Name: whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri (R01 HD093778 ila E.B-F ve T32 HD007065 ila R.B) tarafından desteklenmiştir. Zachary Boucher'e radyasyon deneyindeki yardımları için teşekkür ederiz. Mary Ann Handel'e yazıyı eleştirel bir şekilde okuduğu için teşekkür ederiz. Sonia Erattupuzha'nın ve Jackson Laboratuvarı'ndaki Mikroskopi Çekirdek Servisi'nin bu yayında açıklanan mikroskopi çalışmasında uzman yardımı için katkılarını ve Jackson Laboratuvarı'ndaki Bilimsel Enstrüman Hizmetleri'nden Jarek Trapszo'yu 3D baskılı adaptör slaytını tasarladığı için minnetle kabul ediyoruz.

Kullanılan tüm fareler C57BL/6J genetik suşu içerisindeydi (bakınız Malzeme Tablosu). Bu suş tamamen sıralanmıştır ve yumurtalık yapısı ve fonksiyonu ile ilgili birçok çalışma için standarttır. Fareler NIH kurallarına göre barındırıldı ve yapılan prosedürler Jackson Laboratuvarı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan reaktifler ve bileşimler sırasıyla Malzeme Tablosu ve Tablo 1'de...

Bu makalede, germ hücresi niceliği ve protein lokalizasyonu için yüksek verimli ve karşılaştırmalı çalışmalar için prenatal ve postnatal yumurtalıklar için ayrıntılı bir 3D immünoboyama ve görüntüleme protokolü sunulmaktadır. Bu protokolü, yumurtalıklardaki oosit sayılarını (N = 6-12), 2-4 24 kuyucuklu plakanın tipik olarak bir seferde işlendiği 10-16 farklı suştaki altı gelişimsel zaman noktasında analiz etmek için geliştirdik. Bu yöntem diğer organlar veya hücresel belirteçler...

Çoğu memeli dişi, primordiyal foliküllerde depolanan ve yumurtalık rezervini (OR) oluşturan sınırlı sayıda mayotik olarak tutuklanmış oositle doğar1,2. Ameliyathane, genel kadın üreme ömrünü ve sağlığını belirler3. Ameliyathane normalde yaşlanma ile birlikte küçülür ve bazı genotoksik ajanlara (radyasyon / kemoterapi) ve çevresel streslere (yetersiz beslenme) maruz kalındığında erken tükenebilir ve bu da infertiliteye yol açar 4,5,6. İdiyopatik kadın infertilitesi sıklıkla ameliyathaneden gelişen yumurtaların genetik ve fizyolojik kalitesine bağlanabilir ve hala tam olarak anlaşılamamıştır 7,8. Kadın folikül bağışı büyük ölçüde doğumla önceden belirlendiğinden, ameliyathanenin kurulması ve sürdürülmesinde yer alan düzenleyici mekanizmaları anlamak önemlidir.
Farelerde, OR oluşumu, Embriyonik gün (E) 7.52 civarında ilkel germ hücrelerinin (PGC'ler) spesifikasyonu ile başlar. PGC'ler genital sırtlara göç eder ve burada yaklaşık E10.59 tarafından ikamet ederler. Aşağıdaki yaygın proliferasyon, tamamlanmamış sitokinezi ile ortaya çıkar ve daha sonra gelişme10,11'de parçalanacak kistlerin oluşumuna neden olur. Yaklaşık E12.5'te gonadal cinsiyet belirlenir ve PGC proliferasyonu yumurtalıklarda durur. Kadınlarda, PGC'ler, şimdi oositler, yaklaşık E13.512,13'te mayotik faz I'e (MPI) girerler. Oositler uzatılmış MPI ile ilerler ve doğum sırasında diktiyat aşamasında tutuklanır. Doğumdan sonraki ilk hafta boyunca, tutuklanan her oosit granüloza hücreleri ile çevrilidir, böylece ilkel bir folikül oluşturur.
