Name: single-molecule imaging of ews-fli1 condensates assembling on dna
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).

1. Forberedelse af lipid bilayer master mix
<ol><li>Skyl hætteglas med dobbeltdestilleret vand (ddH2O) og 99% ethanol, og tør dem i en 60 °C tørreovn.</li>
	<li>Lav lipidmasterblandingen ved at opløse 1 g 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 100 mg polyethylenglycol-reagerede (PEGylerede) lipider (18:1 af 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy (polyethylenglycol)-2000] (ammoniumsalt) (PEG2000 DOPE) og 25 mg biotinylerede lipider (18:1 af 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethan...

<ol>
	<li>Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+regulation+of+gene+transcription.">Organization and regulation of gene transcription.</a> Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).</li><li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+regulation+by+histone+methylation:+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails.">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes &amp; Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+ncRNAs+allosterically+modify+RNA-binding+proteins+in+cis+to+inhibit+transcription.">Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription.</a> Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).</li><li>Alexander, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mediates+target+gene+association+with+nuclear+speckles+for+amplified+RNA+expression.">p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).</li><li>Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+required+for+accurate+initiation+of+transcription+by+purified+RNA+polymerase-II.">Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).</li><li>Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+and+3D+genome+conformation+in+cell-fate+decisions.">Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions.</a> Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+and+super-enhancer:+Positive+regulators+in+gene+transcription.">Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription.</a> Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).</li><li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+transcription+factors.">The human transcription factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-nuclear+mobility+and+target+search+mechanisms+of+transcription+factors:+a+single-molecule+perspective+on+gene+expression.">Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).</li><li>Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion-driven+mechanisms+of+protein+translocation+on+nucleic+acids.">Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids.</a> Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).</li><li>Loverdo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hopping+and+jumping+in+facilitated+diffusion+of+DNA-binding+proteins.">Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins.</a> Physical Review Letters. 102 (18), 188101 (2009).</li><li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains.">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li><li>Sabari, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control.">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li><li>Kim, S., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+interplay+between+transcription+factors+and+the+3D+genome.">Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome.</a> Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).</li><li>Shrinivas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+features+that+drive+formation+of+transcriptional+condensates.">Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates.</a> Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+DNA-induced+phase+separation+for+transcriptional+repressor+VRN1.">Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).</li><li>Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+binding+between+distant+transcription+factors+is+a+hallmark+of+active+enhancers.">Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).</li><li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination.">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li><li>Qi, Z., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recombination+intermediates+with+single-stranded+DNA+curtains.">Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains.</a> Methods. 105, 62-74 (2016).</li><li>Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+dynamics+of+human+RPA+and+RAD51+on+ssDNA+during+assembly+and+disassembly+of+the+RAD51+filament.">Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1+alpha+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547, 236-240 (2017).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loci-specific+phase+separation+of+FET+fusion+oncoproteins+promotes+gene+transcription.">Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription.</a> Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+novel+tools+for+imaging+protein-nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+optical+imaging.">DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li><li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+EWS/FLI+regulation+via+GGAA+microsatellites+in+Ewing's+sarcoma.">Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma.</a> Genes &amp; Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).</li><li>Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ETS+family+of+oncogenic+transcription+factors+in+solid+tumours.">The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+tension:+single-molecule+DNA+mechanics.">Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics.</a> Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).</li><li>Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R., Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+dual-trap+optical+tweezers+with+differential+detection.">High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection.</a> Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2008).</li><li>Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+biological+reaction+intermediates+with+DNA+curtains.">Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).</li></ol>

Da enkeltmolekyletilgange er ekstremt følsomme over for indholdet af reaktionssystemet, skal der investeres ekstra indsats for at sikre god kvalitet af alle materialer og opløsninger under DNA-gardinerforsøgene, især lipiderne fremstillet i afsnit 1 og 2 og de buffere, der anvendes i afsnit 5. Reagenser af højere renhed skal anvendes til fremstilling af buffere, og buffere skal være frisklavede til enkeltmolekyleassay
Da 500 nM mCherry-mærket EWS-FLI1 blev skyllet ind i kammeret, dukked...

