Name: single-molecule imaging of ews-fli1 condensates assembling on dna
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00
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이 작업은 NSFC 보조금 번호 31670762 (Z.Q.)의 지원을 받았습니다.

1. 지질 이중층 마스터 믹스의 제조
<ol><li>유리 바이알을 이중 증류수 (ddH2O)와 99 % 에탄올로 헹구고 60 ° C 건조 오븐에서 건조시킵니다.</li>
	<li>1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 1g, 폴리에틸렌글리콜 반응(PEG화) 지질 100mg(1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염)(PEG2000 DOPE) 100mg 및 비오티닐화 지질 25mg(1,2-디올레오일-sn-글리세?...

<ol>
	<li>Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+regulation+of+gene+transcription.">Organization and regulation of gene transcription.</a> Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).</li><li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+regulation+by+histone+methylation:+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails.">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes &amp; Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+ncRNAs+allosterically+modify+RNA-binding+proteins+in+cis+to+inhibit+transcription.">Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription.</a> Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).</li><li>Alexander, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mediates+target+gene+association+with+nuclear+speckles+for+amplified+RNA+expression.">p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).</li><li>Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+required+for+accurate+initiation+of+transcription+by+purified+RNA+polymerase-II.">Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).</li><li>Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+and+3D+genome+conformation+in+cell-fate+decisions.">Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions.</a> Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+and+super-enhancer:+Positive+regulators+in+gene+transcription.">Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription.</a> Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).</li><li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+transcription+factors.">The human transcription factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-nuclear+mobility+and+target+search+mechanisms+of+transcription+factors:+a+single-molecule+perspective+on+gene+expression.">Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).</li><li>Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion-driven+mechanisms+of+protein+translocation+on+nucleic+acids.">Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids.</a> Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).</li><li>Loverdo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hopping+and+jumping+in+facilitated+diffusion+of+DNA-binding+proteins.">Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins.</a> Physical Review Letters. 102 (18), 188101 (2009).</li><li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains.">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li><li>Sabari, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control.">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li><li>Kim, S., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+interplay+between+transcription+factors+and+the+3D+genome.">Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome.</a> Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).</li><li>Shrinivas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+features+that+drive+formation+of+transcriptional+condensates.">Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates.</a> Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+DNA-induced+phase+separation+for+transcriptional+repressor+VRN1.">Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).</li><li>Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+binding+between+distant+transcription+factors+is+a+hallmark+of+active+enhancers.">Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).</li><li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination.">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li><li>Qi, Z., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recombination+intermediates+with+single-stranded+DNA+curtains.">Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains.</a> Methods. 105, 62-74 (2016).</li><li>Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+dynamics+of+human+RPA+and+RAD51+on+ssDNA+during+assembly+and+disassembly+of+the+RAD51+filament.">Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1+alpha+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547, 236-240 (2017).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loci-specific+phase+separation+of+FET+fusion+oncoproteins+promotes+gene+transcription.">Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription.</a> Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+novel+tools+for+imaging+protein-nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+optical+imaging.">DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li><li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+EWS/FLI+regulation+via+GGAA+microsatellites+in+Ewing's+sarcoma.">Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma.</a> Genes &amp; Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).</li><li>Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ETS+family+of+oncogenic+transcription+factors+in+solid+tumours.">The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+tension:+single-molecule+DNA+mechanics.">Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics.</a> Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).</li><li>Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R., Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+dual-trap+optical+tweezers+with+differential+detection.">High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection.</a> Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2008).</li><li>Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+biological+reaction+intermediates+with+DNA+curtains.">Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).</li></ol>

단일 분자 접근법은 반응 시스템의 내용물에 매우 민감하기 때문에 DNA 커튼 실험 중에 모든 물질과 용액, 특히 섹션 1과 2에서 준비된 지질과 섹션 5에서 사용된 완충액의 우수한 품질을 보장하기 위해 추가 노력을 투자해야 합니다. 완충액을 준비하려면 더 높은 순도의 시약을 사용해야 하며, 완충액은 단일 분자 분석을 위해 새로 준비해야 합니다.
500 nM mCherry-표지된 EWS-FLI1을...

