Name: single-molecule imaging of ews-fli1 condensates assembling on dna
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).

1. Bereiding van de lipide bilayer master mix
<ol><li>Spoel glazen injectieflacons met dubbel gedestilleerd water (ddH2O) en 99% ethanol en droog ze in een droogoven van 60 °C.</li>
	<li>Maak de lipide master mix door 1 g van 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC), 100 mg polyethyleenglycol-gereageerde (PEGylated) lipiden (18:1 van 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[methoxy (polyethyleenglycol)-2000] (ammoniumzout) (PEG2000 DOPE) en 25 mg biotinyled lipiden (18:1 van 1,2-dioleoyl-sn-glyce...

<ol>
	<li>Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+regulation+of+gene+transcription.">Organization and regulation of gene transcription.</a> Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).</li><li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+regulation+by+histone+methylation:+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails.">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes &amp; Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+ncRNAs+allosterically+modify+RNA-binding+proteins+in+cis+to+inhibit+transcription.">Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription.</a> Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).</li><li>Alexander, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mediates+target+gene+association+with+nuclear+speckles+for+amplified+RNA+expression.">p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).</li><li>Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+required+for+accurate+initiation+of+transcription+by+purified+RNA+polymerase-II.">Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).</li><li>Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+and+3D+genome+conformation+in+cell-fate+decisions.">Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions.</a> Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+and+super-enhancer:+Positive+regulators+in+gene+transcription.">Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription.</a> Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).</li><li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+transcription+factors.">The human transcription factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-nuclear+mobility+and+target+search+mechanisms+of+transcription+factors:+a+single-molecule+perspective+on+gene+expression.">Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).</li><li>Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion-driven+mechanisms+of+protein+translocation+on+nucleic+acids.">Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids.</a> Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).</li><li>Loverdo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hopping+and+jumping+in+facilitated+diffusion+of+DNA-binding+proteins.">Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins.</a> Physical Review Letters. 102 (18), 188101 (2009).</li><li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains.">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li><li>Sabari, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control.">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li><li>Kim, S., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+interplay+between+transcription+factors+and+the+3D+genome.">Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome.</a> Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).</li><li>Shrinivas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+features+that+drive+formation+of+transcriptional+condensates.">Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates.</a> Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+DNA-induced+phase+separation+for+transcriptional+repressor+VRN1.">Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).</li><li>Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+binding+between+distant+transcription+factors+is+a+hallmark+of+active+enhancers.">Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).</li><li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination.">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li><li>Qi, Z., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recombination+intermediates+with+single-stranded+DNA+curtains.">Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains.</a> Methods. 105, 62-74 (2016).</li><li>Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+dynamics+of+human+RPA+and+RAD51+on+ssDNA+during+assembly+and+disassembly+of+the+RAD51+filament.">Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1+alpha+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547, 236-240 (2017).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loci-specific+phase+separation+of+FET+fusion+oncoproteins+promotes+gene+transcription.">Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription.</a> Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+novel+tools+for+imaging+protein-nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+optical+imaging.">DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li><li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+EWS/FLI+regulation+via+GGAA+microsatellites+in+Ewing's+sarcoma.">Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma.</a> Genes &amp; Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).</li><li>Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ETS+family+of+oncogenic+transcription+factors+in+solid+tumours.">The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+tension:+single-molecule+DNA+mechanics.">Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics.</a> Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).</li><li>Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R., Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+dual-trap+optical+tweezers+with+differential+detection.">High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection.</a> Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2008).</li><li>Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+biological+reaction+intermediates+with+DNA+curtains.">Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).</li></ol>

Aangezien benaderingen met één molecuul uiterst gevoelig zijn voor de inhoud van het reactiesysteem, moet extra inspanning worden geleverd om een goede kwaliteit van alle materialen en oplossingen te garanderen tijdens de DNA Curtains-experimenten, met name de lipiden die zijn bereid in secties 1 en 2 en de buffers die in sectie 5 worden gebruikt. Reagentia met een hogere zuiverheidsgraad moeten worden gebruikt om buffers te bereiden en buffers moeten vers worden bereid voor de bepaling met één molecuul
<p class=...

