde residirão por aproximadamente E10,59. A proliferação extensiva a seguir ocorre com citocinas incompletas resultando na formação de cistos que serão quebrados mais tarde no desenvolvimento10,11. Aproximadamente E12,5, o sexo gonadal é determinado, e a proliferação de PGC para em ovários. No feminino, os PGCs, agora oócitos, entram em prophase I (MPI) em aproximadamente E13,512,13. Os ocitos progridem através de IPM estendido e prisão na fase de dictyate na época do nascimento. Durante a primeira semana após o nascimento, cada oócito preso é cercado por células de granulosa, formando assim um folículo primordial.
O número de folículos primordiais no OR de uma fêmea depende de quantas oócitos sobreviveram às ondas de eliminação de oócitos que ocorrem antes e durante a prisão do IMP por apoptose, autofagia ou necrose14,15. A primeira onda ocorre durante o desenvolvimento fetal e é conhecida como FOA. O FOA é um processo evolutivamente conservado em fêmeas (mamíferos e não-mamíferos), pelo qual cerca de 50-80% dos oócitos são eliminados dependendo da espécie feminina 16,17,18,19. Em camundongos, o FOA ocorre durante o E15.5 ao E18.5 e tem sido atribuído à reativação e expressão de sequências retrotransposon LINE-1 causando morte oócida20,21. A segunda onda de eliminação de oócitos ocorre através de um ponto de verificação meiotic que elimina oócitos com defeitos meioticos, como quebras de duplo fio de DNA não reparadas (DSBs)22,23. A próxima onda de eliminação de oócito ocorre durante a quebra do cisto, culminando durante a formação de folículos primordiais, cada um dos quais contém um único oócito 10,11,24,25.
Em camundongos, a reserva primordial do folículo é em grande parte estabelecida pela puberdade, após a qual diminui à medida que folículos primordiais são ativados para o crescimento durante ciclos reprodutivos regulares. O tamanho do OR varia entre as mulheres individuais e entre diferentes cepas genéticas de camundongos; ainda assim, a regulação genética do tamanho do OR não é bem compreendida 26,27,28,29. Estudos genéticos de regulação de OR são dificultados pela falta de protocolos padronizados para estudar as ondas de eliminação de oócitos durante o desenvolvimento pré-natal e pós-natal. Várias metodologias de quantificação oócito foram desenvolvidas em camundongos, sendo a mais comum e amplamente utilizada a avaliação histomorfométrica das seções histológicas30,31. Nesta técnica, os oócitos são identificados em seções seriais com manchas histológicas, como hematoxilina e eosina (H&E) e ácido periódico-Schiff (PAS) ou marcadores fluorescentes. Esta técnica é confiável se todas as condições permanecerem constantes, incluindo espessura de seção, recuperação eficiente de todas as seções ao longo do ovário e os esquemas de contagem de laboratórios individuais. No entanto, os números relatados por diferentes laboratórios muitas vezes diferem significativamente e, portanto, não são facilmente comparáveis.
Além disso, dadas as diferenças genéticas, o uso de diferentes cepas de camundongos também pode influenciar a contagem de oócitos. Abordagens computacionais adicionais foram desenvolvidas para avaliação histomorfométrica e incluem a detecção automatizada de oócitos usando a abordagem fracionado, contagem automática usando algoritmos computacionais e reconstrução 3D de imagens histológicas para evitar múltiplas contagens do mesmo oócito 31,32,33,34, 35,36 . Mesmo com essas melhorias adicionadas à avaliação histomorfométrica, a técnica é relativamente intensiva em mão-de-obra, particularmente para estudos de grande escala e de alto rendimento. Os dados coletados podem não ser reprodutíveis e comparáveis entre estudos devido a diferenças nos esquemas de contagem, algoritmos de computador e software utilizado.
Recentemente, acelerado pelo desenvolvimento de novos métodos de microscopia multifotônio de média resolução e folha de luz e métodos de limpeza de tecidos ópticos, técnicas de modelagem e análise 3D para ovários intactos estão se tornando o método de escolha para quantificar eficientemente os números de oócitos e estudar a localização e dinâmica de proteínas37,38. Esses métodos 3D são tipicamente vantajosos em comparação com métodos histológicos, pois tecidos e órgãos são melhor preservados e mantidos intactos. Além disso, a análise e modelagem 3D fornecem insights adicionais sobre a função e interações dentro e entre nichos celulares ou subestruturas dentro do órgão que podem ser perdidas na análise 2D.
