Name: single-molecule imaging of ews-fli1 condensates assembling on dna
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00
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यह काम एनएसएफसी अनुदान संख्या 31670762 (जेडक्यू) द्वारा समर्थित था।

1. लिपिड बाइलेयर मास्टर मिश्रण की तैयारी
<ol><li>ग्लास शीशियों को डबल-डिस्टिल्ड पानी (डीडीएच2ओ) और 99% इथेनॉल के साथ धोएं और उन्हें 60 डिग्री सेल्सियस सुखाने वाले ओवन में सुखाएं।</li>
	<li>1,2-डायोलियोइल-एसएन-ग्लि?...

<ol>
	<li>Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+regulation+of+gene+transcription.">Organization and regulation of gene transcription.</a> Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).</li><li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+regulation+by+histone+methylation:+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails.">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes &amp; Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+ncRNAs+allosterically+modify+RNA-binding+proteins+in+cis+to+inhibit+transcription.">Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription.</a> Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).</li><li>Alexander, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mediates+target+gene+association+with+nuclear+speckles+for+amplified+RNA+expression.">p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).</li><li>Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+required+for+accurate+initiation+of+transcription+by+purified+RNA+polymerase-II.">Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).</li><li>Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+and+3D+genome+conformation+in+cell-fate+decisions.">Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions.</a> Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+and+super-enhancer:+Positive+regulators+in+gene+transcription.">Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription.</a> Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).</li><li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+transcription+factors.">The human transcription factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-nuclear+mobility+and+target+search+mechanisms+of+transcription+factors:+a+single-molecule+perspective+on+gene+expression.">Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).</li><li>Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion-driven+mechanisms+of+protein+translocation+on+nucleic+acids.">Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids.</a> Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).</li><li>Loverdo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hopping+and+jumping+in+facilitated+diffusion+of+DNA-binding+proteins.">Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins.</a> Physical Review Letters. 102 (18), 188101 (2009).</li><li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains.">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li><li>Sabari, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control.">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li><li>Kim, S., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+interplay+between+transcription+factors+and+the+3D+genome.">Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome.</a> Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).</li><li>Shrinivas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+features+that+drive+formation+of+transcriptional+condensates.">Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates.</a> Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+DNA-induced+phase+separation+for+transcriptional+repressor+VRN1.">Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).</li><li>Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+binding+between+distant+transcription+factors+is+a+hallmark+of+active+enhancers.">Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).</li><li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination.">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li><li>Qi, Z., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recombination+intermediates+with+single-stranded+DNA+curtains.">Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains.</a> Methods. 105, 62-74 (2016).</li><li>Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+dynamics+of+human+RPA+and+RAD51+on+ssDNA+during+assembly+and+disassembly+of+the+RAD51+filament.">Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1+alpha+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547, 236-240 (2017).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loci-specific+phase+separation+of+FET+fusion+oncoproteins+promotes+gene+transcription.">Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription.</a> Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+novel+tools+for+imaging+protein-nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+optical+imaging.">DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li><li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+EWS/FLI+regulation+via+GGAA+microsatellites+in+Ewing's+sarcoma.">Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma.</a> Genes &amp; Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).</li><li>Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ETS+family+of+oncogenic+transcription+factors+in+solid+tumours.">The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+tension:+single-molecule+DNA+mechanics.">Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics.</a> Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).</li><li>Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R., Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+dual-trap+optical+tweezers+with+differential+detection.">High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection.</a> Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2008).</li><li>Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+biological+reaction+intermediates+with+DNA+curtains.">Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).</li></ol>

चूंकि एकल-अणु दृष्टिकोण प्रतिक्रिया प्रणाली की सामग्री के प्रति बेहद संवेदनशील हैं, इसलिए डीएनए पर्दे प्रयोगों के दौरान सभी सामग्रियों और समाधानों की अच्छी गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त ?...

ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन जीवित कोशिकाओं में सटीक जीन अभिव्यक्ति के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। क्रोमोसोमल संशोधन, प्रतिलेखन कारक (टीएफ), और गैर-कोडिंग आरएनए जैसे कई कारक, इस जटिल प्रक्रिया 1,2,3 में भाग लेते हैं। इन कारकों के बीच, टीएफ ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन की विशिष्टता में योगदान करते हैं, जिन्हें प्रमोटर या एन्हांसर के रूप में जाना जाता है और बाद में प्रतिलेखन 4,5,6,7 को सक्रिय या दबाने के लिए अन्य कार्यात्मक प्रोटीन की भर्ती की जाती है। ये टीएफ मानव जीनोम में अपने लक्षित स्थलों की खोज करने और हिस्टोन और गैर-हिस्टोन डीएनए-बाइंडिंग प्रोटीन के साथ लेपित डीएनए के साथ बातचीत करने का प्रबंधन कैसे करते हैं, इसने दशकों से वैज्ञानिकों को परेशान किया है। पिछले कुछ वर्षों में, टीएफ के लक्ष्य खोज तंत्र के लिए कई शास्त्रीय मॉडल यह वर्णन करने के लिए बनाए गए हैं कि वे डीएनए श्रृंखला 8,9,10,11 के साथ "स्लाइड," "हॉप," "जंप", या "इंटरसेगमेंट ट्रांसफर" कैसे करते हैं। ये मॉडल एक एकल टीएफ अणु के डीएनए पर खोज व्यवहार पर केंद्रित हैं। हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि कुछ टीएफ तरल-तरल चरण पृथक्करण (एलएलपीएस) से गुजरते हैं या तो नाभिक में अकेले या मध्यस्थ परिसर12 के साथ। टीएफ की देखी गई बूंदें प्रमोटर या एन्हांसर क्षेत्रों से जुड़ी होती हैं, जो प्रतिलेखन और त्रि-आयामी जीनोम13,14,15 में बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट गठन की भूमिका को उजागर करती हैं। ये बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट विवो और इन विट्रो में झिल्ली की कमी वाले डिब्बों से जुड़े होते हैं। वे एलएलपीएस के माध्यम से बनते हैं, जिसमें मॉड्यूलर बायोमैक्रोमोलेक्यूल्स और प्रोटीन के आंतरिक रूप से अव्यवस्थित क्षेत्र (आईडीआर) मल्टीवेलेंट इंटरैक्शन16 के दो मुख्य ड्राइविंग बल हैं। इस प्रकार, टीएफ न केवल डीएनए की खोज करते हैं, बल्कि इन कंडेनसेट 4,17,18 के भीतर सहक्रियात्मक रूप से भी कार्य करते हैं। आज तक, डीएनए पर इन प्रतिलेखन कंडेनसेट की बायोफिज़िकल संपत्ति स्पष्ट नहीं है।
इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य एक एकल-अणु विधि-डीएनए कर्टेन्स को लागू करना था- सीधे विट्रो में डीएनए पर टीएफ द्वारा गठित प्रतिलेखन कंडेनसेट के गठन और गतिशीलता को चित्रित करने के लिए। डीएनए कर्टेन्स, प्रोटीन और डीएनए के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट इन विट्रो इमेजिंग प्लेटफॉर्म, डीएनए मरम्मत 19,20,21, लक्ष्य खोज 22 और एलएलपीएस 17,23,24 में लागू किया गया है। डीएनए पर्दे के प्रवाह को सतह को पारित करने और बायोमोलेक्यूल्स को सतह पर फैलाने की अनुमति देने के लिए बायोटिनिलेटेड लिपिड बाइलेयर के साथ लेपित किया जाता है। नैनोफैब्रिकेटेड जिग-जैग पैटर्न डीएनए की गति को सीमित करते हैं। बायोटिनिलेटेड लैम्ब्डा डीएनए सब्सट्रेट बाधा किनारों के साथ संरेखित हो सकते हैं और उन्मुख बफर प्रवाह द्वारा फैले हो सकते हैं। सभी अणुओं के समान शुरुआती और अंत अनुक्रम डीएनए पर प्रोटीन की ट्रैकिंग की अनुमति देते हैं और बाध्यकारी घटनाओं25,26 के स्थिति वितरण का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (टीआईआरएफएम) के साथ डीएनए पर्दे का संयोजन पृष्ठभूमि शोर को कम करने और एकल-अणु स्तर पर संकेतों का पता लगाने में मदद करता है। इस प्रकार, डीएनए कर्टेन डीएनए रूपांकनों पर प्रतिलेखन कंडेनसेट गठन की गतिशीलता की जांच करने के लिए एक आशाजनक तरीका हो सकता है। यह पेपर क्रोमोसोमल ट्रांसलोकेशन द्वारा उत्पन्न एफयूएस / ईडब्ल्यूएस / टीएएफ 15 (एफईटी) परिवार संलयन ऑनकोप्रोटीन, ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 के उदाहरण का वर्णन करता है। लैम्ब्डा डीएनए जिसमें 25× जीजीएए होता है - ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 127 का बाध्यकारी अनुक्रम- डीएनए कर्टेन प्रयोगों में डीएनए सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किया गया था ताकि यह देखा जा सके कि ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 अणु डीएनए पर एलएलपीएस से कैसे गुजरते हैं। यह पांडुलिपि प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और डेटा विश्लेषण विधियों पर विस्तार से चर्चा करती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>488 nm diodepumped solid-state laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS488LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm diodepumped solid-state laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS561LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Rhawn</td>
			<td>R003215-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated DOPE</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>870273P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>1595C027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating Electra 92</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-PC 5090.02</td>
			<td>The conductive protective coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5139-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z805939-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3013S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Packing Extracts</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MP5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport</td>
			<td>Idex</td>
			<td>N-333-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM Broth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3643-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-2000 DOPE</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880130P-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4%</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-P 649.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 950K, ANISOLE 2%</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-P 672.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime 95B Scientific CMOS camera</td>
			<td>PHOTOMETRICS</td>
			<td>Prime95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica glass slide</td>
			<td>G.Finkenbeiner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-way injection valve</td>
			<td>Idex</td>
			<td>MXP9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S888</td>
			<td>Diluted with ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Pump11 Elite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0146V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Iodide (491/509)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y3601</td>
			<td>Diluted with DMSO</td>
		</tr>
	</tbody>
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single-molecule imaging of ews-fli1 condensates assembling on dna

