Name: single-molecule imaging of ews-fli1 condensates assembling on dna
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00
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Diese Arbeit wurde von NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.) unterstützt.

1. Herstellung der Lipiddoppelschicht-Mastermischung
<ol><li>Glasfläschchen mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) und 99% Ethanol spülen und im 60 °C heißen Trockenofen trocknen.</li>
	<li>Die Lipid-Mastermischung wird hergestellt, indem 1 g 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 100 mg Polyethylenglykol-umgesetzte (PEGylierte) Lipide (18:1 von 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy (polyethylenglycol)-2000] (Ammoniumsalz) (PEG2000 DOPE) und 25 mg biotinylierte Lipide (18:1 v...

<ol>
	<li>Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+regulation+of+gene+transcription.">Organization and regulation of gene transcription.</a> Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).</li><li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+regulation+by+histone+methylation:+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails.">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes &amp; Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+ncRNAs+allosterically+modify+RNA-binding+proteins+in+cis+to+inhibit+transcription.">Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription.</a> Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).</li><li>Alexander, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mediates+target+gene+association+with+nuclear+speckles+for+amplified+RNA+expression.">p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).</li><li>Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+required+for+accurate+initiation+of+transcription+by+purified+RNA+polymerase-II.">Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).</li><li>Stadhouders, R., Filion, G. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+transcription+factors.">The human transcription factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-nuclear+mobility+and+target+search+mechanisms+of+transcription+factors:+a+single-molecule+perspective+on+gene+expression.">Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).</li><li>Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control.">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li><li>Kim, S., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+interplay+between+transcription+factors+and+the+3D+genome.">Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome.</a> Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).</li><li>Shrinivas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+features+that+drive+formation+of+transcriptional+condensates.">Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates.</a> Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+DNA-induced+phase+separation+for+transcriptional+repressor+VRN1.">Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).</li><li>Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+binding+between+distant+transcription+factors+is+a+hallmark+of+active+enhancers.">Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).</li><li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination.">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li><li>Qi, Z., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recombination+intermediates+with+single-stranded+DNA+curtains.">Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains.</a> Methods. 105, 62-74 (2016).</li><li>Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+dynamics+of+human+RPA+and+RAD51+on+ssDNA+during+assembly+and+disassembly+of+the+RAD51+filament.">Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1+alpha+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547, 236-240 (2017).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loci-specific+phase+separation+of+FET+fusion+oncoproteins+promotes+gene+transcription.">Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription.</a> Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+novel+tools+for+imaging+protein-nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+optical+imaging.">DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li><li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+EWS/FLI+regulation+via+GGAA+microsatellites+in+Ewing's+sarcoma.">Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma.</a> Genes &amp; Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).</li><li>Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ETS+family+of+oncogenic+transcription+factors+in+solid+tumours.">The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+tension:+single-molecule+DNA+mechanics.">Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics.</a> Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).</li><li>Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R., Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+dual-trap+optical+tweezers+with+differential+detection.">High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection.</a> Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2008).</li><li>Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+biological+reaction+intermediates+with+DNA+curtains.">Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).</li></ol>

Da Einzelmolekülansätze extrem empfindlich auf den Inhalt des Reaktionssystems reagieren, müssen zusätzliche Anstrengungen unternommen werden, um eine gute Qualität aller Materialien und Lösungen während der DNA-Vorhangexperimente zu gewährleisten, insbesondere der in den Abschnitten 1 und 2 hergestellten Lipide und der in Abschnitt 5 verwendeten Puffer. Zur Herstellung von Puffern müssen Reagenzien höherer Reinheit verwendet werden, und Puffer müssen frisch für den Einzelmolekültest vorbereitet werden.
...