Bir dişinin ameliyathanesindeki primordiyal foliküllerin sayısı, MPI tutuklamasından önce ve sırasında apoptoz, otofaji veya nekroz yoluyla meydana gelen oosit eliminasyon dalgalarından kaç oositin kurtulduğuna bağlıdır14,15. İlk dalga fetal gelişim sırasında ortaya çıkar ve FOA olarak bilinir. FOA, dişilerde (memeli ve memeli olmayan) evrimsel olarak korunmuş bir süreçtir ve bu sayede yumurta türlerinin tahmini% 50-80'i dişi türlere bağlı olarak elimine edilir16,17,18,19. Farelerde, FOA E15.5 ila E18.5 arasında meydana gelir ve oosit ölümüne neden olan retrotranspozon LINE-1 sekanslarının reaktivasyonu ve ekspresyonuna atfedilmiştir20,21. Oosit eliminasyonunun ikinci dalgası, onarılmamış DNA çift iplikçik kırılmaları (DSB'ler) gibi mayotik defektlere sahip oositleri ortadan kaldıran mayotik bir kontrol noktasından gerçekleşir22,23. Bir sonraki oosit eliminasyon dalgası, kist parçalanması sırasında meydana gelir ve her biri tek bir oosit10,11,24,25 içeren ilkel foliküllerin oluşumu sırasında doruğa ulaşır.
Farelerde, ilkel folikül rezervi büyük ölçüde ergenlik döneminde kurulur, daha sonra ilkel foliküller düzenli üreme döngüleri sırasında büyüme için aktive edildikçe azalır. Ameliyathane büyüklüğü bireysel kadınlar arasında ve farelerin farklı genetik suşları arasında değişir; Ancak, ameliyathane büyüklüğünün genetik regülasyonu iyi anlaşılmamıştır26,27,28,29. Ameliyathane regülasyonunun genetik çalışmaları, doğum öncesi ve doğum sonrası gelişim sırasında oosit eliminasyon dalgalarını incelemek için standartlaştırılmış protokollerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Farelerde çeşitli oosit niceleme metodolojileri geliştirilmiştir, bunların en yaygın ve yaygın olarak kullanılanı histolojik kesitlerin histomorfometrik değerlendirilmesidir30,31. Bu teknikte oositler, hematoksilin ve eozin (H&E) ve periyodik asit-Schiff (PAS) veya floresan belirteçler gibi histolojik lekelere sahip seri kesitlerde tanımlanır. Bu teknik, kesit kalınlığı, yumurtalık boyunca tüm bölümlerin verimli bir şekilde geri kazanılması ve bireysel laboratuvarların sayım şemaları dahil olmak üzere tüm koşullar sabit kalırsa güvenilirdir. Bununla birlikte, farklı laboratuvarlar tarafından bildirilen sayılar genellikle önemli ölçüde farklılık gösterir ve bu nedenle kolayca karşılaştırılamaz.
Ayrıca, genetik farklılıklar göz önüne alındığında, farklı fare suşlarının kullanımı da yumurta sayımlarını etkileyebilir. Histomorfometrik değerlendirme için ek hesaplamalı yaklaşımlar geliştirilmiştir ve fraksiyonatör yaklaşımını kullanarak oositlerin otomatik tespitini, hesaplamalı algoritmaları kullanarak otomatik sayımı ve aynı oositin birden fazla sayımını önlemek için histolojik görüntülerin 3D rekonstrüksiyonunu içerir31,32,33,34,35,36 . Histomorfometrik değerlendirmeye eklenen bu iyileştirmelerle bile, teknik, özellikle büyük ölçekli ve yüksek verimli çalışmalar için nispeten emek yoğundur. Toplanan veriler, sayım şemaları, bilgisayar algoritmaları ve kullanılan yazılımlardaki farklılıklar nedeniyle çalışmalar arasında tekrarlanabilir ve karşılaştırılabilir olmayabilir.
Son zamanlarda, yeni orta çözünürlüklü multifoton ve ışık tabakası mikroskobu ve optik doku temizleme yöntemlerinin geliştirilmesiyle hızlanan bozulmamış yumurtalıklar için 3D modelleme ve analiz teknikleri, yumurta sayılarını verimli bir şekilde ölçmek ve protein lokalizasyonunu ve dinamiklerini incelemek için tercih edilen yöntem haline gelmektedir37,38. Bu 3D yöntemler, dokular ve organlar daha iyi korunduğu ve bozulmadan tutulduğu için histolojik yöntemlere kıyasla tipik olarak avantajlıdır. Ayrıca, 3D analiz ve modelleme, 2D analizde kaçırılabilecek organ içindeki hücre nişleri veya alt yapıları içindeki ve arasındaki işlev ve etkileşimler hakkında ek bilgiler sağlar.