क्रोमोसोमल ट्रांसलोकेशन के परिणामस्वरूप संलयन जीन कई ठोस ट्यूमर या ल्यूकेमिया में पाए गए हैं। ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1, जो संलयन ऑन्कोप्रोटीन के एफयूएस / ईडब्ल्यूएस / टीएएफ 15 (एफईटी) परिवार से संबंधित है, इविंग सारकोमा में सबसे अधिक बार शामिल संलयन जीनों में से एक है। ये एफईटी परिवार संलयन प्रोटीन आमतौर पर अपने एन-टर्मिनस पर एफईटी प्रोटीन के कम जटिलता डोमेन (एलसीडी) और उनके सी-टर्मिनस पर डीएनए-बाइंडिंग डोमेन (डीबीडी) को परेशान करते हैं। ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 को एलसीडी-एलसीडी और एलसीडी-डीबीडी इंटरैक्शन के कारण अपने लक्ष्य बाध्यकारी लोकी पर बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट बनाने की पुष्टि की गई है, और ये कंडेनसेट जीन ट्रांसक्रिप्शन को बढ़ाने के लिए आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय की भर्ती कर सकते हैं। हालांकि, इन कंडेनसेट को उनके बाध्यकारी स्थलों पर कैसे इकट्ठा किया जाता है, यह स्पष्ट नहीं है। हाल ही में, ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 कंडेनसेट की इन संयोजन प्रक्रियाओं की कल्पना करने के लिए एक एकल-अणु बायोफिज़िक्स विधि-डीएनए कर्टेन्स-लागू किया गया था। यहां, लक्ष्य डीएनए पर बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट का अध्ययन करने में डीएनए कर्टेन के आवेदन के लिए विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और डेटा विश्लेषण दृष्टिकोण पर चर्चा की गई है।

डीएनए पर्दे का योजनाबद्ध चित्र 1 ए, चित्रा 1 बी और चित्रा 1 डी में दिखाया गया है। जीजीएए के 25 निर्बाध दोहराव वाले क्लोन लक्ष्य अनुक्रम इविंग सारकोमा में एनओआरबी 1 प्रम?...

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Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

यहां, हम डीएनए पर इकट्ठा होने वाले ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 कंडेनसेट के बायोफिज़िकल तंत्र का अध्ययन करने के लिए एकल-अणु इमेजिंग विधि, डीएनए कर्टेन के उपयोग का वर्णन करते हैं।

डीएनए पर एकत्र होने वाले ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 कंडेनसेट की एकल-अणु इमेजिंग