Transkriptionel regulering er et afgørende skridt for præcis genekspression i levende celler. Mange faktorer, såsom kromosomal modifikation, transkriptionsfaktorer (TF'er) og ikke-kodende RNA'er, deltager i denne komplicerede proces 1,2,3. Blandt disse faktorer bidrager TF'er til specificiteten af transkriptionel regulering ved at genkende og binde til specifikke DNA-sekvenser kendt som promotorer eller forstærkere og efterfølgende rekruttere andre funktionelle proteiner til at aktivere eller undertrykke transkription 4,5,6,7. Hvordan disse TF'er formår at søge efter deres målsteder i det menneskelige genom og interagere med DNA belagt med histoner og ikke-histon-DNA-bindende proteiner har forvirret forskere i årtier. I de sidste par år er flere klassiske modeller til målsøgningsmekanismen for TF'er blevet bygget til at beskrive, hvordan de "glider", "hopper", "hopper" eller "intersegmentoverførsel" langs DNA-kæden 8,9,10,11. Disse modeller er fokuseret på søgeadfærden på DNA'et fra et enkelt TF-molekyle. Nylige undersøgelser viser imidlertid, at nogle TF'er gennemgår væske-væskefaseseparation (LLPS) enten alene i kernen eller med Mediatorkomplekset12. De observerede dråber af TF'er er forbundet med promotor- eller forstærkerregionerne, hvilket fremhæver rollen som biomolekylær kondensatdannelse i transkription og det tredimensionelle genom13,14,15. Disse biomolekylære kondensater er forbundet med membran-manglende rum in vivo og in vitro. De dannes via LLPS, hvor modulære biomakromolekyler og iboende uordnede regioner (IDR'er) af proteiner er to hoveddrivkræfter for multivalente interaktioner16. Således søger TF'er ikke kun DNA, men fungerer også synergistisk inden for disse kondensater 4,17,18. Til dato forbliver den biofysiske egenskab af disse transkriptionskondensater på DNA uklar.
Derfor havde denne undersøgelse til formål at anvende en enkeltmolekylemetode - DNA-gardiner - til direkte at afbilde dannelsen og dynamikken af transkriptionskondensaterne dannet af TF'er på DNA in vitro. DNA Curtains, en high throughput in vitro imaging platform til at studere interaktionen mellem proteiner og DNA, er blevet anvendt i DNA-reparation 19,20,21, målsøgning22 og LLPS17,23,24. Flowcellen af DNA-gardiner er belagt med biotinylerede lipiddobbeltlag for at passivere overfladen og tillade biomolekylerne at diffundere på overfladen. De nanofabrikerede zig-zag-mønstre begrænser bevægelsen af DNA. Biotinylerede Lambda DNA-substrater kan justere langs barrierekanterne og strækkes af den orienterede bufferstrøm. De samme start- og slutsekvenser af alle molekylerne tillader sporing af proteinet på DNA og beskriver positionsfordelingen af bindingsbegivenhederne25,26. Desuden hjælper kombinationen af DNA-gardiner med total intern refleksionsfluorescensmikroskopi (TIRFM) med at minimere baggrundsstøj og detektere signaler på et enkeltmolekyleniveau. DNA Gardiner kan således være en lovende metode til at undersøge dynamikken i transkriptionskondensatdannelse på DNA-motiver. Dette papir beskriver eksemplet på et FUS / EWS / TAF15 (FET) familie fusion oncoprotein, EWS-FLI1, genereret af kromosomal translokation. Lambda DNA indeholdende 25× GGAA - bindingssekvensen af EWS-FLI127- blev brugt som DNA-substrat i DNA Curtains-eksperimenterne til at observere, hvordan EWS-FLI1-molekyler gennemgår LLPS på DNA. Dette manuskript diskuterer den eksperimentelle protokol og dataanalysemetoder i detaljer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>488 nm diodepumped solid-state laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS488LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm diodepumped solid-state laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS561LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Rhawn</td>
			<td>R003215-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated DOPE</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>870273P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>1595C027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating Electra 92</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-PC 5090.02</td>
			<td>The conductive protective coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5139-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z805939-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3013S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Packing Extracts</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MP5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport</td>
			<td>Idex</td>
			<td>N-333-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM Broth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3643-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-2000 DOPE</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880130P-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4%</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-P 649.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 950K, ANISOLE 2%</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-P 672.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime 95B Scientific CMOS camera</td>
			<td>PHOTOMETRICS</td>
			<td>Prime95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica glass slide</td>
			<td>G.Finkenbeiner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-way injection valve</td>
			<td>Idex</td>
			<td>MXP9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S888</td>
			<td>Diluted with ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Pump11 Elite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0146V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Iodide (491/509)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y3601</td>
			<td>Diluted with DMSO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of ews-fli1 condensates assembling on dna