Tüm organların 3D analizi, yumurtalıklar gibi bireysel organlar için doku bozulması veya hasarı olmadan fiksasyon, immün boyama ve optik temizleme protokollerinin optimizasyonunu gerektirir. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi için görüntüleme için numune montajının ek optimizasyonu gereklidir ve mevcut görüntüleme platformuna bağlı olabilir. Son olarak, tüm bozulmamış yumurtalığın görüntülenmesi, sonraki hesaplamalı analizler için büyük miktarda veri üretir. Bu nedenle, karşılaştırmalı çalışmalar için ve gelişim aşamaları boyunca oositlerin sayımı için standartlaştırılmış 3D yöntemler geliştirmeye ihtiyaç vardır.
Bu protokol, standart immünoboyama ve daha önce bildirilen temizleme protokollerini kullanır ve basit, kullanıcı dostu ve yüksek verimli bir yaklaşıma odaklanır 38,39,40,41. Protokol, doğum sonrası 28. güne (P28) kadar çok sayıda doğum öncesi ve doğum sonrası yumurtalıkları ve farklı fare genetik geçmişlerinden gelen farklı boyutlardaki yumurtalıkları analiz etmek için optimize edilmiştir. İmmün boyama adımları tüm aşamalar için benzerdir; Bununla birlikte, temizleme protokolleri daha büyük boyutları, küçük ve büyük yumurtalıklar için sırasıyla 40,41 olan ScaleS4 (0) ve CUBIC nedeniyle pubertal yumurtalıklar için farklılık göstermektedir. Ayrıca, kan hücrelerinden otofloresan önlemek için fiksasyondan önce P28 farelerde tüm vücut perfüzyonu gerçekleştirilir. Görüntü elde etmek için ışık tabakası mikroskobuna alternatif olarak Leica DIVE/4Tune platformu üzerine çok fotonlu mikroskop inşa edildi ve bu protokol için çeşitli analitik araçlara sahip IMARIS 3D Görselleştirme ve Analiz yazılımı seçildi. Bu protokolün takip edilmesi kolaydır ve daha az pratiktir, bu nedenle zaman kazandırır. Ayrıca, yumurtalığın büyüklüğüne ve yumurtaların düzenlenmesine bağlı olarak yumurta miktarı nispeten hızlıdır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchtop Incubator</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H2200-H</td>
			<td>37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>mouse inbred strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1435</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastWells Reagent Barriers</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>664113</td>
			<td>Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21246</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21434</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS Software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Version 9.7.0</td>
			<td>Image visualization and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insight X3</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>InSight&#160;X3 Tunable Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASX software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Version 3.5.6</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406</td>
			<td>Multiphoton Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai HP</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser</td>
			<td>Laser for Multiphoton Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Pump Controller</td>
			<td>SPW Industrial</td>
			<td>Model: 7553-50</td>
			<td>Peristaltic pump for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14010-17</td>
			<td>5&#8221; &#8211;7&#8221; blunt/blunt scissors for decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini BioMixer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>B3D1020</td>
			<td>shaker/nutator for 37 &#176;C incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ergonomic SMZ1270</td>
			<td>Leica</td>
			<td>&#160;SMZ1270</td>
			<td>stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2944100</td>
			<td>Dissolve in Milli-Q water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ICN1670249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrol (N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DDX4/MVH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab27591</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-LINE-1 ORF1p</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab216324</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-TRA98/GCNA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82527</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>Hazardous material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tekmar Orbital Shaker</td>
			<td>Bimedis</td>
			<td>VXR-S10</td>
			<td>shaker for room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNOLOK Infusion Set</td>
			<td>MYCO Medical</td>
			<td>7001-23</td>
			<td>needles for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>97061-920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120LED</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>S/N XT640-W-0147</td>
			<td>low-power LED fluorescence lamp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for quantitative 3d analysis of the developing ovarian reserve in mouse

Kadın fertilitesi ve üreme ömrü, yumurtalık oosit rezervinin kalitesine ve miktarına bağlıdır. Mayotik faz I'e giren dişi germ hücrelerinin tahmini% 80'i, Fetal Oosit Yıpranması (FOA) ve doğum sonrası yaşamın ilk haftasında elimine edilir. Üç ana mekanizma, gelişim sırasında hayatta kalan oosit sayısını düzenler ve ergenliğe giren kadınlarda yumurtalık rezervini oluşturur. Yumurta kaybının ilk dalgasında, oositlerin% 30-50'si, yüksek Uzun serpiştirilmiş nükleer element-1 (LINE-1) ekspresyonuna atfedilen bir fenomen olan erken FOA sırasında elimine edilir. Oosit kaybının ikinci dalgası, mayotik defekti olan oositlerin mayotik kalite kontrol noktası ile ortadan kaldırılmasıdır. Oosit kaybının üçüncü dalgası, primordiyal folikül oluşumu sırasında, bazı oositlerin folikül oluşturamadığı durumlarda perinatal olarak ortaya çıkar. Bu üç oosit kaybı dalgasının her birini neyin düzenlediği ve farelerde veya insanlarda yumurtalık rezervini nasıl şekillendirdikleri belirsizliğini korumaktadır.