전사 조절은 살아있는 세포에서 정확한 유전자 발현을 위한 중요한 단계입니다. 염색체 변형, 전사 인자(TF) 및 비코딩 RNA와 같은 많은 요인이 이복잡한 과정에 참여합니다1,2,3. 이러한 요인 중 TF는 프로모터 또는 인핸서로 알려진 특정 DNA 서열을 인식하고 결합한 다음 전사 4,5,6,7을 활성화하거나 억제하기 위해 다른 기능성 단백질을 모집함으로써 전사 조절의 특이성에 기여합니다. 이러한 TF가 인간 게놈에서 표적 부위를 검색하고 히스톤 및 비 히스톤 DNA 결합 단백질로 코팅 된 DNA와 상호 작용하는 방법은 수십 년 동안 과학자들을 당혹스럽게했습니다. 지난 몇 년 동안, TF의 표적 검색 메커니즘에 대한 몇 가지 고전적인 모델이 DNA 사슬 8,9,10,11을 따라 "미끄러지는", "홉", "점프"또는 "세그먼트 간 전달"하는 방법을 설명하기 위해 구축되었습니다. 이 모델은 단일 TF 분자의 DNA에 대한 검색 행동에 중점을 둡니다. 그러나 최근 연구에 따르면 일부 TF는 핵에서 단독으로 또는 매개체 복합체12와 함께 액체-액체 상 분리 (LLPS)를 겪습니다. TF의 관찰된 액적은 프로모터 또는 인핸서 영역과 연관되어, 전사 및 3차원 게놈13,14,15에서 생체분자 축합물 형성의 역할을 강조한다. 이러한 생체 분자 응축수는 생체 내 및 시험관 내에서 막이 없는 구획과 연결되어 있습니다. 이들은 LLPS를 통해 형성되며, 여기서 모듈식 생체 거대분자와 단백질의 내재적으로 무질서한 영역(IDR)은 다가 상호 작용의 두 가지 주요 원동력입니다16. 따라서 TF는 DNA를 검색 할뿐만 아니라 이러한 응축수 4,17,18 내에서 상승 작용을합니다. 현재까지 DNA에 대한 이러한 전사 응축 물의 생물 물리학 적 특성은 불분명하다.
따라서 이 연구는 단일 분자 방법인 DNA 커튼을 적용하여 시험관 내 DNA에서 TF에 의해 형성된 전사 응축물의 형성과 역학을 직접 이미지화하는 것을 목표로 했습니다. 단백질과 DNA 간의 상호 작용을 연구하기 위한 고처리량 체외 이미징 플랫폼인 DNA 커튼은 DNA 복구 19,20,21, 표적 검색 22 및 LLPS17,23,24에 적용되었습니다. DNA 커튼의 플로우 셀은 바이오 티닐화 지질 이중층으로 코팅되어 표면을 부동 태화하고 생체 분자가 표면에 확산되도록합니다. 나노 가공 된 지그재그 패턴은 DNA의 움직임을 제한합니다. 비오틴화된 람다 DNA 기질은 장벽 가장자리를 따라 정렬될 수 있으며 배향된 완충액 흐름에 의해 늘어날 수 있습니다. 모든 분자의 동일한 시작 및 끝 서열은 DNA 상의 단백질의 추적을 허용하고 결합 이벤트(25, 26)의 위치 분포를 설명한다. 또한 DNA 커튼과 전반사 형광 현미경(TIRFM)의 조합은 배경 노이즈를 최소화하고 단일 분자 수준에서 신호를 감지하는 데 도움이 됩니다. 따라서 DNA 커튼은 DNA 모티프에서 전사 응축수 형성의 역학을 조사하는 유망한 방법이 될 수 있습니다. 이 논문은 염색체 전좌에 의해 생성된 FUS/EWS/TAF15(FET) 패밀리 융합 종양단백질, EWS-FLI1의 예를 설명합니다. EWS-FLI1의 결합 서열인 25× GGAA를 함유하는 람다 DNA27-를 DNA 커튼 실험에서 DNA 기질로 사용하여 EWS-FLI1 분자가 DNA에서 LLPS를 겪는 방식을 관찰하였다. 이 원고는 실험 프로토콜 및 데이터 분석 방법에 대해 자세히 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>488 nm diodepumped solid-state laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS488LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm diodepumped solid-state laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS561LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Rhawn</td>
			<td>R003215-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated DOPE</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>870273P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>1595C027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating Electra 92</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-PC 5090.02</td>
			<td>The conductive protective coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5139-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z805939-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3013S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Packing Extracts</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MP5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport</td>
			<td>Idex</td>
			<td>N-333-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM Broth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3643-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-2000 DOPE</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880130P-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4%</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-P 649.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 950K, ANISOLE 2%</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-P 672.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime 95B Scientific CMOS camera</td>
			<td>PHOTOMETRICS</td>
			<td>Prime95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica glass slide</td>
			<td>G.Finkenbeiner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-way injection valve</td>
			<td>Idex</td>
			<td>MXP9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S888</td>
			<td>Diluted with ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Pump11 Elite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0146V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Iodide (491/509)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y3601</td>
			<td>Diluted with DMSO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of ews-fli1 condensates assembling on dna