Fusionsgenerne som følge af kromosomtranslokation er fundet i mange solide tumorer eller leukæmi. EWS-FLI1, som tilhører FUS/EWS/TAF15 (FET) familien af fusions-oncoproteiner, er et af de hyppigst involverede fusionsgener i Ewing-sarkom. Disse FET-familiefusionsproteiner har typisk et lavkompleksitetsdomæne (LCD) af FET-protein ved deres N-terminal og et DNA-bindende domæne (DBD) ved deres C-terminal. EWS-FLI1 er blevet bekræftet at danne biomolekylære kondensater på dets målbindende loci på grund af LCD-LCD- og LCD-DBD-interaktioner, og disse kondensater kan rekruttere RNA-polymerase II for at forbedre gentranskription. Hvordan disse kondensater samles på deres bindingssteder er dog stadig uklart. For nylig blev en enkeltmolekyle biofysikmetode - DNA Gardiner - anvendt til at visualisere disse samlingsprocesser af EWS-FLI1 kondensater. Her diskuteres de detaljerede eksperimentelle protokol- og dataanalysemetoder til anvendelse af DNA-gardiner til undersøgelse af de biomolekylære kondensater, der samles på mål-DNA.

Skemaet over DNA-gardiner er vist i figur 1A, figur 1B og figur 1D. Den klonede målsekvens indeholdende 25 uafbrudte gentagelser af GGAA findes i NORB1-promotoren i Ewing-sarkom. Denne målsekvens er afgørende for EWS-FLI1 rekruttering28. EWS-FLI1-molekyler blev visualiseret ved at detektere de mCherry-mærkede EWS-FLI1-signaler opnået med en 561 nm laser (figur 1C og figur 1E...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA at JoVE.com

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Her beskriver vi brugen af enkeltmolekylebilleddannelsesmetoden, DNA Curtains, til at studere den biofysiske mekanisme af EWS-FLI1-kondensater, der samles på DNA.

