Name: whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (R01 HD093778 для E.B-F и T32 HD007065 для R.B). Мы благодарим Закари Буше за помощь в радиационном эксперименте. Благодарим Мэри Энн Гендель за критическое прочтение рукописи. Мы с благодарностью признаем вклад Сони Эраттупужи и Службы микроскопии в Лаборатории Джексона за экспертную помощь в работе по микроскопии, описанной в этой публикации, и Джарека Трапсзо из Службы научных приборов в Лаборатории Джексона за разработку слайда адаптера 3D-печати.

Все использованные мыши принадлежали к генетическому штамму C57BL/6J (см. Таблицу материалов). Этот штамм был полностью секвенирован и является стандартным для многих исследований структуры и функции яичников. Мыши были размещены в соответствии с руководящими принципами NIH, а вып...

В этой статье представлен подробный протокол 3D-иммуноокрашения и визуализации для пренатальных и постнатальных яичников для высокопроизводительных и сравнительных исследований для количественной оценки зародышевых клеток и локализации белка. Мы разработали этот протокол для анали...

Большинство самок млекопитающих рождаются с конечным числом мейотически остановленных ооцитов, хранящихся в первичных фолликулах, составляющих овариальный резерв (OR)1,2. ОПЕРАЦИОНН определяет общую продолжительность репродуктивной жизни и здоровье женщин3. ОПЕРАЦИОНН обычно уменьшается в размерах со старением и может быть преждевременно истощена при воздействии определенных генотоксических агентов (лучевая / химиотерапия) и экологических стрессов (недоедание), что приводит к бесплодию 4,5,6. Идиопатическое женское бесплодие часто можно отнести к генетическому и физиологическому качеству яйцеклеток, развивающихся из ОПЕРАЦИОННОЙ и остающихся плохо изученными 7,8. Поскольку эндаумент женских фолликулов в значительной степени предопределен рождением, важно понимать регуляторные механизмы, участвующие в создании и поддержании ОПЕРАЦИОННОЙ.
У мышей образование ОР начинается со спецификации первичных половых клеток (ПГК) вокруг эмбрионального дня (E) 7,52. PGC мигрируют в генитальные гребни, где они будут проживать примерно по E10.59. Следующая обширная пролиферация происходит с неполным цитокинезом, что приводит к образованию кист, которые будут разрушены позже в развитии10,11. Примерно при Е12,5 определяется пол гонад, и пролиферация PGC останавливается в яичниках. У женщин ПГК, в настоящее время ооциты, вводят мейотическую профазу I (MPI) примерно по E13,512,13. Ооциты прогрессируют через расширенный MPI и остановку на стадии диктиата во время рождения. В течение первой недели после рождения каждая арестованная яйцеклетка окружена гранулезными клетками, тем самым образуя примордиальный фолликул.
Количество первичных фолликулов в ОШ самки зависит от того, сколько ооцитов пережило волны элиминации ооцитов, возникающие до и во время остановки MPI через апоптоз, аутофагию или некроз14,15. Первая волна возникает во время внутриутробного развития и известна как FOA. FOA - это эволюционно сохраненный процесс у самок (млекопитающих и немлекопитающих), в результате которого, по оценкам, 50-80% ооцитов удаляются в зависимости от женских видов 16,17,18,19. У мышей FOA происходит во время E15.5 до E18.5 и приписывается реактивации и экспрессии ретротранспозонных последовательностей LINE-1, вызывающих гибель ооцитов 20,21. Вторая волна элиминации ооцитов происходит через мейотическую контрольную точку, которая устраняет ооциты с мейотическими дефектами, такими как невосстановленные двухцепочечные разрывы ДНК (DSBs)22,23. Следующая волна элиминации ооцитов происходит во время распада кисты, кульминацией которой является образование примордиальных фолликулов, каждый из которых содержит единую яйцеклетку 10,11,24,25.
У мышей резерв примордиальных фолликулов в значительной степени устанавливается половым созреванием, после чего он уменьшается по мере активации первичных фолликулов для роста во время регулярных репродуктивных циклов. Размер ОПЕРАЦИОННОЙ варьируется среди отдельных женщин и среди различных генетических штаммов мышей; тем не менее, генетическая регуляция размера ОР не совсем понятна 26,27,28,29. Генетическим исследованиям регуляции ОР препятствует отсутствие стандартизированных протоколов изучения волн элиминации ооцитов во время пренатального и постнатального развития. На мышах было разработано несколько методологий количественной оценки ооцитов, наиболее распространенной и широко используемой из которых является гистоморфометрическая оценка гистологических срезов30,31. В этом методе ооциты идентифицируются на последовательных участках с гистологическими пятнами, такими как гематоксилин и эозин (H & E) и периодические кислоты-Шиффа (PAS) или флуоресцентные маркеры. Этот метод надежен, если все условия остаются постоянными, включая толщину сечения, эффективное восстановление всех участков по всему яичнику и схемы подсчета отдельных лабораторий. Однако цифры, сообщаемые различными лабораториями, часто значительно различаются и, следовательно, их нелегко сопоставить.
Кроме того, учитывая генетические различия, использование различных штаммов мышей также может влиять на количество ооцитов. Для гистоморфометрической оценки были разработаны дополнительные вычислительные подходы, включающие автоматическое обнаружение ооцитов с использованием фракционаторного подхода, автоматический подсчет с использованием вычислительных алгоритмов и 3D-реконструкцию гистологических изображений для предотвращения многократного подсчета одного и того же ооцита 31,32,33,34,35,36 . Даже с учетом этих улучшений, добавленных к гистоморфометрической оценке, метод является относительно трудоемким, особенно для крупномасштабных и высокопроизводительных исследований. Собранные данные могут быть невоспроизводимыми и сопоставимыми между исследованиями из-за различий в схемах подсчета, компьютерных алгоритмах и используемом программном обеспечении.