Die transkriptionelle Regulation ist ein entscheidender Schritt für eine präzise Genexpression in lebenden Zellen. Viele Faktoren, wie chromosomale Modifikation, Transkriptionsfaktoren (TFs) und nicht-kodierende RNAs, sind an diesem komplizierten Prozess beteiligt 1,2,3. Unter diesen Faktoren tragen TFs zur Spezifität der Transkriptionsregulation bei, indem sie spezifische DNA-Sequenzen, die als Promotoren oder Enhancer bekannt sind, erkennen und daran binden und anschließend andere funktionelle Proteine rekrutieren, um die Transkription zu aktivieren oder zu unterdrücken 4,5,6,7. Wie diese TFs es schaffen, nach ihren Zielstellen im menschlichen Genom zu suchen und mit DNA zu interagieren, die mit Histonen und nicht-histon-DNA-bindenden Proteinen beschichtet ist, hat Wissenschaftler seit Jahrzehnten verblüfft. In den letzten Jahren wurden mehrere klassische Modelle für den Zielsuchmechanismus von TFs entwickelt, um zu beschreiben, wie sie entlang derDNA-Kette 8,9,10,11 "gleiten", "hüpfen", "springen" oder "intersegmentieren". Diese Modelle konzentrieren sich auf das Suchverhalten auf der DNA eines einzelnen TF-Moleküls. Neuere Studien zeigen jedoch, dass einige TFs entweder allein im Zellkern oder mit dem Mediator-Komplex12 einer Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) unterzogen werden. Die beobachteten Tröpfchen von TFs sind mit den Promotor- oder Enhancerregionen assoziiert, was die Rolle der biomolekularen Kondensatbildung bei der Transkription und dem dreidimensionalen Genomunterstreicht 13,14,15. Diese biomolekularen Kondensate sind in vivo und in vitro mit membranfehlenden Kompartimenten verbunden. Sie werden über LLPS gebildet, in dem modulare Biomakromoleküle und intrinsisch ungeordnete Regionen (IDRs) von Proteinen zwei Hauptantriebskräfte multivalenter Wechselwirkungen sind16. Somit suchen TFs nicht nur DNA, sondern funktionieren auch synergistisch innerhalb dieser Kondensate 4,17,18. Bis heute ist die biophysikalische Eigenschaft dieser Transkriptionskondensate auf DNA unklar.
Daher zielte diese Studie darauf ab, eine Einzelmolekülmethode - DNA-Vorhänge - anzuwenden, um die Bildung und Dynamik der von TFs gebildeten Transkriptionskondensate auf DNA in vitro direkt abzubilden. DNA Curtains, eine Hochdurchsatz-In-vitro-Bildgebungsplattform zur Untersuchung der Interaktion zwischen Proteinen und DNA, wurde bei der DNA-Reparatur 19,20,21, der Zielsuche22 und LLPS 17,23,24 eingesetzt. Die Flusszelle von DNA Curtains ist mit biotinylierten Lipiddoppelschichten beschichtet, um die Oberfläche zu passivieren und die Biomoleküle auf der Oberfläche diffundieren zu lassen. Die nanofabrizierten Zick-Zack-Muster begrenzen die Bewegung der DNA. Biotinylierte Lambda-DNA-Substrate können sich entlang der Barrierekanten ausrichten und durch den orientierten Pufferfluss gedehnt werden. Die gleichen Start- und Endsequenzen aller Moleküle erlauben die Verfolgung des Proteins auf der DNA und beschreiben die Positionsverteilung der Bindungsereignisse25,26. Darüber hinaus trägt die Kombination von DNA-Vorhängen mit Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) dazu bei, das Hintergrundrauschen zu minimieren und Signale auf Einzelmolekülebene zu detektieren. Daher könnten DNA-Vorhänge eine vielversprechende Methode sein, um die Dynamik der Transkriptionskondensatbildung an DNA-Motiven zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt das Beispiel eines Fusionsonkoproteins der FUS/EWS/TAF15 (FET)-Familie, EWS-FLI1, das durch chromosomale Translokation erzeugt wird. Lambda-DNA mit 25× GGAA - der Bindungssequenz von EWS-FLI127 - wurde als DNA-Substrat in den DNA-Vorhangexperimenten verwendet, um zu beobachten, wie EWS-FLI1-Moleküle LLPS auf DNA durchlaufen. Dieses Manuskript diskutiert das experimentelle Protokoll und die Methoden der Datenanalyse im Detail.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>488 nm diodepumped solid-state laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS488LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm diodepumped solid-state laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS561LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Rhawn</td>
			<td>R003215-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated DOPE</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>870273P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>1595C027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating Electra 92</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-PC 5090.02</td>
			<td>The conductive protective coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5139-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z805939-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3013S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Packing Extracts</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MP5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport</td>
			<td>Idex</td>
			<td>N-333-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM Broth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3643-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-2000 DOPE</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880130P-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4%</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-P 649.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 950K, ANISOLE 2%</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-P 672.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime 95B Scientific CMOS camera</td>
			<td>PHOTOMETRICS</td>
			<td>Prime95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica glass slide</td>
			<td>G.Finkenbeiner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-way injection valve</td>
			<td>Idex</td>
			<td>MXP9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S888</td>
			<td>Diluted with ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Pump11 Elite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0146V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Iodide (491/509)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y3601</td>
			<td>Diluted with DMSO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of ews-fli1 condensates assembling on dna