A análise 3D de órgãos inteiros requer otimização de protocolos de fixação, imunostação e limpeza óptica para órgãos individuais, como ovários, sem distorção tecidual ou danos. Uma otimização adicional da montagem da amostra para imagens é necessária para microscopia de alta resolução e pode depender da plataforma de imagem disponível. Finalmente, a imagem de todo o ovário intacto gera uma grande quantidade de dados para análises computacionais subsequentes. Portanto, é necessário desenvolver métodos 3D padronizados para contagem de oócitos para estudos comparativos e em estágios de desenvolvimento.
Este protocolo usa protocolos de limpeza padrão e previamente relatados, com foco em uma abordagem simples, fácil de usar e de alto rendimento 38,39,40,41. O protocolo é otimizado para analisar um grande número de ovários pré-natal e pós-natal até o pós-natal 28 (P28) e tamanhos variados de ovários de diferentes origens genéticas de camundongos. As etapas de imunossuagem são semelhantes para todas as etapas; no entanto, os protocolos de compensação diferem para ovários pubertal devido ao seu tamanho maior, ScaleS4(0) e CUBIC para ovários pequenos e grandes, respectivamente40,41. Além disso, a perfusão do corpo inteiro é realizada em camundongos P28 antes da fixação para evitar a autofluorescência das células sanguíneas. Um microscópio multifotográfico foi construído sobre a plataforma Leica DIVE/4Tune como alternativa à microscopia de folha de luz para adquirir imagens, e foi escolhido um software de Visualização e Análise 3D IMARIS com várias ferramentas analíticas para este protocolo. Este protocolo é simples de seguir e menos prático, portanto economizando tempo. Além disso, a quantificação do oócito é relativamente rápida, dependendo do tamanho do ovário e arranjo de oócitos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchtop Incubator</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H2200-H</td>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>mouse inbred strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1435</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastWells Reagent Barriers</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>664113</td>
			<td>Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21246</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21434</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Version 9.7.0</td>
			<td>Image visualization and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight X3</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight&#160;X3 Tunable Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Version 3.5.6</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406</td>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Pump Controller</td>
			<td>SPW Industrial</td>
			<td>Model: 7553-50</td>
			<td>Peristaltic pump for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14010-17</td>
			<td>5&#8221; &#8211;7&#8221; blunt/blunt scissors for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini BioMixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D1020</td>
			<td>shaker/nutator for 37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ergonomic SMZ1270</td>
			<td>Leica</td>
			<td>&#160;SMZ1270</td>
			<td>stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>Dissolve in Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ICN1670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DDX4/MVH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27591</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LINE-1 ORF1p</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab216324</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-TRA98/GCNA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82527</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tekmar Orbital Shaker</td>
			<td>Bimedis</td>
			<td>VXR-S10</td>
			<td>shaker for room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNOLOK Infusion Set</td>
			<td>MYCO Medical</td>
			<td>7001-23</td>
			<td>needles for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>97061-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120LED</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>S/N XT640-W-0147</td>
			<td>low-power LED fluorescence lamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse

A fertilidade feminina e a vida útil reprodutiva dependem da qualidade e quantidade da reserva de oócito ovariano. Estima-se que 80% das células germinativas femininas que entram em prophase meiotic I são eliminadas durante o Atrito de Oócito Fetal (FOA) e a primeira semana de vida pós-natal. Três mecanismos principais regulam o número de oócitos que sobrevivem durante o desenvolvimento e estabelecem a reserva ovariana em fêmeas que entram na puberdade. Na primeira onda de perda de oócitos, 30-50% dos oócitos são eliminados durante o FOA inicial, um fenômeno que é atribuído à alta expressão de elemento nuclear intercalado de comprimento -1 (LINE-1). A segunda onda de perda de oócito é a eliminação de oócitos com defeitos meioticos por um ponto de verificação de qualidade meiotic. A terceira onda de perda de oócito ocorre perinatalmente durante a formação de folículos primordiais quando alguns oócitos não conseguem formar folículos. Ainda não está claro o que regula cada uma dessas três ondas de perda de oócito e como elas moldam a reserva ovariana em camundongos ou humanos.
A imunofluorescência e a visualização 3D abriram um novo caminho para a imagem e análise do desenvolvimento de oócitos no contexto de todo o ovário, em vez de em seções 2D menos informativas. Este artigo fornece um protocolo abrangente para imunostaining de ovários inteiros e limpeza óptica, produzindo preparações para imagens usando microscopia multifotídea e modelagem 3D usando software comercialmente disponível. Ele mostra como este método pode ser usado para mostrar a dinâmica do atrito de oócito durante o desenvolvimento ovariano em camundongos C57BL/6J e quantificar a perda de oócito durante as três ondas de eliminação de oócitos. Este protocolo pode ser aplicado aos ovários pós-natal e pós-natal precoces para visualização e quantificação de oócitos, bem como outras abordagens quantitativas. É importante ressaltar que o protocolo foi estrategicamente desenvolvido para acomodar o processamento de alto rendimento, confiável e repetível que pode atender às necessidades em toxicologia, diagnóstico clínico e ensaios genômicos da função ovariana.

