Name: single-molecule imaging of ews-fli1 condensates assembling on dna
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NSFC מס '31670762 (Z.Q.).

1. הכנת תערובת מאסטר דו-שכבתית של שומנים
<ol><li>שטפו בקבוקוני זכוכית במים מזוקקים פעמיים (ddH2O) ו-99% אתנול וייבשו אותם בתנור ייבוש בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכינו את תערובת השומנים על ידי המסת 1 גרם של 1,2-דיאולאויל-sn-גליצרו-3-פוספוקולין (DOPC), 100 מ"ג של פוליאתילן גליקול מגיב (PEGylated) ליפי...

<ol>
	<li>Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+regulation+of+gene+transcription.">Organization and regulation of gene transcription.</a> Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).</li><li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+regulation+by+histone+methylation:+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails.">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes &amp; Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+ncRNAs+allosterically+modify+RNA-binding+proteins+in+cis+to+inhibit+transcription.">Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription.</a> Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).</li><li>Alexander, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mediates+target+gene+association+with+nuclear+speckles+for+amplified+RNA+expression.">p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).</li><li>Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+required+for+accurate+initiation+of+transcription+by+purified+RNA+polymerase-II.">Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).</li><li>Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+and+3D+genome+conformation+in+cell-fate+decisions.">Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions.</a> Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+and+super-enhancer:+Positive+regulators+in+gene+transcription.">Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription.</a> Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).</li><li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+transcription+factors.">The human transcription factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-nuclear+mobility+and+target+search+mechanisms+of+transcription+factors:+a+single-molecule+perspective+on+gene+expression.">Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).</li><li>Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion-driven+mechanisms+of+protein+translocation+on+nucleic+acids.">Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids.</a> Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).</li><li>Loverdo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hopping+and+jumping+in+facilitated+diffusion+of+DNA-binding+proteins.">Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins.</a> Physical Review Letters. 102 (18), 188101 (2009).</li><li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains.">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li><li>Sabari, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control.">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li><li>Kim, S., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+interplay+between+transcription+factors+and+the+3D+genome.">Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome.</a> Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).</li><li>Shrinivas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+features+that+drive+formation+of+transcriptional+condensates.">Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates.</a> Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+DNA-induced+phase+separation+for+transcriptional+repressor+VRN1.">Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).</li><li>Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+binding+between+distant+transcription+factors+is+a+hallmark+of+active+enhancers.">Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).</li><li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination.">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li><li>Qi, Z., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recombination+intermediates+with+single-stranded+DNA+curtains.">Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains.</a> Methods. 105, 62-74 (2016).</li><li>Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+dynamics+of+human+RPA+and+RAD51+on+ssDNA+during+assembly+and+disassembly+of+the+RAD51+filament.">Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1+alpha+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547, 236-240 (2017).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loci-specific+phase+separation+of+FET+fusion+oncoproteins+promotes+gene+transcription.">Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription.</a> Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+novel+tools+for+imaging+protein-nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+optical+imaging.">DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li><li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+EWS/FLI+regulation+via+GGAA+microsatellites+in+Ewing's+sarcoma.">Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma.</a> Genes &amp; Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).</li><li>Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ETS+family+of+oncogenic+transcription+factors+in+solid+tumours.">The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+tension:+single-molecule+DNA+mechanics.">Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics.</a> Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).</li><li>Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R., Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+dual-trap+optical+tweezers+with+differential+detection.">High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection.</a> Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2008).</li><li>Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+biological+reaction+intermediates+with+DNA+curtains.">Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).</li></ol>

מכיוון שגישות של מולקולה בודדת רגישות ביותר לתכולת מערכת התגובה, יש להשקיע מאמץ נוסף כדי להבטיח איכות טובה של כל החומרים והתמיסות במהלך ניסויי וילונות הדנ"א, במיוחד השומנים שהוכנו בסעיפים 1 ו-2 והמאגרים המשמשים בסעיף 5. יש להשתמש בריאגנטים בעלי טוהר גבוה יותר להכנת חוצצים, ומאגרים חייבים לה...