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

हम डीएनए पर प्रतिलेखन कारकों के चरण पृथक्करण का निरीक्षण करने के लिए एक एकल अणु परख प्रदान करते हैं यह तकनीक डीएनए पर तरल बूंद के रूप में इकट्ठा होने वाले प्रतिलेखन कारकों की गतिशील प्रक्रिया की वास्तविक प्राप्ति की अनुमति देती है। ईडब्ल्यूएस-एफएल 1 इविंग सारकोमा ट्यूमरजेनिसिस में सबसे अधिक बार शामिल संलयन जीनों में से एक है। हमारा शोध डीएनए मोटिफ संख्या और ईडब्ल्यूएस-एफएल 1 कंडेनसेट गठन के बीच संबंधों की पहचान कर सकता है जो ट्यूमर कोशिकाओं में एक बंजर जीन प्रतिलेखन से जुड़ा हुआ है, और शायद रोग का निदान करने के लिए सहायक है।इस विधि को पी 53 और एमईडी 1 जैसे विट्रो में किसी भी प्रतिलेखन कंडेनसेट या कॉम्प्लेक्स का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। डीएनए पर्दे के प्रयोग के लिए ज़िगज़ैग नैनो निर्मित बाधाओं के साथ एक प्रवाह सेल तैयार करने के लिए, इनपुट और आउटपुट ट्यूबों को सही दिशा में कनेक्ट करें। फिर दो तीन मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके 2.5 मिलीलीटर लिपिड बफर के साथ प्रवाह सेल को धोएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रवाह सेल में कोई बुलबुला नहीं है।आउटपुट से सिरिंज को हटा दें और प्रत्येक इंजेक्शन के बीच पांच मिनट के इनक्यूबेशन के साथ लिपोसोम समाधान के एक मिलीलीटर को तीन बार इंजेक्ट करें। उपचार के लिए, प्रवाह कोशिका को 2.5 मिलीलीटर लिपिड बफर के साथ धीरे-धीरे धोएं, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के दौरान, पाठ पांडुलिपि में उल्लिखित बीएसए बफर तैयार करें।फिर उपचार के 30 मिनट बाद, आउटपुट साइड से बीएसए बफर के 2.5 मिलीलीटर के साथ प्रवाह सेल को धो लें। इसके बाद, प्रत्येक चरण के बाद 10 मिनट की इनक्यूबेशन के साथ दो चरणों में इनपुट साइड से प्रवाह सेल में स्ट्रेप्टाविडिन बफर के 800 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें। फिर सभी मुक्त स्ट्रेप्टाविडिन अणुओं को हटाने के लिए बीएसए बफर के 2.5 मिलीलीटर के साथ प्रवाह सेल को धोएं।इसके बाद, बीएसए बफर का उपयोग करके क्लोन रूपांकनों के साथ बायोटिन लैम्ब्डा डीएनए को पतला करें और इसे पांच मिनट के अंतराल पर चार बार धीरे-धीरे इंजेक्ट करें। इंजेक्शन के दौरान, वैज्ञानिक मानार्थ धातु ऑक्साइड अर्धचालक प्रणाली में माइक्रोस्कोप चालू करें। फिर ट्यूबिंग को 10 मिलीलीटर डबल डिस्टिल्ड पानी से धोएं और प्रिज्म और ट्यूबिंग कनेक्टर को पानी, 2% तरल क्यूवेट क्लीनर और 99% इथेनॉल के साथ कुल्ला करें।इसके बाद, इमेजिंग बफर के कम से कम 20 मिलीलीटर को 30 मिलीलीटर सिरिंज में खींचें। माइक्रोस्कोप स्टेज पर फ्लो सेल सेट करें और इसे माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम से कनेक्ट करें। प्रति मिनट 0.03 मिलीलीटर की प्रवाह दर का उपयोग करके, डीएनए अणुओं को 10 मिनट के लिए बाधा में फ्लश करें।फिर माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम को बंद करें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। प्रवाह बंद होने के साथ, डीएनए को पार्श्व रूप से फैलने की अनुमति मिली। डीएनए पर्दे पर ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 संक्षेपण गठन की छवि बनाने के लिए, इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें और उज्ज्वल क्षेत्र के तहत नौ ज़िगज़ैग पैटर्न की स्थिति को ढूंढें और चिह्नित करें।फिर 10 मिनट के लिए डबल फंसे हुए डीएनए डाई के साथ डीएनए को दागने के लिए 0.2 मिलीलीटर प्रति मिनट पर प्रवाह चालू करें। इसके बाद, 100 माइक्रोलीटर में 100 नैनोमोल्स की एकाग्रता पर इमेजिंग बफर के साथ एमचेरी ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 प्रोटीन को पतला करें। फिर 100 माइक्रोलीटर ग्लास सिरिंज के साथ वाल्व के माध्यम से प्रोटीन के नमूने को लोड करें और प्रवाह दर को 0.4 मिलीलीटर प्रति मिनट में बदलें।488 नैनोमीटर लेजर चालू करने के बाद डीएनए वितरण स्थिति की जांच करने के लिए प्रत्येक क्षेत्र को पूर्व-स्कैन करें और उस क्षेत्र का चयन करें जिसमें डीएनए अणु समान रूप से वितरित होते हैं। फिर 488 नैनोमीटर लेजर के लिए लेजर पावर को 10% और 561 नैनोमीटर लेजर के लिए 20% पर सेट करें। और पावर मीटर का उपयोग करके, प्रिज्म के पास वास्तविक लेजर शक्ति को मापें।एक साथ 488 और 561 नैनोमीटर लेजर दोनों के साथ दो सेकंड के अंतराल पर छवियां प्राप्त करना शुरू करें। फिर वाल्व को मैनुअल मोड से इंजेक्शन मोड में बदलें ताकि इमेजिंग बफर प्रोटीन नमूने को 60 सेकंड के बाद प्रवाह सेल में फ्लश कर सके। मुक्त ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 को हटाने के लिए केवल 561 नैनोमीटर लेजर स्विच ऑन करके पांच मिनट के लिए इमेजिंग बफर के साथ फ्लो सेल को धोते रहें।फिर प्रवाह को रोकें और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के बाद, डीएनए को विस्तारित करने के लिए 0.4 मिलीलीटर प्रति मिनट पर प्रवाह चालू करें और ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 कंडेनसेट गठन के उच्च थ्रूपुट डेटा प्राप्त करने के लिए विभिन्न फ्रेम के बीच दो सेकंड के अंतराल पर छवियां प्राप्त करें। ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 अणुओं को 561 नैनोमीटर लेजर के साथ प्राप्त ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 संकेतों को एमचेरी लेबल का पता लगाकर कल्पना की गई थी।डीएनए सब्सट्रेट में 25 जीजीएए दोहराव की साइट पर ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 कंडेनसेट के इन विट्रो गठन को सीधे देखा जा सकता है। डीएनए पर्दे में उपयोग किए जाने वाले एमचेरी ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 की विशिष्टता की पुष्टि एक इलेक्ट्रोफोरेटिक मोबिलिटी शिफ्ट परख द्वारा डीएनए टेम्पलेट का उपयोग करके की गई थी। जब ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 एकाग्रता को 20 से 500 नैनोमोल्स तक सीमित किया गया था, तो ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 तीव्रता नाटकीय रूप से बढ़ गई थी।जबकि एफएलआई एक डीबीडी तीव्रता में परिवर्तन नगण्य था जब प्रोटीन को जीजीएए दोहराव को कवर करने के लिए संतृप्त किया गया था, यह सुझाव देते हुए कि ईडब्ल्यूएस-एफएलआई 1 ने डीएनए पर कंडेनसेट का गठन किया। इंजेक्शन बहुत धीमा और नरम होना चाहिए ताकि लिपोसोम और डीएनए प्रवाह कोशिका पर समान रूप से वितरित हो सकें। यह पुष्टि करने के लिए एमएसए करना महत्वपूर्ण है कि एक शुद्ध प्रतिलेखन कारक विशेष रूप से विट्रो में लक्ष्य अनुक्रम के साथ बंधता है।यह तकनीक लोगों को यह पता लगाने की अनुमति देती है कि क्या कंडेनसेट प्रतिलेखन कारकों की लक्ष्य खोज की सुविधा प्रदान करेगा, और प्रतिलेखन पर इसका प्रभाव।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