A imunostenção e a imagem de todo o ovário permitem a visualização e quantificação de oócitos ou expressão proteica em ovários em diferentes estágios de desenvolvimento usando a mesma técnica e marcadores (Figura 3). Este protocolo foi desenvolvido para um projeto em larga escala no qual era necessária a análise dos ovários em múltiplos estágios e a partir de múltiplas cepas de camundongos. Aqui, apresentamos dados coletados para a cepa C57BL6/J, uma cepa padrão para anál...

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Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para imagens de ovários inteiros para análises quantitativas e qualitativas utilizando imunosscopia de montagem integral, microscopia multifotínica e visualização e análise 3D. Este protocolo acomoda um processamento de alto rendimento, confiável e repetível que é aplicável para toxicologia, diagnóstico clínico e ensaios genômicos da função ovariana.

Imunofluorescência total do ovário, compensação e microscopia multifotínica para análise quantitativa 3D da reserva ovariana em desenvolvimento em mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Este método pode ajudar a responder a uma das principais questões no campo reprodutivo, ou seja, como e quando processos geneticamente regulados influenciam o tamanho da reserva ovariana que conhecemos impactar as fêmeas, longevidade reprodutiva Este protocolo pode ser adotado para estudos em larga escala usando as mesmas técnicas para ovários intactos de diferentes estágios de desenvolvimento. Gera dados produziveis fornecendo uma quantificação eficiente das células germinativas. Este método aplicado a animais geneticamente diversos da mesma espécie pode fornecer uma visão dos fatores genéticos diretamente do desenvolvimento de células germinativas e ovarianas e outros órgãos de desenvolvimento.Demonstrando o procedimento estará Nathaniel Boechat, um estagiário de pesquisa do meu laboratório Para começar com o passo de profusão e garantir o rato feminino pubertal anestesiado em suas costas, fixando suavemente todas as pernas através das patas em uma posição relaxada em uma prancha. Para abrir a cavidade torácica do camundongo, corte cuidadosamente as costelas em ambos os lados do esterno logo abaixo da escápula, evitando perfurar os pulmões pegue a pele ou as abas das costelas com as fórceps e fixe os retalhos para expor os órgãos internos usarem tesouras de dissecção para cortar o átrio direito do coração e liberar sangue do sistema. Em seguida, segurando o coração com fórceps insira uma agulha de perfusão no ventrículo esquerdo e bombeie 10 mililitros de PBS com uma pressão suave e constante.Quando os tecidos como os rins hepáticos e o trato reprodutivo virou de rosa para branco substituem o PBS por 1%de paraformaldeído ou PFA recém-fabricados e continuam a perfusão com aproximadamente 10 mililitros de PFA. Em seguida, localize a almofada de gordura com os ovários abaixo do rim e disseque suavemente todo o trato reprodutivo, incluindo os ovários da almofada de gordura e chifres uterinos para colocá-lo em um frasco com 4%PFA. Fixar os ovários à temperatura ambiente por 16 a 24 horas antes de substituir o 4%PFA por 70% de etanol.No dia da coloração aparar os ovários antes de prosseguir com a mancha imuno. No primeiro dia do protocolo de coloração imuno pipeta um mililitro de PBS por poço no número desejado de poços em uma placa limpa de 24 poços. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1000 microliter para fazer uma abertura larga e use a ponta larga para transferir suavemente os ovários pubertal de frascos com 70% de etanol para os Poços, em seguida, substitua PBS no poço com 0,8 mililitro fresco de PBS No dia seguinte aspirar PBS dos poços para substituí-lo por 0,8 mililitros do tampão de perlitação por poço.Depois de incubar as placas do agitador à temperatura ambiente por quatro horas substitua o tampão de permeação por tampão de bloqueio No terceiro dia, prepare os anticorpos primários por diluição no tampão de bloqueio. Para visualizar os oócitos incubam os ovários pré-natal e prepubertal com os marcadores oócitos. No oitavo dia, lave as amostras com um tampão de lavagem fresco por duas horas e substitua o tampão de lavagem por 0,5 mililitros das misturas de anticorpos secundários diluídas em um tampão de bloqueio.Sele a placa com um parafilme para evitar a evaporação e incubar as amostras à temperatura ambiente no escuro por três dias. No dia 11 após a lavagem da coloração imuno, aspire o tampão de lavagem e incuba as amostras com 0,8 mililitros da solução cúbica de escala a 37 graus Celsius por três dias no escuro. Mudando a escala cúbica uma solução diariamente.No dia 15, lave as amostras três vezes por 10 minutos e 0,8 mililitros de PBS em temperatura ambiente com agitação suave. Em seguida, substitua o PBS por 0,8 mililitros da sacarose desgassada recém-preparada com PBS, seguida de suave agitação à temperatura ambiente. Após uma hora substitua a solução de 20% de sacarose para tratar as amostras por 0,8 mililitros da solução cúbica de escala dois por quatro a cinco dias, como explicado anteriormente.Para preparar uma amostra configurada, use uma dica de pipeta de 200 microliteres com o corte da ponta para transferir os ovários pubertal com 15 a 20 microliters de solução cúbica de escala dois no meio do poço adesivo. Uma vez que os ovários são transferidos para o poço individual com uma gota de solução de compensação coloque suavemente um copo de tampa no poço adesivo e pressione para criar uma vedação sanduichando as amostras e limpando a solução entre dois deslizamentos de cobertura. Para o local de imagem, o sanduíche de deslizamento de tampa em um slide adaptador de microscópio impresso em 3D.Configure os parâmetros para aquisição de imagens de acordo com os núcleos de microscopia ou as especificações do fabricante. Se disponível, use a aquisição bidirecional de imagem para reduzir o tempo de digitalização e melhorar a eficiência. Ajuste a média da linha, a média do quadro e o acúmulo de quadros no software.Configure a pilha