В последнее время, ускоренные разработкой новых методов многофотонной и световой листовой микроскопии среднего разрешения и оптического очищения тканей, методы 3D-моделирования и анализа интактных яичников становятся методом выбора для эффективной количественной оценки числа ооцитов и изучения локализации и динамики белка37,38. Эти 3D-методы, как правило, выгодны по сравнению с гистологическими методами, поскольку ткани и органы лучше сохраняются и сохраняются нетронутыми. Кроме того, 3D-анализ и моделирование дают дополнительное представление о функциях и взаимодействиях внутри и между клеточными нишами или подструктурами в органе, которые могут быть пропущены в 2D-анализе.
3D-анализ целых органов требует оптимизации протоколов фиксации, иммуноокрашивания и оптического очищения для отдельных органов, таких как яичники, без искажения или повреждения тканей. Дополнительная оптимизация монтажа образца для визуализации требуется для микроскопии с высоким разрешением и может зависеть от доступной платформы визуализации. Наконец, визуализация всего неповрежденного яичника генерирует большое количество данных для последующего вычислительного анализа. Поэтому необходимо разработать стандартизированные 3D-методы подсчета ооцитов для сравнительных исследований и на разных стадиях развития.
Этот протокол использует стандартное иммуноокрашивание и ранее сообщенные протоколы очистки, ориентируясь на простой, удобный для пользователя и высокопроизводительный подход 38,39,40,41. Протокол оптимизирован для анализа большого количества пренатальных и постнатальных яичников до постнатального дня 28 (P28) и различных размеров яичников из разных генетических фонов мышей. Этапы иммуноразрашивания сходны для всех стадий; однако протоколы очистки различаются для пубертатных яичников из-за их большего размера, ScaleS4(0) и CUBIC для малых и больших яичников, соответственно40,41. Кроме того, перфузия всего тела выполняется у мышей P28 перед фиксацией, чтобы предотвратить аутофлуоресценцию клеток крови. Многофотонный микроскоп был построен на платформе Leica DIVE/4Tune в качестве альтернативы световой листовой микроскопии для получения изображений, и для этого протокола было выбрано программное обеспечение IMARIS 3D Visualization and Analysis с различными аналитическими инструментами. Этот протокол прост в использовании и менее практичен, что экономит время. Кроме того, количественное определение ооцитов происходит относительно быстро, в зависимости от размера яичника и расположения ооцитов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchtop Incubator</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H2200-H</td>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>mouse inbred strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1435</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastWells Reagent Barriers</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>664113</td>
			<td>Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21246</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21434</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Version 9.7.0</td>
			<td>Image visualization and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight X3</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight&#160;X3 Tunable Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Version 3.5.6</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406</td>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Pump Controller</td>
			<td>SPW Industrial</td>
			<td>Model: 7553-50</td>
			<td>Peristaltic pump for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14010-17</td>
			<td>5&#8221; &#8211;7&#8221; blunt/blunt scissors for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini BioMixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D1020</td>
			<td>shaker/nutator for 37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ergonomic SMZ1270</td>
			<td>Leica</td>
			<td>&#160;SMZ1270</td>
			<td>stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>Dissolve in Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ICN1670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DDX4/MVH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27591</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LINE-1 ORF1p</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab216324</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-TRA98/GCNA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82527</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tekmar Orbital Shaker</td>
			<td>Bimedis</td>
			<td>VXR-S10</td>
			<td>shaker for room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNOLOK Infusion Set</td>
			<td>MYCO Medical</td>
			<td>7001-23</td>
			<td>needles for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>97061-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120LED</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>S/N XT640-W-0147</td>
			<td>low-power LED fluorescence lamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse

Женская фертильность и репродуктивная продолжительность жизни зависят от качества и количества ооцитарного резерва яичников. По оценкам, 80% женских половых клеток, входящих в мейотическую профазу I, устраняются во время истощения ооцитов плода (FOA) и первой недели послеродовой жизни. Три основных механизма регулируют количество ооцитов, которые выживают во время развития и устанавливают овариальный резерв у самок, вступающих в период полового созревания. В первой волне потери ооцитов 30-50% ооцитов элиминируются во время ранней FOA, явление, которое объясняется высокой экспрессией long interspersed nuclear element-1 (LINE-1). Второй волной потери ооцитов является устранение ооцитов с мейотическими дефектами контрольной точкой мейотического качества. Третья волна потери ооцитов происходит перинатально во время формирования первичного фолликула, когда некоторые ооциты не образуют фолликулов. Остается неясным, что регулирует каждую из этих трех волн потери ооцитов и как они формируют овариальный резерв у мышей или людей.
Иммунофлуоресценция и 3D-визуализация открыли новый путь для изображения и анализа развития ооцитов в контексте всего яичника, а не в менее информативных 2D-разделах. В этой статье представлен комплексный протокол для иммуноокрашивания и оптической очистки всего яичника, дающий подготовку к визуализации с использованием многофотонной микроскопии и 3D-моделирования с использованием коммерчески доступного программного обеспечения. Он показывает, как этот метод может быть использован для отображения динамики истощения ооцитов во время развития яичников у мышей C57BL/6J и количественной оценки потери ооцитов во время трех волн элиминации ооцитов. Этот протокол может быть применен к пренатальным и ранним постнатальным яичникам для визуализации и количественной оценки ооцитов, а также к другим количественным подходам. Важно отметить, что протокол был стратегически разработан для обеспечения высокопроизводительной, надежной и повторяемой обработки, которая может удовлетворить потребности в токсикологии, клинической диагностике и геномных анализах функции яичников.