Transcriptionele regulatie is een cruciale stap voor nauwkeurige genexpressie in levende cellen. Veel factoren, zoals chromosomale modificatie, transcriptiefactoren (TF's) en niet-coderende RNA's, nemen deel aan dit gecompliceerde proces 1,2,3. Onder deze factoren dragen TF's bij aan de specificiteit van transcriptionele regulatie door specifieke DNA-sequenties die bekend staan als promotors of versterkers te herkennen en vervolgens andere functionele eiwitten te rekruteren om transcriptie 4,5,6,7 te activeren of te onderdrukken. Hoe deze TF's erin slagen om naar hun doellocaties in het menselijk genoom te zoeken en te interageren met DNA bedekt met histonen en niet-histon DNA-bindende eiwitten, heeft wetenschappers decennialang verbijsterd. In de afgelopen jaren zijn verschillende klassieke modellen voor het doelzoekmechanisme van TF's gebouwd om te beschrijven hoe ze "schuiven", "hoppen", "springen" of "intersegmentoverdracht" langs de DNA-keten 8,9,10,11. Deze modellen zijn gericht op het zoekgedrag op het DNA van één enkel TF-molecuul. Recente studies tonen echter aan dat sommige TF's vloeistof-vloeistoffasescheiding (LLPS) ondergaan, hetzij alleen in de kern, hetzij met het Mediator-complex12. De waargenomen druppeltjes van TF's zijn geassocieerd met de promotor- of enhancerregio's, wat de rol van biomoleculaire condensaatvorming in transcriptie en het driedimensionale genoom 13,14,15 benadrukt. Deze biomoleculaire condensaten zijn gekoppeld aan membraan-ontbrekende compartimenten in vivo en in vitro. Ze worden gevormd via LLPS, waarbij modulaire biomacromolecules en intrinsiek ongeordende regio's (IDR's) van eiwitten twee belangrijke drijvende krachten zijn van multivalente interacties16. Tf's zoeken dus niet alleen DNA, maar functioneren ook synergetisch binnen deze condensaten 4,17,18. Tot op heden blijft de biofysische eigenschap van deze transcriptiecondensaten op DNA onduidelijk.
Daarom was deze studie gericht op het toepassen van een single-molecule methode - DNA Curtains - om de vorming en dynamiek van de transcriptiecondensaten gevormd door TF's op DNA in vitro direct in beeld te brengen. DNA Curtains, een high-throughput in vitro beeldvormingsplatform om de interactie tussen eiwitten en DNA te bestuderen, is toegepast in DNA-reparatie 19,20,21, target search22 en LLPS 17,23,24. De flowcel van DNA Curtains is bedekt met gebiotinyleerde lipide bilayers om het oppervlak te passiveren en de biomoleculen op het oppervlak te laten diffunderen. De nanogefabriceerde zigzagpatronen beperken de beweging van DNA. Gebiotinyleerde Lambda DNA-substraten kunnen langs de barrièreranden worden uitgelijnd en worden uitgerekt door de georiënteerde bufferstroom. Dezelfde begin- en eindsequenties van alle moleculen maken het mogelijk om het eiwit op DNA te volgen en beschrijven de positieverdeling van de bindingsgebeurtenissen25,26. Bovendien helpt de combinatie van DNA-gordijnen met totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM) de achtergrondruis te minimaliseren en signalen op één molecuulniveau te detecteren. DNA Curtains zou dus een veelbelovende methode kunnen zijn om de dynamiek van transcriptiecondensaatvorming op DNA-motieven te onderzoeken. Dit artikel beschrijft het voorbeeld van een FUS/EWS/TAF15 (FET) familiefusie oncoproteïne, EWS-FLI1, gegenereerd door chromosomale translocatie. Lambda-DNA met 25× GGAA - de bindingssequentie van EWS-FLI127 - werd gebruikt als dna-substraat in de DNA Curtains-experimenten om te observeren hoe EWS-FLI1-moleculen LLPS ondergaan op DNA. Dit manuscript bespreekt het experimentele protocol en de methoden voor gegevensanalyse in detail.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>488 nm diodepumped solid-state laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS488LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm diodepumped solid-state laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS561LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Rhawn</td>
			<td>R003215-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated DOPE</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>870273P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>1595C027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating Electra 92</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-PC 5090.02</td>
			<td>The conductive protective coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5139-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z805939-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3013S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Packing Extracts</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MP5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport</td>
			<td>Idex</td>
			<td>N-333-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM Broth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3643-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-2000 DOPE</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880130P-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4%</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-P 649.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 950K, ANISOLE 2%</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-P 672.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime 95B Scientific CMOS camera</td>
			<td>PHOTOMETRICS</td>
			<td>Prime95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica glass slide</td>
			<td>G.Finkenbeiner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-way injection valve</td>
			<td>Idex</td>
			<td>MXP9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S888</td>
			<td>Diluted with ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Pump11 Elite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0146V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Iodide (491/509)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y3601</td>
			<td>Diluted with DMSO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of ews-fli1 condensates assembling on dna