İmmünofloresan ve 3D görselleştirme, oosit gelişimini daha az bilgilendirici 2D bölümlerden ziyade tüm yumurtalık bağlamında görüntülemek ve analiz etmek için yeni bir yol açmıştır. Bu makale, tüm yumurtalık immün boyama ve optik temizleme için kapsamlı bir protokol sunarak, multifoton mikroskobu kullanarak görüntüleme ve ticari olarak temin edilebilen yazılımı kullanarak 3D modelleme için preparatlar sunmaktadır. Bu yöntemin C57BL / 6J farelerde yumurtalık gelişimi sırasında yumurta yıpranmasının dinamiklerini göstermek ve üç yumurta eliminasyon dalgası sırasında yumurta kaybını ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu protokol, oosit görselleştirme ve nicelleştirme için prenatal ve erken postnatal yumurtalıklara ve diğer kantitatif yaklaşımlara uygulanabilir. Daha da önemlisi, protokol, toksikoloji, klinik teşhis ve yumurtalık fonksiyonunun genomik tahlillerindeki ihtiyaçları karşılayabilecek yüksek verimli, güvenilir ve tekrarlanabilir işlemeyi barındırmak için stratejik olarak geliştirilmiştir.

Tüm yumurtalığın immün boyanması ve görüntülenmesi, aynı teknik ve belirteçler kullanılarak farklı gelişim evrelerinde yumurtalıklardaki oositlerin veya protein ekspresyonunun görüntülenmesini ve nicelleştirilmesini sağlar (Şekil 3). Bu protokol, yumurtalıkların birden fazla aşamada ve birden fazla fare suşundan analizinin gerekli olduğu büyük ölçekli bir proje için geliştirilmiştir. Burada, genetik analiz için standart bir suş olan C57BL6 / J suşu için t...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse at JoVE.com

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Burada, tam montajlı immünoboyama, çoklu foton mikroskobu ve 3D görselleştirme ve analiz kullanarak kantitatif ve kalitatif analizler için tüm yumurtalıkları görüntülemek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, toksikoloji, klinik teşhis ve yumurtalık fonksiyonunun genomik tahlilleri için geçerli olan yüksek verimli, güvenilir ve tekrarlanabilir işlemeyi kapsar.