ויסות שעתוק הוא צעד מכריע לביטוי גנים מדויק בתאים חיים. גורמים רבים, כגון שינוי כרומוזומלי, גורמי שעתוק (TFs) ורנ"א שאינם מקודדים, משתתפים בתהליך מסובך זה 1,2,3. בין גורמים אלה, TFs תורמים לספציפיות של ויסות שעתוק על ידי זיהוי וקשירה לרצפי DNA ספציפיים המכונים מקדמים או משפרים ולאחר מכן גיוס חלבונים פונקציונליים אחרים להפעלה או לדיכוי שעתוק 4,5,6,7. האופן שבו ה-TFs האלה מצליחים לחפש את אתרי המטרה שלהם בגנום האנושי ולתקשר עם דנ"א המצופה בהיסטונים ובחלבונים קושרי דנ"א שאינם היסטון מבלבל מדענים כבר עשרות שנים. בשנים האחרונות נבנו מספר מודלים קלאסיים למנגנון חיפוש המטרה של TFs כדי לתאר כיצד הם "מחליקים", "קופצים", "קופצים" או "מעבירים אינטרסגמנטים" לאורך שרשרת הדנ"א 8,9,10,11. מודלים אלה מתמקדים בהתנהגות החיפוש בדנ"א של מולקולת TF אחת ויחידה. עם זאת, מחקרים אחרונים מראים כי חלק מה-TFs עוברים הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS) לבד בגרעין או עם קומפלקס מתווך12. הטיפות הנצפות של TFs קשורות לאזורי המקדם או המשפר, ומדגישות את התפקיד של היווצרות עיבוי ביומולקולרי בשעתוק ואת הגנום התלת-ממדי13,14,15. עיבויים ביומולקולריים אלה קשורים לתאים חסרי ממברנה in vivo ו- in vitro. הם נוצרים באמצעות LLPS, שבו ביו-מקרומולקולות מודולריות ואזורים בעלי הפרעה פנימית (IDR) של חלבונים הם שני הכוחות המניעים העיקריים של אינטראקציות רב-ערכיות16. לפיכך, TFs לא רק מחפשים דנ"א אלא גם מתפקדים בסינרגיה בתוך עיבוייםאלה 4,17,18. נכון להיום, התכונה הביופיזית של עיבוי שעתוק אלה על דנ"א עדיין אינה ברורה.
לכן, מחקר זה נועד ליישם שיטה של מולקולה בודדת - DNA Curtains - כדי לדמות ישירות את היווצרות ודינמיקה של עיבוי שעתוק שנוצר על ידי TFs על DNA במבחנה. DNA Curtains, פלטפורמת הדמיה במבחנה בתפוקה גבוהה לחקר האינטראקציה בין חלבונים לדנ"א, יושמה בתיקון דנ"א 19,20,21, חיפוש מטרה22, ו- LLPS 17,23,24. תא הזרימה של וילונות הדנ"א מצופה בדו-שכבתי שומנים ביוטיניליים כדי לעבור את פני השטח ולאפשר לביומולקולות להתפזר על פני השטח. תבניות הזיג-זג הננו-מיוצרות מגבילות את תנועת הדנ"א. מצעי דנ"א למבדה שעברו ביוטינילציה יכולים להתיישר לאורך קצוות המחסום ולהימתח על ידי זרימת החיץ המכוון. אותם רצפי התחלה וסיום של כל המולקולות מאפשרים מעקב אחר החלבון בדנ"א ומתארים את התפלגות המיקום של אירועי הקישור25,26. יתר על כן, השילוב של וילונות DNA עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM) מסייע למזער את רעשי הרקע ולזהות אותות ברמה של מולקולה אחת. לפיכך, וילונות דנ"א יכולים להיות שיטה מבטיחה לחקור את הדינמיקה של היווצרות עיבוי שעתוק על מוטיבים של דנ"א. מאמר זה מתאר את הדוגמה של אונקופרוטאין ממשפחת FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, שנוצר על-ידי טרנסלוקציה כרומוזומלית. דנ"א למבדה המכיל 25× GGAA - רצף הקשירה של EWS-FLI127 - שימש כמצע הדנ"א בניסויי DNA Curtains כדי לבחון כיצד מולקולות EWS-FLI1 עוברות LLPS על דנ"א. כתב יד זה דן בפירוט בפרוטוקול הניסויי ובשיטות ניתוח הנתונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>488 nm diodepumped solid-state laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS488LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm diodepumped solid-state laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS561LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Rhawn</td>
			<td>R003215-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated DOPE</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>870273P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>1595C027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating Electra 92</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-PC 5090.02</td>
			<td>The conductive protective coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5139-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z805939-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3013S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Packing Extracts</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MP5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport</td>
			<td>Idex</td>
			<td>N-333-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM Broth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3643-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-2000 DOPE</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880130P-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4%</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-P 649.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 950K, ANISOLE 2%</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-P 672.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime 95B Scientific CMOS camera</td>
			<td>PHOTOMETRICS</td>
			<td>Prime95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica glass slide</td>
			<td>G.Finkenbeiner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-way injection valve</td>
			<td>Idex</td>
			<td>MXP9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S888</td>
			<td>Diluted with ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Pump11 Elite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0146V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Iodide (491/509)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y3601</td>
			<td>Diluted with DMSO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of ews-fli1 condensates assembling on dna