Die Fusionsgene, die aus der chromosomalen Translokation resultieren, wurden in vielen soliden Tumoren oder Leukämien gefunden. EWS-FLI1, das zur FUS/EWS/TAF15 (FET)-Familie von Fusionsonkoproteinen gehört, ist eines der am häufigsten beteiligten Fusionsgene beim Ewing-Sarkom. Diese Fusionsproteine der FET-Familie beherbergen typischerweise eine Low-Complexity-Domäne (LCD) des FET-Proteins an ihrem N-Terminus und eine DNA-bindende Domäne (DBD) an ihrem C-Terminus. Es wurde bestätigt, dass EWS-FLI1 aufgrund von LCD-LCD- und LCD-DBD-Wechselwirkungen biomolekulare Kondensate an seinen Zielbindungsstellen bildet, und diese Kondensate können RNA-Polymerase II rekrutieren, um die Gentranskription zu verbessern. Wie diese Kondensate an ihren Bindungsstellen zusammengesetzt werden, bleibt jedoch unklar. Kürzlich wurde eine Einzelmolekül-Biophysik-Methode - DNA Curtains - angewendet, um diese Montageprozesse von EWS-FLI1-Kondensaten zu visualisieren. Hier werden die detaillierten experimentellen Protokoll- und Datenanalyseansätze für die Anwendung von DNA-Vorhängen bei der Untersuchung der biomolekularen Kondensate diskutiert, die sich auf Ziel-DNA ansammeln.

Das Schema der DNA-Vorhänge ist in Abbildung 1A, Abbildung 1B und Abbildung 1D dargestellt. Die klonierte Zielsequenz mit 25 ununterbrochenen Wiederholungen von GGAA befindet sich im NORB1-Promotor des Ewing-Sarkoms. Diese Zielsequenz ist entscheidend für die EWS-FLI1-Rekrutierung28. EWS-FLI1-Moleküle wurden durch Detektion der mCherry-markierten EWS-FLI1-Signale visualisiert, die mit einem 561-nm...

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Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Hier beschreiben wir die Verwendung der Einzelmolekül-Bildgebungsmethode DNA Curtains, um den biophysikalischen Mechanismus von EWS-FLI1-Kondensaten zu untersuchen, die sich auf DNA ansammeln.