Farede Gelişmekte Olan Yumurtalık Rezervinin Kantitatif 3D Analizi için Tüm Yumurtalık İmmünofloresansı, Temizleme ve Multifoton Mikroskobu

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Bu yöntem, üreme alanındaki kilit sorulardan birini, yani genetik olarak düzenlenmiş süreçlerin kadınları etkilediğini bildiğimiz yumurtalık rezervinin boyutunu nasıl ve ne zaman etkilediğini, üreme ömrünü nasıl ve ne zaman etkilediğini cevaplamaya yardımcı olabilir Bu protokol, farklı gelişim aşamalarından bozulmamış yumurtalıklar için aynı teknikleri kullanan büyük ölçekli çalışmalar için benimsenebilir. Germ hücrelerinin verimli bir şekilde ölçülmesini sağlayarak üretilebilir veriler üretir. Aynı türün genetik olarak farklı hayvanlarına uygulanan bu yöntem, genetik faktörler hakkında doğrudan germ hücresi ve yumurtalık gelişimi ve diğer gelişim organları hakkında fikir verebilir.Prosedürü gösteren Nathaniel Boechat, laboratuvarımdan bir araştırma stajyeri olacak Bolluk adım yeri ile başlamak ve anestezi uygulanmış ergenlik dişi fareyi sırtına sabitlemek için tüm bacakları pençe pedlerinden yavaşça bir tahtaya rahat bir pozisyonda sabitleyerek. Farenin göğüs boşluğunu açmak için, kürek kemiğinin hemen altındaki sternumun her iki tarafındaki kaburgaları dikkatlice kesin, akciğerleri delmekten kaçının, forseps ile cildi veya kaburga kapaklarını tutun ve iç organları açığa çıkarmak için kanatları sabitleyin, kalbin sağ atriyumunu kesmek ve sistemden kan salmak için diseksiyon makası kullanın. Daha sonra kalbi forseps ile tutarak sol ventriküle bir perfüzyon iğnesi yerleştirin ve hafif ve sabit bir basınçla 10 mililitre PBS pompalayın.Karaciğer böbrekleri ve üreme sistemi gibi dokular pembeden beyaza döndüğünde, PBS'yi taze yapılmış% 1 paraformaldehit veya PFA ile değiştirin ve yaklaşık 10 mililitre PFA ile perfüzyona devam edin. Daha sonra yağ yastığını böbreğin altındaki yumurtalıklarla birlikte yerleştirin ve% 4 PFA içeren bir şişeye yerleştirmek için yağ pedi yumurtalıkları ve uterus boynuzları da dahil olmak üzere tüm üreme sistemini nazikçe disseke edin. % 4 PFA'yı% 70 etanol ile değiştirmeden önce yumurtalıkları oda sıcaklığında 16 ila 24 saat sabitleyin.Boyama gününde, immün boyama işlemine devam etmeden önce yumurtalıkları düzeltin. İmmüno-boyama protokolünün birinci gününde, kuyu başına bir mililitre PBS'yi temiz bir 24 kuyu plakasında istenen sayıda kuyuya pipetleyin. Geniş bir açıklık yapmak için 1000 mikrolitrelik pipet ucunun ucunu kesin ve ergenlik yumurtalıklarını% 70 etanol içeren şişelerden Kuyucuklara nazikçe aktarmak için geniş ucu kullanın, ardından kuyudaki PBS'yi taze 0.8 mililitre PBS ile değiştirin Ertesi gün PBS'yi kuyu başına 0.8 mililitre geçirgenlik tamponu ile değiştirmek için kuyulardan aspire edin.Çalkalayıcı üzerindeki plakaları dört saat boyunca oda sıcaklığında inkübe ettikten sonra, geçirgenlik tamponunu bloke edici tamponla değiştirin Üçüncü günde, birincil antikorları bloke edici tamponda seyrelterek hazırlayın. Yumurtaları görselleştirmek için prenatal ve prepubertal yumurtalıkları oosit belirteçleri ile inkübe edin. Sekizinci günde numuneleri iki saat boyunca taze bir yıkama tamponu ile yıkayın, ardından yıkama tamponunu bir blokaj tamponunda seyreltilmiş 0,5 mililitre ikincil antikor karışımları ile değiştirin.Buharlaşmayı önlemek için plakayı bir parafilm ile kapatın ve numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında üç gün boyunca inkübe edin. İmmüno-boyama yıkamasından sonraki 11. günde, yıkama tamponunu aspire edin ve numuneleri karanlıkta üç gün boyunca 37 santigrat derecede 0.8 mililitre ölçek kübik bir