Иммуноокрашивание и визуализация всего яичника позволяет визуализировать и количественно оценивать ооциты или экспрессию белка в яичниках на разных стадиях развития с использованием одной и той же техники и маркеров (рисунок 3). Этот протокол был разработан для масшта...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse at JoVE.com

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Здесь мы представляем оптимизированный протокол для визуализации целых яичников для количественного и качественного анализа с использованием полноразмерного иммуноокрашивания, многофотонной микроскопии и 3D-визуализации и анализа. Этот протокол обеспечивает высокопроизводительную, надежную и повторяемую обработку, которая применима для токсикологии, клинической диагностики и геномных анализов функции яичников.

Иммунофлуоресценция, очистка и многофотонная микроскопия цельных яичников для количественного 3D-анализа развивающегося овариального резерва у мышей

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Этот метод может помочь ответить на один из ключевых вопросов в репродуктивной области, а именно, как и когда генетически регулируемые процессы влияют на размер овариального резерва, который, как мы знаем, влияет на женщин, репродуктивное долголетие Этот протокол может быть принят для крупномасштабных исследований с использованием одних и тех же методов для интактных яичников с разных стадий развития. Он генерирует производимые данные, обеспечивая эффективную количественную оценку половых клеток. Этот метод, применяемый к генетически разнообразным животным одного и того же вида, может дать представление о генетических факторах непосредственно развития половых клеток и яичников и других органов развития.Продемонстрировать процедуру будет Натаниэль Боэчат, стажер-исследователь из моей лаборатории Начать с обильного шага и закрепить анестезированную пубертатную самку мыши на спине, осторожно прижав все ноги через подушечки лап в расслабленном положении на доску. Чтобы открыть грудную полость мыши, аккуратно срежьте ребра по обеим сторонам грудины чуть ниже лопатки, избегая прокола легких, захватите кожу или реберные лоскуты щипцами и приколите лоскуты, чтобы обнажить внутренние органы, используйте рассеченные ножницы, чтобы перерезать правое предсердие сердца и выпустить кровь из системы. Затем, удерживая сердце щипцами, вводят перфузионную иглу в левый желудочек и перекачивают 10 миллилитров PBS с мягким и постоянным давлением.Когда ткани, такие как почки печени и репродуктивный тракт, превратились из розового в белый, заменяют PBS свежевыделенным 1% параформальдегидом или PFA и продолжают перфузию примерно 10 миллилитрами PFA. Затем найдите жировую подушку с яичниками ниже почки и аккуратно рассекните весь репродуктивный тракт, включая жировую подушку яичников и маточных рогов, чтобы поместить ее во флакон с 4% PFA. Зафиксируйте яичники при комнатной температуре в течение 16-24 часов, прежде чем заменить 4% PFA на 70% этанол.В день окрашивания обрежьте яичники, прежде чем приступить к иммуно окрашиванию. В первый день протокола иммуноокрасления пипетка один миллилитр ПБС на скважину в нужное количество лунок в чистой 24 скважинной пластине. Отрежьте наконечник 1000-микролитрового наконечника пипетки, чтобы сделать широкое отверстие, и используйте широкий наконечник, чтобы аккуратно перенести пубертатные яичники из флаконов с 70% этанолом в колодцы, затем замените PBS в скважине свежим 0,8 миллилитра PBS На следующий день аспират PBS из скважин заменит его 0,8 миллилитрами буфера проникновения на скважину.После инкубации пластин на шейкере при комнатной температуре в течение четырех часов замените буфер проникновения блокирующим буфером На третий день подготовьте первичные антитела путем разведения в блокирующий буфер. Для визуализации ооцитов инкубируют пренатальные и препубертатные яичники с маркерами ооцитов. На восьмой день промывайте образцы свежим промывочным буфером в течение двух часов, затем замените буфер промывки 0,5 миллилитрами вторичных смесей антител, разбавленных в блокирующем буфере.