Einzelmolekül-Bildgebung von EWS-FLI1-Kondensaten auf DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Wir bieten einen Einzelmolekül-Assay an, um die Phasentrennung von Transkriptionsfaktoren auf DNA zu beobachten Diese Technik ermöglicht die Echtzeitrealisierung des dynamischen Prozesses von Transkriptionsfaktoren, die sich als flüssiges Tröpfchen auf DNA zusammensetzen. EWS-FL1 ist eines der am häufigsten beteiligten Fusionsgene bei der Tumorgenese des Ewing-Sarkoms. Unsere Forschung konnte den Zusammenhang zwischen der DNA-Motivzahl und der EWS-FL1-Kondensatbildung identifizieren, die mit einer unfruchtbaren Gentranskription in Tumorzellen assoziiert ist und für die Prognose hilfreich sein kann.Diese Methode könnte angewendet werden, um alle Transkriptionskondensate oder -komplexe in vitro wie P53 und MED1 zu untersuchen. Um eine Flusszelle mit Zickzack-Nanobarrieren für ein DNA-Vorhangexperiment vorzubereiten, verbinden Sie die Eingangs- und Ausgangsröhren in die richtige Richtung. Dann waschen Sie die Durchflusszelle mit 2,5 Milliliter Lipidpuffer mit zwei Drei-Milliliter-Spritzen, um sicherzustellen, dass sich keine Blase in der Durchflusszelle befindet.Nehmen Sie die Spritze aus dem Ausgang und injizieren Sie dreimal einen Milliliter der Liposomenlösung mit einer fünfminütigen Inkubation zwischen jeder Injektion. Zur Heilung die Flusszelle mit 2,5 Milliliter Lipidpuffer langsam erneut waschen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Bereiten Sie während der Inkubation den BSA-Puffer wie im Textmanuskript erwähnt vor.Nach 30 Minuten Heilung waschen Sie die Durchflusszelle mit 2,5 Milliliter BSA-Puffer von der Ausgangsseite. Als nächstes injizieren Sie 800 Mikroliter Streptavidinpuffer in zwei Schritten von der Eingangsseite in die Durchflusszelle mit einer 10-minütigen Inkubation nach jedem Schritt. Dann waschen Sie die Durchflusszelle mit 2,5 Milliliter BSA-Puffer, um alle freien Streptavidinmoleküle zu entfernen.Als nächstes verdünnen Sie die Biotin-Lambda-DNA mit geklonten Motiven unter Verwendung von BSA-Puffer und injizieren Sie sie viermal langsam in Fünf-Minuten-Abständen. Schalten Sie während der Injektion das Mikroskop im wissenschaftlichen komplementären Metalloxid-Halbleitersystem ein. Dann waschen Sie den Schlauch mit 10 Milliliter doppelt destilliertem Wasser und spülen Sie das Prisma und den Schlauchanschluss mit Wasser, 2% flüssigem Küvettenreiniger und 99% Ethanol.Als nächstes ziehen Sie mindestens 20 Milliliter des Bildgebungspuffers in eine 30-Milliliter-Spritze. Stellen Sie die Durchflusszelle auf dem Mikroskoptisch auf und verbinden Sie sie mit dem mikrofluidischen System. Mit einer Flussrate von 0,03 Milliliter pro Minute spülen Sie die DNA-Moleküle 10 Minuten lang zur Barriere.Schalten Sie dann das mikrofluidische System aus und inkubieren Sie für 30 Minuten. mit dem Fluss gestoppt, so dass die DNA seitlich diffundieren kann. Um die EWS-FLI1-Kondensationsbildung auf DNA-Vorhängen abzubilden, öffnen Sie die Bildgebungssoftware und suchen und markieren Sie die Positionen der neun Zickzackmuster unter Hellfeld.Schalten Sie dann den Fluss bei 0,2 Milliliter pro Minute ein, um die DNA 10 Minuten lang mit doppelsträngigem DNA-Farbstoff zu färben. Als nächstes verdünnen Sie das mCherry EWS-FLI1-Protein mit dem Bildgebungspuffer in einer Konzentration von 100 Nanomol in 100 Mikrolitern. Laden Sie dann die Proteinprobe mit einer 100-Mikroliter-Glasspritze durch das Ventil und ändern Sie die Durchflussrate auf 0,4 Milliliter pro Minute.Nach dem Einschalten des 488-Nanometer-Lasers scannen Sie jede Region vor, um den DNA-Verteilungszustand zu überprüfen und den Bereich auszuwählen, in dem sich die DNA-Moleküle gleichmäßig verteilen. Stellen Sie dann die Laserleistung auf 10% für den 488-Nanometer-Laser und 20% für den 561-Nanometer-Laser ein. Messen Sie mit dem Leistungsmesser die tatsächliche Laserleistung in der Nähe des Prismas.Beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern im Abstand von zwei Sekunden mit 488- und 561-Nanometer-Lasern gleichzeitig. Ändern Sie dann das Ventil vom manuellen Modus in den Injektionsmodus, damit der Bildgebungspuffer die Proteinprobe nach 60 Sekunden in die Durchflusszelle spülen kann. Um das freie EWS-FLI1 zu entfernen, waschen Sie die Flusszelle fünf Minuten lang mit dem Bildpuffer, wobei nur der 561-Nanometer-Laser eingeschaltet ist.Dann stoppen Sie den Fluss und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Schalten Sie nach 10 Minuten den Fluss mit 0,4 Milliliter pro Minute ein, damit sich die DNA ausdehnen kann, und nehmen Sie Bilder in Zwei-Sekunden-Intervallen zwischen verschiedenen Frames auf, um Hochdurchsatzdaten der EWS-FLI1-Kondensatbildung zu erhalten. EWS-FLI1-Moleküle wurden durch Detektion der mCherry-markierten EWS-FLI1-Signale visualisiert, die mit einem 561-Nanometer-Laser erhalten wurden.Die in vitro Bildung von EWS-FLI1-Kondensat an der Stelle der 25 GGAA-Wiederholungen im DNA-Substrat konnte direkt visualisiert werden. Die Spezifität des in DNA-Vorhängen verwendeten mCherry EWS-FLI1 wurde durch einen elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungstest unter Verwendung einer DNA-Vorlage mit und ohne die 25 GGAA-Wiederholungen separat bestätigt. Wenn die EWS-FLI1-Konzentration von 20 auf 500 Nanomol titriert wurde, stieg die EWS-FLI1-Intensität dramatisch an.Während die Änderung der FLI-DBD-Intensität vernachlässigbar war, wenn die Proteine gesättigt waren, um die GGAA-Wiederholungen abzudecken, deutet dies darauf hin, dass EWS-FLI1 Kondensate auf der DNA bildete. Die Injektion sollte sehr langsam und weich sein, damit sich das Liposom und die DNA gleichmäßig auf der Flusszelle verteilen können. Es ist wichtig, MSA durchzuführen, um zu bestätigen, dass ein gereinigter Transkriptionsfaktor spezifisch an die Zielsequenz in vitro bindet.Diese Technik ermöglicht es zu untersuchen, ob das Kondensat die gezielte Suche nach Transkriptionsfaktoren und seine Wirkung auf die Transkription erleichtert.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Einzelmolekül-Super-Resolution Imaging von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat in der Plasmamembran mit neuartigen Fluoreszenzsonden

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Forschung

Biochemie

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Einfach, Robust und hohen Durchsatz Molekül fließen Stretching Assay-Implementierung für das Studium Transport von Molekülen entlang DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energieübertragungsstudie zur Ribosomenproteinsynthese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...