उपन्यास फ्लोरोसेंट जांच के साथ प्लाज्मा झिल्ली में Phosphatidylinositol 4,5-बाइफोस्फेट की एकल अणु सुपर संकल्प इमेजिंग

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

एक सरल, मजबूत, और उच्च प्रवाह एकल अणु डीएनए के साथ अणुओं के परिवहन के अध्ययन के लिए परख कार्यांवयन खींच प्रवाह

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

जी के एकल अणु हेरफेर-चुंबकीय चिमटी द्वारा quadruplexes

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए प्रोटीन की आबंध स्थिरीकरण

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

प्रोसिटोम एकल अणु स्तर पर लेबलिंग एकरूपता का व्यापक परिमाणन

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

एकल अणु अवलोकन के लिए डीएनए Origami Nanostructures पर Dynein और Kinesin मोटर एनसेंबल्स का उत्पादन

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

कैप-डिपेंडेंट ट्रांसल काइनेटिक्स के विश्लेषण के लिए इन विट्रो सिंगल-अणु इमेजिंग परख

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

एकल अणु मछली द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिव एलील्स का एकल सेल विश्लेषण

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

रिबोसोम प्रोटीन संश्लेषण का एकल अणु फ्लोरेसेंस एनर्जी ट्रांसफर अध्ययन

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन की मात्रा का ठहराव के लिए एक अनुकूलित एकल अणु पुल-डाउन परख

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...