Z identificando o início e a posição final, em seguida, selecione um tamanho de passo Z de dois micrômetros para ovários pré-púbertes e cinco micrômetros para ovários pubertal. Em seguida, ative o recurso de compensação Z e o ganho de excitação. Defina a compensação Z para a parte inferior e superior da amostra selecionando uma intensidade de laser para ambos.Use o modo de revestimento para amostras maiores que não podem ser capturadas em um único campo de visão. Ative o navegador de imagem e indique o número de telhas necessárias para capturar toda a amostra com a ferramenta de marcação retangular. Uma vez que a configuração é feita, comece com a aquisição de imagens para as imagens com várias telhas, comece a aquisição de imagens com o navegador para capturar todas as telhas.Após a aquisição da imagem, salve todas as imagens. E se várias telhas foram adquiridas, execute a ferramenta mesclada do mosaico para fundir as telhas em uma única imagem. Para determinar o tamanho dos oócitos, abra a imagem e selecione a opção fatia para abrir a imagem da pilha Zs.Selecione a opção de linha e o painel de medida e meça a distância desenhando uma linha de uma borda de um oócito ou marcador para a outra borda no ponto mais largo para determinar o diâmetro X Y do oócito. Mova-se através da pilha e obtenha a faixa de diâmetros para vários oócitos do mesmo tipo. Use o comprimento mais curto como o critério de seleção de tamanho para contagem de oócitos.Em seguida, na opção de visualização 3D, selecione o recurso de pontos. No painel de cena ativar a função adicionar novos pontos para abrir o painel do algoritmo. Em seguida, desmarque todas as configurações do algoritmo como o filtro de seleção de tamanho com o tamanho dos oócitos obtido anteriormente.Clique na seta do canal para a frente para mover-se para o canal de origem. Em seguida, selecione o canal com o marcador preferido e digite o diâmetro adquirido no diâmetro estimado X, Y. Após a seleção de tamanho ativar o modelo de alongamento PSF e subtração de fundo que são automaticamente determinados.Em seguida, escolha a única seta para a frente para mover-se para o painel de pontos do filtro e adicione o filtro de qualidade para determinar um limiar. Para garantir que a estimativa precisa dos números de oócitos amplie a imagem. Mais tarde, clique na seta dupla para terminar contagens automatizadas.Use a guia de edição para selecionar manualmente oócitos perdidos ou desmarcar partículas nonoócitos selecionadas pelo limiar automático. Quando feito, registo os dados na guia estatísticas sob a guia geral para análise suplementar. Para estimar os números totais de oócitos e os ovários danificados, abra imagens dos ovários intactos com MRS e selecione o recurso de quadro.Sob as configurações do quadro, selecione as marcas de marca de grade da caixa e as etiquetas de acesso. Na posição, a guia XYZ selecione 200 micróme para gerar marcas de carrapato com 200 espaços de micrômetros em todas as posições XYZ. Usando as marcas de carrapato de 200 micrômetros, selecione oócitos que se enquadram em 50% do volume de cada ovário.Clique no recurso de manchas e selecione as etiquetas de edição para classificar os oócitos que se enquadram na região de 50%. Na escala de cinza representativa, foram vistas imagens multifótons dos ovários não perfumados e perfumados, os pequenos oócitos em folículos primordiais com a fina camada de coloração DDX4 citoplasmática. Além disso, os oócitos maiores dentro dos folículos em crescimento foram avistados.Foram estudadas as renderizações 3D das imagens multifótons do pré-natal e dos ovários pós-natais. No pós-natal 28, o ovário da fêmea não irradiada de controle continha uma grande população de pequenos oócitos nos folículos primordiais. Em contraste, os ovários da fêmea irradiada com 0,5 cinza da radiação gama eram completamente desprovidos de pequenos oócitos nos folículos primários.Mas os oócitos maiores ainda estavam presentes. Para a quantificação dos oócitos, as imagens multifótons 3D foram processadas no software MRS utilizando o filtro gouciano e os oócitos de tamanhos pequenos e grandes foram identificados e quantificados utilizando o recurso spot. Em seguida, o percentual médio dos oócitos foi calculado em cada etapa em comparação com o número médio presente no estágio inicial E 15,5 os números de oócitos diminuíram acentuadamente entre E 15,5 e E 18,5 o E 15,5 e E 18,5 oócitos fetais expressos linha um orf um P como visto nas imagens multi fótons.A análise de intensidade mostrou expressões mais elevadas da linha um orf um P por oócitos em E 18,5 do que e 15,5. Os ovários com pequenos danos podem ser usados para análise. O total de oócitos é determinado por meio de correção computacional.O modelo representativo mostra oócitos G CNA positivos no ovário E 15,5 com cinco regiões de 10% destacadas em um ovário intacto. Da mesma forma, foi gerado um ovário simulado com regiões 10% incrementais faltando até 50% do ovário. Os números totais de oócitos e os ovários simulados foram comparados com os ovários intactos originais.E a diferença foi apresentada como o desvio percentual Boa perfusão resulta em boa qualidade de imagem. Portanto, certifique-se de que todos os tecidos sejam limpos com PBS antes de mudar para PFA. Certifique-se de que os ovários estão completamente expostos, cortando o tecido extra.O protocolo permite uma análise eficiente de um grande número de amostras, dados quantitativos obtidos de populações de referência genética, como cruzamento colaborativo ou produção de diversidade, ajudarão a identificar modificadores genéticos do desenvolvimento de oócitos e números de oócitos.

Research

JoVE Journal

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Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Correlativa Super-resolução e microscopia eletrônica para resolver a localização da proteína na Retina de Zebrafish

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Cultura do tecido ovariano Visualizar fenômenos no ovário de Mouse

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...