염색체 전좌로 인한 융합 유전자는 많은 고형 종양 또는 백혈병에서 발견되었습니다. 융합 종양 단백질의 FUS / EWS / TAF15 (FET) 계열에 속하는 EWS-FLI1은 유잉 육종에서 가장 자주 관여하는 융합 유전자 중 하나입니다. 이러한 FET 패밀리 융합 단백질은 일반적으로 N-말단에 FET 단백질의 저복잡성 도메인(LCD)을, C-말단에 DNA 결합 도메인(DBD)을 가지고 있습니다. EWS-FLI1은 LCD-LCD 및 LCD-DBD 상호 작용으로 인해 표적 결합 유전자좌에서 생체 분자 축합 물을 형성하는 것으로 확인되었으며, 이러한 축합 물은 RNA 중합 효소 II를 모집하여 유전자 전사를 향상시킬 수 있습니다. 그러나 이러한 응축수가 결합 부위에서 어떻게 조립되는지는 불분명합니다. 최근에는 EWS-FLI1 응축물의 이러한 조립 과정을 시각화하기 위해 단일 분자 생물 물리학 방법인 DNA 커튼이 적용되었습니다. 여기에서는 표적 DNA에 조립되는 생체 분자 응축수를 연구하는 데 DNA 커튼을 적용하기 위한 상세한 실험 프로토콜 및 데이터 분석 접근 방식에 대해 논의합니다.

DNA 커튼의 개략도는 그림 1A, 그림 1B 및 그림 1D에 나와 있습니다. GGAA의 25개의 중단되지 않은 반복을 함유하는 클로닝된 표적 서열은 유잉 육종의 NORB1 프로모터에서 발견된다. 이 표적 서열은 EWS-FLI1 모집28에 결정적이다. EWS-FLI1 분자는 561nm 레이저로 얻은 mCherry 표지된 EWS-FLI1 신호를 검출하여 시각화되었?...

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Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

여기에서는 DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 생물물리학적 메커니즘을 연구하기 위해 단일 분자 이미징 방법인 DNA 커튼의 사용에 대해 설명합니다.

DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 단일 분자 이미징

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

우리는 DNA에 대한 전사 인자의 상 분리를 관찰하기 위한 단일 분자 분석을 제공합니다. 이 기술을 사용하면 DNA에 액체 방울로 조립되는 전사 인자의 동적 과정을 실시간으로 실현할 수 있습니다. EWS-FL1은 유잉 육종 종양 발생에 가장 자주 관여하는 융합 유전자 중 하나입니다. 우리의 연구는 DNA 모티프 번호와 종양 세포의 불모의 유전자 전사와 관련된 EWS-FL1 축합물 형성 사이의 관계를 확인할 수 있으며 예후에 도움이 될 수 있습니다.이 방법은 P53 및 MED1과 같은 시험관 내 전사 응축수 또는 복합체를 연구하는 데 적용될 수 있습니다. DNA 커튼 실험을 위해 지그재그 나노 제작 장벽이 있는 플로우 셀을 준비하려면 입력 및 출력 튜브를 올바른 방향으로 연결하십시오. 그런 다음 2.5 밀리리터 주사기를 사용하여 2.5 밀리리터의 지질 완충액으로 플로우 셀을 세척하여 플로우 셀에 기포가 없는지 확인합니다.출력물에서 주사기를 제거하고 각 주사 사이에 5 분 배양으로 리포좀 용액 1 밀리리터를 3 회 주입합니다. 치유를 위해 유동 세포를 2.5ml의 지질 완충액으로 천천히 다시 씻고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 배양 동안, 텍스트 원고에 언급된 바와 같이 BSA 완충액을 준비한다.그런 다음 30 분의 치유 후 출력 측에서 2.5ml의 BSA 버퍼로 플로우 셀을 세척합니다. 다음으로, 800 마이크로리터의 스트렙타비딘 완충액을 입력 측에서 플로우 셀에 주입하고 각 단계 후 10분간 배양하여 두 단계로 한다. 그런 다음 2.5 밀리리터의 BSA 버퍼로 플로우 셀을 세척하여 모든 유리 스트렙타비딘 분자를 제거합니다.다음으로, BSA 버퍼를 사용하여 클로닝된 모티프로 비오틴 람다 DNA를 희석하고 5분 간격으로 천천히 4회 주입합니다. 주입하는 동안 과학적인 보완 금속 산화물 반도체 시스템에서 현미경을 켭니다. 그런 다음 이중 증류수 10ml로 튜브를 씻고 프리즘과 튜브 커넥터를 물, 2% 액체 큐벳 클리너 및 99% 에탄올로 헹굽니다.다음으로, 최소 20 밀리리터의 이미징 버퍼를 30 밀리리터 주사기에 넣습니다. 현미경 스테이지에 플로우 셀을 설치하고 미세 유체 시스템에 연결합니다. 분당 0.03 밀리리터의 유속을 사용하여 DNA 분자를 10 분 동안 장벽으로 플러시합니다.그런 다음 미세 유체 시스템을 끄고 30 분 동안 배양하십시오. 흐름이 멈춘 상태에서 DNA가 옆으로 확산되도록합니다. DNA 커튼에서 EWS-FLI1 응결 형성을 이미지화하려면 이미징 소프트웨어를 열고 명시야 아래에서 9개의 지그재그 패턴의 위치를 찾아 표시합니다.그런 다음 분당 0.2 밀리리터의 흐름을 켜서 이중 가닥 DNA 염료로 DNA를 10 분 동안 염색합니다. 다음으로, mCherry EWS-FLI1 단백질을 100 마이크로리터에서 100 나노몰 농도의 이미징 버퍼로 희석한다. 그런 다음 100 마이크로 리터 유리 주사기로 밸브를 통해 단백질 샘플을 넣고 유속을 분당 0.4 밀리리터로 변경하십시오.488 나노미터 레이저를 켠 후 각 영역을 미리 스캔하여 DNA 분포 상태를 확인하고 DNA 분자가 고르게 분포하는 영역을 선택합니다. 그런 다음 레이저 출력을 10 나노 미터 레이저의 경우 488 %, 20 나노 미터 레이저의 경우 561 %로 설정하십시오. 그리고 파워 미터를 사용하여 프리즘 근처의 실제 레이저 출력을 측정하십시오.488 및 561 나노미터 레이저를 동시에 사용하여 2초 간격으로 이미지 수집을 시작합니다. 그런 다음 밸브를 수동 모드에서 주입 모드로 변경하여 이미징 버퍼가 60초 후에 단백질 샘플을 플로우 셀로 플러시하도록 합니다. 비어 있는 EWS-FLI1을 제거하려면 561나노미터 레이저만 켠 상태에서 이미징 버퍼로 플로우 셀을 5분 동안 계속 세척하십시오.그런 다음 흐름을 멈추고 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양하십시오. 10분 후 분당 0.4밀리리터의 유량을 켜서 DNA가 확장되고 서로 다른 프레임 간에 2초 간격으로 이미지를 획득하여 EWS-FLI1 응축수 형성에 대한 높은 처리량 데이터를 얻습니다. EWS-FLI1 분자는 561 나노미터 레이저로 얻은 mCherry 표지된 EWS-FLI1 신호를 검출하여 시각화되었습니다.DNA 기질에서 25개의 GGAA 반복 부위에서 EWS-FLI1 축합물의 시험관 내 형성을 직접 시각화할 수 있었습니다. DNA 커튼에 사용된 mCherry EWS-FLI1의 특이성은 25개의 GGAA 반복이 별도로 있거나 없는 DNA 주형을 사용하는 전기영동 이동성 이동 분석법에 의해 확인되었습니다. EWS-FLI1 농도를 20 내지 500 나노몰로 적정하였을 때 EWS-FLI1 강도는 극적으로 증가하였다.FLI 1 DBD 강도의 변화는 단백질이 GGAA 반복을 덮도록 포화되었을 때 무시할 수 있는 반면, 이는 EWS-FLI1이 DNA에 응축물을 형성했음을 시사합니다. 주입은 리포솜과 DNA가 유동 세포에 고르게 분포 할 수 있도록 매우 느리고 부드러워 야합니다. 정제된 전사 인자는 시험관 내에서 표적 서열과 특이적으로 결합하는지 확인하기 위해 MSA를 수행하는 것이 중요합니다.이 기술을 통해 사람들은 응축수가 전사 인자의 표적 검색을 용이하게하는지 여부와 전사에 미치는 영향을 탐색 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

소설 형광 프로브와 플라즈마 막에서 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트의 단일 분자 슈퍼 해상도 이미징

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

연구

생화학

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

간단 하 고 강력한, 높은 처리량 단일 분자 DNA에 따라 분자의 수송을 공부에 대 한 스트레칭 분석 결과 구현 흐름

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

리보솜 단백질 합성의 단일 분자 형광 에너지 전송 연구

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...