Enkeltmolekylebilleddannelse af EWS-FLI1-kondensater, der samles på DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Vi leverer et enkelt molekyleassay for at observere faseadskillelsen af transkriptionsfaktorer på DNA Denne teknik muliggør realisering af den dynamiske proces med transkriptionsfaktorer, der samles som en flydende dråbe på DNA. EWS-FL1 er et af de hyppigst involverede fusionsgener i Ewing sarkom tumorigenese. Vores forskning kunne identificere forholdet mellem DNA-motivnummer og EWS-FL1-kondensatdannelse, som er forbundet med en ufrugtbar gentranskription i tumorceller og måske nyttig for prognosen.Denne metode kan anvendes til at studere transkriptionskondensater eller komplekser in vitro, som P53 og MED1. For at forberede en flowcelle med zigzag nanofabrikerede barrierer til et DNA-gardineksperiment skal du forbinde input- og outputrørene i den rigtige retning. Vask derefter flowcellen med 2,5 ml lipidbuffer ved hjælp af to tre milliliter sprøjter, hvilket sikrer, at der ikke er nogen boble i flowcellen.Fjern sprøjten fra udgangen, og injicer en milliliter liposomopløsning tre gange med en fem minutters inkubation mellem hver injektion. Til heling skal du vaske strømningscellen langsomt med 2,5 ml lipidbuffer og inkubere ved stuetemperatur i 30 minutter. Under inkubationen skal du forberede BSA-bufferen som nævnt i tekstmanuskriptet.Efter 30 minutters heling vaskes flowcellen med 2,5 ml BSA-buffer fra udgangssiden. Derefter injiceres 800 mikroliter streptavidinbuffer i flowcellen fra inputsiden i to trin med en 10 minutters inkubation efter hvert trin. Vask derefter flowcellen med 2,5 ml BSA-buffer for at fjerne alle frie streptavidinmolekyler.Fortynd derefter biotin Lambda DNA med klonede motiver ved hjælp af BSA-buffer og injicer det fire gange langsomt med fem minutters intervaller. Under injektionen skal du tænde mikroskopet i det videnskabelige gratis metaloxid halvledersystem. Vask derefter slangen med 10 ml dobbeltdestilleret vand og skyl prismet og slangestikket med vand, 2% flydende kuvetterenser og 99% ethanol.Træk derefter mindst 20 ml af billedbufferen op i en 30 ml sprøjte. Opsæt flowcellen på mikroskoptrinnet, og tilslut den til det mikrofluidiske system. Brug en strømningshastighed på 0,03 ml pr. Minut til at skylle DNA-molekylerne til barrieren i 10 minutter.Sluk derefter for det mikrofluidiske system og inkuber i 30 minutter. med strømmen stoppet, så DNA'et kan diffundere sideværts. For at afbilde EWS-FLI1-kondensdannelsen på DNA-gardiner skal du åbne billedbehandlingssoftwaren og finde og markere positionerne for de ni zigzag-mønstre under lysfelt.Tænd derefter strømmen ved 0,2 ml i minuttet for at plette DNA'et med dobbeltstrenget DNA-farvestof i 10 minutter. Fortynd derefter mCherry EWS-FLI1-proteinet med billedbufferen i en koncentration på 100 nanomol i 100 mikroliter. Læg derefter proteinprøven gennem ventilen med en 100 mikroliter glassprøjte og skift strømningshastigheden til 0,4 ml pr. Minut.Efter at have tændt 488 nanometer laser pre-scanning hver region for at kontrollere DNA-distributionstilstanden og vælge det område, hvor DNA-molekylerne fordeler sig jævnt. Indstil derefter lasereffekten til 10% for 488 nanometer laseren og 20% for 561 nanometer laseren. Og brug effektmåleren til at måle den reelle laserkraft nær prismet.Begynd at erhverve billeder med to sekunders intervaller med både 488 og 561 nanometer lasere samtidigt. Skift derefter ventilen fra manuel tilstand til injektionstilstand for at lade billedbufferen skylle proteinprøven ind i flowcellen efter 60 sekunder. For at fjerne den gratis EWS-FLI1 skal du fortsætte med at vaske flowcellen med billedbufferen i fem minutter med kun 561 nanometer-laseren tændt.Stop derefter strømmen og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Efter 10 minutter skal du tænde for strømmen med 0,4 ml i minuttet for at lade DNA'et strække sig og erhverve billeder med to sekunders intervaller mellem forskellige rammer for at opnå data med høj kapacitet for EWS-FLI1-kondensatdannelse. EWS-FLI1-molekyler blev visualiseret ved at detektere mCherry-mærkede EWS-FLI1-signaler opnået med en 561 nanometer laser.In vitro-dannelsen af EWS-FLI1-kondensat på stedet for de 25 GGAA-gentagelser i DNA-substratet kunne visualiseres direkte. Specificiteten af mCherry EWS-FLI1, der anvendes i DNA-gardiner, blev bekræftet af et elektroforetisk mobilitetsskiftassay ved hjælp af en DNA-skabelon med og uden de 25 GGAA-gentagelser separat. Da EWS-FLI1-koncentrationen blev titreret fra 20 til 500 nanomol, steg EWS-FLI1-intensiteten dramatisk.Mens ændringen i FLI en DBD-intensitet var ubetydelig, når proteinerne blev mættet for at dække GGAA-gentagelserne, hvilket tyder på, at EWS-FLI1 dannede kondensater på DNA. Injektionen skal være meget langsom og blød, så liposomet og DNA'et kan fordele jævnt på flowcellen. Det er vigtigt at udføre MSA for at bekræfte, at en oprenset transkriptionsfaktor specifikt binder med målsekvensen in vitro.Denne teknik giver folk mulighed for at undersøge, om kondensatet vil lette målsøgningen af transkriptionsfaktorer og dets virkning på transkription.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Single-molekyle Super-resolution Imaging af Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat i plasmamembranen med Novel fluorescerende prober

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust og høj overførselshastighed enkelt molekyle Flow strækker Assay gennemførelse for at studere Transport af molekyler langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Enkelt-molekyle Manipulation af G-quadruplexes af magnetiske pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering af proteiner for enkelt molekyle kraft spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion af dynein og Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer til observation af et enkelt molekyle

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

En In Vitro Single-Molecule Imaging Assay til analyse af cap-afhængige oversættelse kinetik

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enkeltmolekyle fluorescens energioverførsel undersøgelse af ribosom proteinsyntese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Et optimeret enkeltmolekyle pull-down assay til kvantificering af proteinfosforylering

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...