גני האיחוי הנובעים מטרנסלוקציה כרומוזומלית נמצאו בגידולים מוצקים רבים או בלוקמיה. EWS-FLI1, השייך למשפחת אונקופרוטאינים מסוג FUS/EWS/TAF15 (FET), הוא אחד מגני האיחוי המעורבים ביותר בסרקומה ע"ש יואינג. חלבוני היתוך אלה ממשפחת FET מכילים בדרך כלל תחום בעל מורכבות נמוכה (LCD) של חלבון FET ב-N-terminus שלהם ותחום קושר דנ"א (DBD) ב-C-terminus שלהם. EWS-FLI1 אושר כיוצר עיבוי ביומולקולרי במוקדי הקישור שלו עקב אינטראקציות LCD-LCD ו-LCD-DBD, ועיבויים אלה יכולים לגייס RNA פולימראז II כדי לשפר את שעתוק הגנים. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד מרכיבים עיבויים אלה באתרי הכריכה שלהם. לאחרונה, שיטת ביופיזיקה של מולקולה אחת - DNA Curtains - יושמה כדי לדמיין את תהליכי ההרכבה האלה של עיבוי EWS-FLI1. כאן נדון פרוטוקול הניסוי המפורט וגישות ניתוח הנתונים ליישום וילונות דנ"א בחקר המעבים הביומולקולריים המרכיבים על דנ"א המטרה.

הסכימה של וילונות דנ"א מוצגת באיור 1A, איור 1B ואיור 1D. רצף המטרה המשוכפל המכיל 25 חזרות רצופות של GGAA נמצא במקדם NORB1 בסרקומה ע"ש יואינג. רצף יעדים זה הוא קריטי לגיוס EWS-FLI128. מולקולות EWS-FLI1 הודגמו על-ידי זיהוי אותות EWS-FLI1 בעלי תווית m...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA at JoVE.com

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

במאמר זה נתאר את השימוש בשיטת ההדמיה של מולקולה בודדת, DNA Curtains, כדי לחקור את המנגנון הביופיזי של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על דנ"א.