çözeltisi ile inkübe edin. Ölçek kübik bir çözümünün günlük olarak değiştirilmesi.15. günde, numuneleri 10 dakika boyunca üç kez ve oda sıcaklığında 0,8 mililitre PBS'yi hafifçe çalkalayarak yıkayın. Daha sonra PBS'yi taze hazırlanmış gazdan arındırılmış% 20 sakkarozun 0,8 mililitresini PBS ile değiştirin ve ardından oda sıcaklığında hafifçe sallayın. Bir saat sonra, numuneleri daha önce açıklandığı gibi, dört ila beş gün boyunca 0.8 mililitre ölçek kübik iki çözeltisi ile işlemek için% 20 sakkaroz çözeltisini değiştirin.Bir numune seti hazırlamak için, 15 ila 20 mikrolitre ölçekli kübik iki çözelti içeren pubertal yumurtalıkları yapışkan kuyucuğun ortasına aktarmak için ucu kesilmiş 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. Yumurtalıklar bir damla temizleme çözeltisi ile bireysel kuyuya aktarıldıktan sonra, yapışkan kuyucuğun üzerine yavaşça bir kapak camı yerleştirin ve numuneleri sandviçleyen ve iki kapak kapağı arasında temizleme çözeltisi oluşturan bir conta oluşturmak için bastırın. Görüntüleme yeri için, kapak 3D baskılı mikroskop adaptörü slaytında sandviç kayar.Görüntü alma parametrelerini mikroskopi çekirdeklerine veya üreticinin spesifikasyonlarına göre ayarlayın. Varsa, tarama süresini kısaltmak ve verimliliği artırmak için çift yönlü görüntü yakalamayı kullanın. Yazılımdaki çizgi ortalamasını, kare ortalamasını ve kare birikimini ayarlayın.Başlangıç ve bitiş konumunu belirleyerek Z yığınını ayarlayın, ardından prepubertal yumurtalıklar için iki mikrometre ve pubertal yumurtalıklar için beş mikrometrelik bir Z adım boyutu seçin. Ardından Z telafisi özelliğini ve uyarma kazancını etkinleştirin. Her ikisi için de bir lazer yoğunluğu seçerek numunenin alt ve üst kısmı için Z telafisi ayarlayın.Tek bir görüş alanında yakalanamayan daha büyük örnekler için döşeme modunu kullanın. Görüntü gezginini etkinleştirin ve dikdörtgen işaretleme aracıyla tüm numuneyi yakalamak için gereken kutucuk sayısını belirtin. Ayar tamamlandıktan sonra, birden fazla döşemeye sahip görüntüler için görüntü alma ile başlayın, tüm döşemeleri yakalamak için gezginle görüntü almaya başlayın.Görüntü alımından sonra, tüm görüntüleri kaydedin. Birden çok kutucuk edinilmişse, döşemeleri tek bir görüntüde birleştirmek için mozaik birleştirilmiş aracını çalıştırın. Yumurtaların boyutunu belirlemek için görüntüyü açın ve Zs yığını görüntüsünü açmak için dilimle seçeneğini belirleyin.Çizgi seçeneğini ve ölçü panelini seçin ve oositin X Y çapını belirlemek için bir oositin veya işaretleyicinin bir kenarından diğer kenara en geniş noktada bir çizgi çizerek mesafeyi ölçün. Yığın boyunca ilerleyin ve aynı tipteki çoklu oositler için çap aralığını elde edin. Yumurta sayıları için boyut seçim kriteri olarak en kısa uzunluğu kullanın.Ardından, 3B görünüm seçeneğinde, noktalar özelliğini seçin. Sahne panelinde, algoritma panelini açmak için yeni noktalar ekle işlevini etkinleştirin. Ardından, daha önce elde edilen oosit boyutuyla boyut seçim filtresi olarak tüm algoritma ayarlarının seçimini kaldırın.Kaynak kanala gitmek için kanal ileri okunu tıklatın. Ardından, tercih edilen işaretleyiciye sahip kanalı seçin ve elde edilen çapı tahmini X, Y çapına yazın. Boyut seçiminden sonra, otomatik olarak belirlenen model PSF uzama ve arka plan çıkarma özelliğini etkinleştirin.Ardından, filtre noktaları paneline gitmek için tek ileri oku seçin ve bir eşik belirlemek için kalite filtresini ekleyin. Yumurta sayılarının doğru tahmin edilmesini sağlamak için görüntüyü büyütün. Daha sonra, otomatik sayımları tamamlamak için çift oka tıklayın.Kaçırılan oositleri manuel olarak seçmek veya otomatik eşik tarafından seçilen oosit olmayan parçacıkların seçimini kaldırmak için düzenle sekmesini kullanın. İşiniz bittiğinde, daha fazla analiz için verileri genel sekmesinin altındaki istatistik sekmesine kaydedin. Toplam yumurta sayısını ve hasarlı yumurtalıkları tahmin etmek için, sağlam yumurtalıkların görüntülerini MRS ile açın ve çerçeve özelliğini seçin.