Запечатайте пластину парапленкой для предотвращения испарения и инкубируйте образцы при комнатной температуре в темноте в течение трех дней. На 11 день после иммуноокрасления промыть аспирировать промывочный буфер и инкубировать образцы с 0,8 миллилитрами шкалы кубического одного раствора при 37 градусах Цельсия в течение трех дней в темноте. Смена шкалы кубического одного раствора ежедневно.На 15 день промыть образцы трижды в течение 10 минут и 0,8 миллилитра PBS при комнатной температуре с легким встряхиванием. Затем замените PBS 0,8 миллилитрами свежеприготовленной дегазированной 20%-сахарозы PBS с последующим мягким встряхиванием при комнатной температуре. Через час заменяют 20%-ный раствор сахарозы для обработки образцов 0,8 миллилитрами шкалы кубических двух растворов в течение четырех-пяти дней, как объяснялось ранее.Чтобы подготовить образец, используйте 200-микролитровый наконечник пипетки с отсечкой наконечника, чтобы перенести пубертатные яичники с 15-20 микролитрами чешуйки кубических двух растворов в середину клеевого колодца. После того, как яичники перенесены в отдельный колодец с каплей очищающего раствора, аккуратно поместите покровное стекло на клеевой колодец и нажмите, чтобы создать уплотнение, сэндвичинг образцов и очищающий раствор между двумя крышками. Для размещения изображений крышка проскальзывает сэндвич в 3D-печатном слайде адаптера микроскопа.Настройте параметры для получения изображения в соответствии с микроскопическими сердечниками или спецификациями производителя. При наличии используйте двунаправленное получение изображения, чтобы сократить время сканирования и повысить эффективность. Отрегулируйте среднее линейное, среднее значение кадра и накопление кадров в программном обеспечении.Настройте стек Z, определив начальное и конечное положение, затем выберите размер шага Z в два микрометра для препубертатных яичников и пять микрометров для пубертатных яичников. Затем активируйте функцию компенсации Z и усиление возбуждения. Установите Z-компенсацию для нижней и верхней части образца, выбрав интенсивность лазера для обоих.Используйте режим разбиения мозаики для больших образцов, которые не могут быть захвачены в одном поле зрения. Активируйте навигатор изображений и укажите количество плиток, необходимых для захвата всего образца с помощью инструмента прямоугольной маркировки. После завершения настройки начните с получения изображения для изображений с несколькими плитками, начните получение изображения с помощью навигатора, чтобы захватить все плитки.После получения изображения сохраните все изображения. А если было получено несколько плиток, запустите инструмент объединения мозаики, чтобы объединить плитки в одно изображение. Чтобы определить размер ооцитов, откройте изображение и выберите параметр фрагмента, чтобы открыть изображение стека Zs.Выберите параметр линии и панель измерения и измерьте расстояние, проведя линию от одного края ооцитов или маркера до другого края в самой широкой точке, чтобы определить диаметр X Y яйцеклетки. Пройдитесь по стеку и получите диапазон диаметров для нескольких ооцитов одного типа. Используйте самую короткую длину в качестве критерия выбора размера для подсчета ооцитов.Затем в параметре «3D-вид» выберите функцию «Пятна». На панели сцены активируйте функцию добавления новых пятен, чтобы открыть панель алгоритмов. Затем отмените выбор всех настроек алгоритма в качестве фильтра выбора размера с размером ооцитов, полученным ранее.Щелкните стрелку канала вперед, чтобы перейти к исходному каналу. Затем выберите канал с предпочтительным маркером и введите полученный диаметр в расчетный диаметр X, Y. После выбора размера активируйте удлинение модели PSF и вычитание фона, которые определяются автоматически.Затем щелкните одну стрелку вперед, чтобы перейти на панель фильтрующих пятен, и добавьте фильтр качества, чтобы определить пороговое значение. Для обеспечения точной оценки численности ооцитов увеличьте изображение. Позже нажмите на двойную стрелку, чтобы завершить автоматический подсчет.