הדמיה של מולקולה בודדת של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

אנו מספקים בדיקה של מולקולה בודדת כדי לבחון את הפרדת הפאזה של גורמי שעתוק על DNA טכניקה זו מאפשרת מימוש בזמן אמת של התהליך הדינמי של גורמי שעתוק המורכבים כטיפה נוזלית על הדנ"א. EWS-FL1 הוא אחד מגני האיחוי המעורבים ביותר בגידולי סרקומה ע"ש יואינג. המחקר שלנו יכול לזהות את הקשר בין מספר מוטיב הדנ"א לבין היווצרות עיבוי EWS-FL1 הקשור לתעתוק גנים עקרים בתאי הגידול, ואולי מועיל לפרוגנוזה.ניתן ליישם שיטה זו כדי לחקור כל עיבוי שעתוק או קומפלקסים במבחנה, כמו P53 ו- MED1. כדי להכין תא זרימה עם מחסומים מפוברקים של ננו-זיגזג לניסוי וילון DNA, חברו את צינורות הקלט והפלט בכיוון הנכון. לאחר מכן לשטוף את תא הזרימה עם 2.5 מיליליטר של מאגר שומנים באמצעות שני מזרקים שלושה מיליליטר, להבטיח שאין בועה בתא הזרימה.מוציאים את המזרק מהפלט ומזריקים מיליליטר אחד מתמיסת הליפוזום שלוש פעמים עם דגירה של חמש דקות בין כל הזרקה. לריפוי, שטפו מחדש את תא הזרימה עם 2.5 מיליליטר של חיץ שומנים באיטיות, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. במהלך הדגירה, הכינו את חיץ BSA כפי שצוין בכתב היד של הטקסט.לאחר מכן לאחר 30 דקות של ריפוי, לשטוף את תא הזרימה עם 2.5 מיליליטר של חיץ BSA מצד הפלט. לאחר מכן, להזריק 800 microliters של חיץ streptavidin לתוך תא הזרימה מצד הקלט בשני שלבים עם דגירה של 10 דקות לאחר כל צעד. לאחר מכן לשטוף את תא הזרימה עם 2.5 מיליליטר של חיץ BSA כדי להסיר את כל מולקולות streptavidin חינם.לאחר מכן, דללו את הדנ"א של ביוטין למבדה עם מוטיבים משובטים באמצעות חיץ BSA והזריקו אותו ארבע פעמים באיטיות במרווחים של חמש דקות. במהלך ההזרקה, הפעל את המיקרוסקופ במערכת המוליכים למחצה המדעית המשלים של תחמוצת המתכת. לאחר מכן שטפו את הצינורות עם 10 מיליליטר מים מזוקקים כפולים ושטפו את המנסרה ואת מחבר הצינורות במים, 2% מנקה קובט נוזלי ו-99% אתנול.לאחר מכן, לשאוב לפחות 20 מיליליטר של מאגר הדמיה לתוך מזרק 30 מיליליטר. הניחו את תא הזרימה על במת המיקרוסקופ וחברו אותו למערכת המיקרופלואידית. באמצעות קצב זרימה של 0.03 מיליליטר לדקה, לשטוף את מולקולות הדנ"א למחסום במשך 10 דקות.לאחר מכן לכבות את המערכת microfluidic לדגור במשך 30 דקות. כאשר הזרימה נעצרת, ומאפשרת לדנ"א להתפזר לרוחב. כדי לדמות את היווצרות העיבוי EWS-FLI1 על וילונות DNA, פתח את תוכנת ההדמיה ומצא וסמן את מיקומן של תשע תבניות הזיגזג תחת שדה בהיר.לאחר מכן הפעל את הזרימה ב 0.2 מיליליטר לדקה כדי להכתים את הדנ"א עם צבע DNA דו-גדילי במשך 10 דקות. לאחר מכן, דללו את החלבון mCherry EWS-FLI1 עם מאגר ההדמיה בריכוז של 100 ננומולים ב-100 מיקרוליטרים. לאחר מכן טען את דגימת החלבון דרך השסתום עם מזרק זכוכית של 100 מיקרוליטר ושנה את קצב הזרימה ל -0.4 מיליליטר לדקה.לאחר הפעלת הלייזר בגודל 488 ננומטר יש לסרוק מראש כל אזור כדי לבדוק את מצב התפלגות הדנ"א ולבחור את האזור שבו מולקולות הדנ"א מתפזרות באופן שווה. לאחר מכן הגדר את עוצמת הלייזר ל-10% עבור הלייזר של 488 ננומטר ו-20% עבור הלייזר של 561 ננומטר. ובאמצעות מד הכוח, למדוד את כוח הלייזר האמיתי ליד המנסרה.התחל להשיג תמונות במרווחים של שתי שניות עם לייזרים של 488 ו- 561 ננומטר בו-זמנית. לאחר מכן שנה את השסתום ממצב ידני למצב הזרקה כדי לאפשר למאגר ההדמיה לשטוף את דגימת החלבון לתוך תא הזרימה לאחר 60 שניות. כדי להסיר את ה-EWS-FLI1 החופשי, המשיכו לשטוף את תא הזרימה עם מאגר ההדמיה למשך חמש דקות כאשר רק הלייזר בגודל 561 ננומטר מופעל.ואז לעצור את הזרימה לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, הפעל את הזרימה במהירות של 0.4 מיליליטר לדקה כדי לאפשר לדנ"א להתרחב ולרכוש תמונות במרווחים של שתי שניות בין מסגרות שונות כדי לקבל נתוני תפוקה גבוהים של היווצרות עיבוי EWS-FLI1. מולקולות EWS-FLI1 הודגמו על ידי זיהוי אותות EWS-FLI1 המסומנים ב-mCherry שהתקבלו באמצעות לייזר בגודל 561 ננומטר.ניתן להמחיש ישירות את היווצרות המבחנה של עיבוי EWS-FLI1 באתר של 25 חזרות GGAA במצע הדנ"א. הספציפיות של mCherry EWS-FLI1 המשמשת בווילונות דנ"א אושרה על ידי בדיקת תזוזת ניידות אלקטרופורטית באמצעות תבנית דנ"א עם ובלי 25 GGAA חוזר בנפרד. כאשר ריכוז ה-EWS-FLI1 עלה מ-20 ל-500 ננומולים, עוצמת ה-EWS-FLI1 עלתה באופן דרמטי.בעוד שהשינוי בעוצמת ה-DBD האחת של FLI היה זניח כאשר החלבונים היו רוויים כדי לכסות את ה-GGAA חוזר, מה שמרמז על כך ש-EWS-FLI1 יצר עיבוי על הדנ"א. ההזרקה צריכה להיות איטית ורכה מאוד, כך שהליפוזום והדנ"א יוכלו להתפזר באופן שווה על תא הזרימה. חשוב לבצע MSA כדי לאשר שגורם שעתוק מטוהר נקשר באופן ספציפי לרצף היעד במבחנה.טכניקה זו מאפשרת לאנשים לחקור אם העיבוי יקל על חיפוש היעד של גורמי שעתוק, והשפעתו על שעתוק.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

הדמיה סופר-רזולוציה מולקולה בודדת של 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol בקרום פלזמה עם רומן פלורסנט בדיקות

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

מולקולה בודדת פשוטה, חסון וגבוה התפוקה זרימה מתיחה Assay יישום לימוד התחבורה של מולקולות לאורך הדנ א

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

מולקולה בודדת פלואורסצנטית העברת אנרגיה מחקר של סינתזת חלבון ריבוזום

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...