Çerçeve ayarlarının altında, kutu ızgarası onay işaretlerini ve erişim etiketlerini seçin. XYZ konumunda sekme, tüm XYZ konumlarında 200 mikrometre boşluklu onay işaretleri oluşturmak için 200 mikrom seçin. 200 mikrometre onay işaretlerini kullanarak, her yumurtalık hacminin% 50'sine giren yumurtaları seçin.Lekeler özelliğine tıklayın ve %50 bölgesine giren yumurtaları renge göre sınıflandırmak için düzenleme etiketlerini seçin. Perfüze edilmemiş ve perfüze edilmiş yumurtalıkların temsili gri tonlamalı, çoklu foton görüntülerinde, primordial foliküllerdeki küçük oositlerin ince sitoplazmik DDX4 boyama tabakası ile görülebilir. Ek olarak, büyüyen foliküllerdeki daha büyük oositler tespit edildi.Prenatal ve postnatal yumurtalıkların çoklu foton görüntülerinden elde edilen 3D render'lar incelendi. Doğum sonrası 28. günde, ışınlanmamış kontrol dişisinden yumurtalık, ilkel foliküllerde büyük miktarda küçük oosit popülasyonu içeriyordu. Buna karşılık, 0.5 gri gama radyasyonu ile ışınlanmış dişiden yumurtalıklar, birincil foliküllerde küçük oositlerden tamamen yoksundu.Ancak daha büyük oositler hala mevcuttu. Yumurtaların nicelleştirilmesi için MRS yazılımında goucian filtre kullanılarak 3D çoklu foton görüntüleri işlendi ve nokta özelliği kullanılarak küçük ve büyük boyutlu yumurtalar tanımlanarak nicelleştirildi. Daha sonra, oositlerin ortalama yüzdesi, en erken evre E 15.5'te mevcut olan ortalama sayıya kıyasla her aşamada hesaplandı E 15.5 ve E 18.5 arasında keskin bir şekilde azalan oosit sayısı, çoklu foton görüntülerinde görüldüğü gibi bir orf bir P çizgisini ifade etti.Yoğunluk analizi, E 18.5'te oositler başına bir P çizgisinin E 15.5'ten daha yüksek ekspresyonlarını göstermiştir. Küçük hasarlı yumurtalıklar analiz için kullanılabilir. Toplam yumurta sayıları hesaplamalı düzeltme kullanılarak belirlenir.Temsili model, E 15.5 yumurtalıkta G CNA pozitif oositleri, sağlam bir yumurtalıkta vurgulanan% beş 10'luk bir bölge ile göstermektedir. Benzer şekilde, yumurtalığın% 50'sine kadar% 10'luk artımlı bölgelerin eksik olduğu simüle edilmiş bir yumurtalık üretildi. Toplam oosit sayıları ve simüle edilen yumurtalıklar orijinal sağlam yumurtalıklarla karşılaştırıldı.Ve fark, yüzde sapma olarak sunuldu İyi perfüzyon, iyi görüntü kalitesiyle sonuçlanır. Bu nedenle, PFA'ya geçmeden önce tüm dokuların PBS ile temizlendiğinden emin olun. Ekstra dokuyu keserek yumurtalıkların tamamen açığa çıkmasını sağlayın.Protokol, çok sayıda numunenin verimli bir şekilde analiz edilmesine izin verir, işbirlikçi çapraz veya çeşitlilik çıktısı gibi genetik referans popülasyonlarından elde edilen nicel veriler, oosit gelişiminin ve oosit sayılarının genetik değiştiricilerinin tanımlanmasına yardımcı olacaktır.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Kültür ve Co-Kültür Mouse Yumurtalıklar ve Yumurtalık Foliküller

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Bütün Dağı takas ve Arabidopsis çiçek organ ve Siliques boyama

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Bütün Dağı ayirt ve kültürlü fare yumurtalıklarda folikül miktar

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mouse ovarium olayları görselleştirmek için yumurtalık doku kültürü

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...