Используйте вкладку редактирования, чтобы вручную выбрать пропущенные ооциты или отменить выбор частиц ноноцитов, выбранных автоматическим порогом. Когда это будет сделано, запишите данные на вкладке статистики под общей вкладкой для дальнейшего анализа. Чтобы оценить общее количество ооцитов и поврежденные яичники, откройте изображения интактных яичников с помощью МРС и выберите признак кадра.Под параметрами фрейма установите флажки сетки и метки доступа. На вкладке XYZ выберите 200 микром, чтобы генерировать метки с 200 микрометровыми пробелами во всех позициях XYZ. Используя 200-микрометровые метки, выберите ооциты, которые попадают в пределах 50% объема каждого яичника.Нажмите на функцию пятен и выберите метки редактирования, чтобы классифицировать ооциты, которые попадают в область 50% по цвету. В репрезентативных оттенках серого видны многофотонные изображения неперфузированных и перфузированных яичников, мелких ооцитов в первичных фолликулах с тонким слоем цитоплазматического окрашивания DDX4. Кроме того, были обнаружены более крупные ооциты в растущих фолликулах.Изучены 3D-рендеры из многофотонных изображений пренатальных и постнатальных яичников. На 28-й послеродовой день яичник от контрольной необлученной самки содержал большую популяцию мелких ооцитов в примордиальных фолликулах. Напротив, яичники у облученной самки с 0,5 серого гамма-излучения были полностью лишены мелких ооцитов в первичных фолликулах.Но более крупные ооциты все еще присутствовали. Для количественной оценки ооцитов 3D-многофотонные изображения были обработаны в программном обеспечении MRS с использованием фильтра Гусиана, а ооциты малых и больших размеров были идентифицированы и количественно определены с использованием точечного признака. Далее средний процент ооцитов был рассчитан на каждой стадии по сравнению со средним числом присутствующих на самой ранней стадии Е 15,5 количество ооцитов резко снизилось между Е 15,5 и Е 18,5, Е 15,5 и Е 18,5 фетальные ооциты экспрессировали линию один орф один Р, как видно на многофотонных изображениях.Анализ интенсивности показал более высокую экспрессию линии один или один Р на ооциты при E 18,5, чем E 15,5. Яичники с небольшими повреждениями могут быть использованы для анализа. Общее количество ооцитов определяется с помощью вычислительной коррекции.Репрезентативная модель показывает положительные ооциты G CNA в яичнике E 15,5 с пятью 10% областями, выделенными в интактном яичнике. Аналогичным образом, был сгенерирован смоделированный яичник с 10% добавочными областями, отсутствующими до 50% яичника. Общее количество ооцитов и смоделированные яичники сравнивались с исходными интактными яичниками.И разница была представлена как процентное отклонение Хорошая перфузия приводит к хорошему качеству изображения. Поэтому убедитесь, что все ткани очищены с помощью PBS, прежде чем переходить на PFA. Убедитесь, что яичники полностью обнажены, обрезав лишнюю ткань.Протокол позволяет эффективно анализировать большое количество образцов, количественные данные, полученные из генетических эталонных популяций, таких как совместный перекрестный или разнообразный вывод, помогут идентифицировать генетические модификаторы развития ооцитов и количества ооцитов.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Культура и Co-Культура мыши яичников и фолликулов в яичниках

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Анализ кардиомиоцитов развития с помощью иммунофлюоресценции в эмбриональных мыши Сердце

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Орган Культура и Всего горе Иммунофлуоресценции Окрашивание мыши Вольфовых Трубочек

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Визуализация и количественный анализ эмбрионального ангиогенеза у<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Корреляционные суперразрешением и электронной микроскопии решить локализация белка в Zebrafish сетчатки

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Целом гора очистки и окраски Arabidopsis цветок органов и Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Вся гора иммунофлюоресценции и количественная оценка фолликула культивировали мыши яичников

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Яичников культуры ткани для визуализации явлений в яичнике мыши

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...