De fusiegenen die het gevolg zijn van chromosomale translocatie zijn gevonden in veel solide tumoren of leukemie. EWS-FLI1, dat behoort tot de FUS/EWS/TAF15 (FET) familie van fusie-oncoproteïnen, is een van de meest betrokken fusiegenen in Ewing-sarcoom. Deze FET-familie fusie-eiwitten herbergen meestal een laagcomplex domein (LCD) van FET-eiwit op hun N-terminus en een DNA-bindend domein (DBD) op hun C-terminus. Ews-FLI1 is bevestigd biomoleculaire condensaten te vormen op zijn doelbindingsloci als gevolg van LCD-LCD- en LCD-DBD-interacties, en deze condensaten kunnen RNA-polymerase II rekruteren om de gentranscriptie te verbeteren. Hoe deze condensaten op hun bindingsplaatsen worden geassembleerd, blijft echter onduidelijk. Onlangs werd een biofysicamethode met één molecuul - DNA Curtains - toegepast om deze assemblageprocessen van EWS-FLI1-condensaten te visualiseren. Hier worden de gedetailleerde experimentele protocol- en data-analysebenaderingen besproken voor de toepassing van DNA-gordijnen bij het bestuderen van de biomoleculaire condensaten die zich op doel-DNA assembleren.

Het schema van DNA-gordijnen wordt weergegeven in figuur 1A, figuur 1B en figuur 1D. De gekloonde doelsequentie met 25 ononderbroken herhalingen van GGAA wordt gevonden in de NORB1-promotor in Ewing-sarcoom. Deze doelvolgorde is cruciaal voor EWS-FLI1 recruitment28. EWS-FLI1-moleculen werden gevisualiseerd door de mCherry-gelabelde EWS-FLI1-signalen te detecteren die werden verkregen met een 561 nm-l...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA at JoVE.com

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Hier beschrijven we het gebruik van de single-molecule beeldvormingsmethode, DNA Curtains, om het biofysische mechanisme van EWS-FLI1-condensaten te bestuderen die zich op DNA assembleren.

Single-molecule Imaging van EWS-FLI1 condensaten assembleren op DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

We bieden een enkele molecuultest om de fasescheiding van transcriptiefactoren op DNA te observeren Deze techniek maakt realtime realisatie mogelijk van het dynamische proces van transcriptiefactoren die zich assembleren als een vloeibare druppel op DNA. EWS-FL1 is een van de meest betrokken fusiegenen bij Ewing-sarcoomtumorigenese. Ons onderzoek zou de relatie tussen DNA-motiefnummer en EWS-FL1-condensaatvorming kunnen identificeren die geassocieerd is met een kale gentranscriptie in tumorcellen, en misschien nuttig is voor de prognose.Deze methode kan worden toegepast om transcriptiecondensaten of complexen in vitro te bestuderen, zoals P53 en MED1. Om een stroomcel met zigzag nano gefabriceerde barrières voor te bereiden voor een DNA-gordijnexperiment, sluit u de invoer- en uitvoerbuizen in de juiste richting aan. Was vervolgens de stroomcel met 2,5 milliliter lipidenbuffer met behulp van twee spuiten van drie milliliter, zodat er geen bel in de stroomcel is.Verwijder de spuit uit de uitgang en injecteer driemaal één milliliter van de liposoomoplossing met een incubatie van vijf minuten tussen elke injectie. Voor genezing, spoel de stroomcel langzaam opnieuw met 2,5 milliliter lipidenbuffer en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Bereid tijdens de incubatie de BSA-buffer voor zoals vermeld in het tekstmanuscript.Was vervolgens na 30 minuten genezing de stroomcel met 2,5 milliliter BSA-buffer vanaf de uitvoerzijde. Injecteer vervolgens 800 microliter streptavidinbuffer in de stroomcel vanaf de invoerzijde in twee stappen met een incubatie van 10 minuten na elke stap. Was vervolgens de stroomcel met 2,5 milliliter BSA-buffer om alle vrije streptavidinmoleculen te verwijderen.Verdun vervolgens het biotine Lambda-DNA met gekloonde motieven met behulp van BSA-buffer en injecteer het vier keer langzaam met intervallen van vijf minuten. Schakel tijdens de injectie de microscoop in het wetenschappelijke complementaire metaaloxide halfgeleidersysteem in. Was vervolgens de slang met 10 milliliter dubbel gedestilleerd water en spoel het prisma en de buisconnector af met water, 2% vloeibare cuvettereiniger en 99% ethanol.Trek vervolgens ten minste 20 milliliter van de beeldvormingsbuffer op in een spuit van 30 milliliter. Stel de stroomcel in op het microscoopstadium en sluit deze aan op het microfluïdische systeem. Gebruik een stroomsnelheid van 0,03 milliliter per minuut om de DNA-moleculen gedurende 10 minuten naar de barrière te spoelen.Schakel vervolgens het microfluïdische systeem uit en incubeer gedurende 30 minuten. met de stroom gestopt, waardoor het DNA lateraal kon diffunderen. Om de EWS-FLI1-condensatievorming op DNA-gordijnen in beeld te brengen, opent u de beeldvormingssoftware en zoekt en markeert u de posities van de negen zigzagpatronen onder een helder veld.Schakel vervolgens de stroom in met 0,2 milliliter per minuut om het DNA gedurende 10 minuten te kleuren met dubbelstrengs DNA-kleurstof. Verdun vervolgens het mCherry EWS-FLI1-eiwit met de beeldvormingsbuffer in een concentratie van 100 nanomol in 100 microliter. Laad vervolgens het eiwitmonster door de klep met een glazen spuit van 100 microliter en verander het debiet in 0,4 milliliter per minuut.Na het inschakelen van de 488 nanometer laser pre-scan elk gebied om de DNA-distributietoestand te controleren en het gebied te selecteren waarin de DNA-moleculen gelijkmatig verdelen. Stel vervolgens het laservermogen in op 10% voor de 488 nanometer laser en 20% voor de 561 nanometer laser. En meet met behulp van de vermogensmeter het echte laservermogen in de buurt van het prisma.Begin met het verkrijgen van beelden met intervallen van twee seconden met zowel 488 als 561 nanometer lasers tegelijkertijd. Verander vervolgens de klep van de handmatige modus naar de injectiemodus om de beeldvormingsbuffer het eiwitmonster na 60 seconden in de stroomcel te laten spoelen. Om de vrije EWS-FLI1 te verwijderen, blijft u de stroomcel met de beeldbuffer gedurende vijf minuten wassen met alleen de 561 nanometer laser ingeschakeld.Stop vervolgens de stroom en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Schakel na 10 minuten de stroom in met 0,4 milliliter per minuut om het DNA uit te breiden en beelden te verkrijgen met intervallen van twee seconden tussen verschillende frames om gegevens met hoge doorvoer van EWS-FLI1-condensaatvorming te verkrijgen. EWS-FLI1-moleculen werden gevisualiseerd door de mCherry-gelabelde EWS-FLI1-signalen te detecteren die werden verkregen met een 561 nanometer laser.De in vitro vorming van EWS-FLI1 condensaat op de plaats van de 25 GGAA herhalingen in het DNA substraat kon direct worden gevisualiseerd. De specificiteit van de mCherry EWS-FLI1 die in DNA-gordijnen wordt gebruikt, werd bevestigd door een elektroforetische mobiliteitsverschuivingstest met behulp van een DNA-sjabloon met en zonder de 25 GGAA-herhalingen afzonderlijk. Toen de EWS-FLI1-concentratie werd getitreerd van 20 tot 500 nanomol nam de EWS-FLI1-intensiteit dramatisch toe.Terwijl de verandering in de FLI één DBD-intensiteit verwaarloosbaar was wanneer de eiwitten verzadigd waren om de GGAA-herhalingen te bedekken, wat suggereert dat EWS-FLI1 condensaten op DNA vormde. De injectie moet zeer langzaam en zacht zijn, zodat het liposoom en DNA zich gelijkmatig over de stroomcel kunnen verdelen. Het is belangrijk om MSA uit te voeren om te bevestigen dat een gezuiverde transcriptiefactor specifiek bindt met de doelsequentie in vitro.Deze techniek stelt mensen in staat om te onderzoeken of het condensaat het zoeken naar transcriptiefactoren en het effect ervan op transcriptie zal vergemakkelijken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Single-molecule Super-resolutie beeldvorming van fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat in het plasmamembraan met Novel Fluorescerende Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Een eenvoudige, robuuste en hoge doorvoer enkel molecuul Flow uitrekkende Assay uitvoering voor de studie van vervoer van moleculen langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Single-molecuul manipulatie van G-quadruplexes door magnetische pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Een in vitro single-molecule imaging assay voor de analyse van cap-afhankelijke vertaalkinetiek

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study van ribosoom eiwitsynthese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Een geoptimaliseerde single-molecule pull-down test voor kwantificering van eiwitfosforylering

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...