Name: single-molecule imaging of ews-fli1 condensates assembling on dna
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).

1. Beredning av lipid-dubbelskiktshuvudblandningen
<ol><li>Skölj glasflaskorna med dubbeldestillerat vatten (ddH2O) och 99% etanol och torka dem i en 60 °C torkugn.</li>
	<li>Gör lipidmasterblandningen genom att lösa upp 1 g 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC), 100 mg polyetylenglykolreagerade (PEGylerade) lipider (18:1 av 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[metoxi (polyetylenglykol)-2000] (ammoniumsalt) (PEG2000 DOPE) och 25 mg biotinylerade lipider (18:1 av 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fo...

<ol>
	<li>Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+regulation+of+gene+transcription.">Organization and regulation of gene transcription.</a> Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).</li><li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+regulation+by+histone+methylation:+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails.">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes &amp; Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+ncRNAs+allosterically+modify+RNA-binding+proteins+in+cis+to+inhibit+transcription.">Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription.</a> Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).</li><li>Alexander, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+mediates+target+gene+association+with+nuclear+speckles+for+amplified+RNA+expression.">p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).</li><li>Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+required+for+accurate+initiation+of+transcription+by+purified+RNA+polymerase-II.">Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).</li><li>Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+and+3D+genome+conformation+in+cell-fate+decisions.">Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions.</a> Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).</li><li>Peng, Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+and+super-enhancer:+Positive+regulators+in+gene+transcription.">Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription.</a> Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).</li><li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+transcription+factors.">The human transcription factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-nuclear+mobility+and+target+search+mechanisms+of+transcription+factors:+a+single-molecule+perspective+on+gene+expression.">Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).</li><li>Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion-driven+mechanisms+of+protein+translocation+on+nucleic+acids.">Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids.</a> Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).</li><li>Loverdo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hopping+and+jumping+in+facilitated+diffusion+of+DNA-binding+proteins.">Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins.</a> Physical Review Letters. 102 (18), 188101 (2009).</li><li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains.">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li><li>Sabari, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control.">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li><li>Kim, S., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+interplay+between+transcription+factors+and+the+3D+genome.">Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome.</a> Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).</li><li>Shrinivas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+features+that+drive+formation+of+transcriptional+condensates.">Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates.</a> Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).</li><li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+condensates:+organizers+of+cellular+biochemistry.">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+DNA-induced+phase+separation+for+transcriptional+repressor+VRN1.">Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).</li><li>Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+binding+between+distant+transcription+factors+is+a+hallmark+of+active+enhancers.">Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).</li><li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination.">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li><li>Qi, Z., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recombination+intermediates+with+single-stranded+DNA+curtains.">Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains.</a> Methods. 105, 62-74 (2016).</li><li>Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+dynamics+of+human+RPA+and+RAD51+on+ssDNA+during+assembly+and+disassembly+of+the+RAD51+filament.">Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).</li><li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9.">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1+alpha+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547, 236-240 (2017).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loci-specific+phase+separation+of+FET+fusion+oncoproteins+promotes+gene+transcription.">Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription.</a> Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).</li><li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains:+novel+tools+for+imaging+protein-nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level.">DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li><li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+optical+imaging.">DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li><li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+properties+of+EWS/FLI+regulation+via+GGAA+microsatellites+in+Ewing's+sarcoma.">Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma.</a> Genes &amp; Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).</li><li>Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ETS+family+of+oncogenic+transcription+factors+in+solid+tumours.">The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).</li><li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-molecule+FRET.">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+tension:+single-molecule+DNA+mechanics.">Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics.</a> Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).</li><li>Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R., Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+dual-trap+optical+tweezers+with+differential+detection.">High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection.</a> Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2008).</li><li>Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+biological+reaction+intermediates+with+DNA+curtains.">Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).</li></ol>

Eftersom enmolekylära metoder är extremt känsliga för innehållet i reaktionssystemet, måste extra ansträngning investeras för att säkerställa god kvalitet på alla material och lösningar under DNA-gardinerna, särskilt de lipider som framställts i sektionerna 1 och 2 och de buffertar som används i avsnitt 5. Reagenser av högre renhet måste användas för att framställa buffertar, och buffertar måste vara nyberedda för enmolekylanalysen
När 500 nM mCherry-märkt EWS-FLI1 spol...

Transkriptionell reglering är ett avgörande steg för exakt genuttryck i levande celler. Många faktorer, såsom kromosommodifiering, transkriptionsfaktorer (TF) och icke-kodande RNA, deltar i denna komplicerade process 1,2,3. Bland dessa faktorer bidrar TF till specificiteten av transkriptionell reglering genom att känna igen och binda till specifika DNA-sekvenser som kallas promotorer eller förstärkare och därefter rekrytera andra funktionella proteiner för att aktivera eller undertrycka transkription 4,5,6,7. Hur dessa TFs lyckas söka efter sina målplatser i det mänskliga genomet och interagera med DNA belagt med histoner och icke-histon DNA-bindande proteiner har förvirrat forskare i årtionden. Under de senaste åren har flera klassiska modeller för målsökningsmekanismen för TFs byggts för att beskriva hur de "glider", "hoppar", "hoppar" eller "intersegmentöverföring" längs DNA-kedjan 8,9,10,11. Dessa modeller är inriktade på sökbeteendet på DNA från en enda TF-molekyl. Nya studier visar dock att vissa TF genomgår vätske-vätskefasseparation (LLPS) antingen ensam i kärnan eller med Mediator-komplexet12. De observerade dropparna av TF är associerade med promotorn eller förstärkarregionerna, vilket belyser rollen för biomolekylär kondensatbildning vid transkription och det tredimensionella genomet13,14,15. Dessa biomolekylära kondensat är kopplade till membranbristfack in vivo och in vitro. De bildas via LLPS, där modulära biomakromolekyler och inneboende oordnade regioner (IDR) av proteiner är två huvudsakliga drivkrafter för multivalenta interaktioner16. Således söker TF inte bara DNA utan fungerar också synergistiskt inom dessa kondensat 4,17,18. Hittills är den biofysiska egenskapen hos dessa transkriptionskondensat på DNA fortfarande oklar.
Därför syftade denna studie till att tillämpa en enmolekylär metod-DNA-gardiner-för att direkt avbilda bildandet och dynamiken hos transkriptionskondensaten som bildas av TF på DNA in vitro. DNA Curtains, en in vitro-bildplattform med hög genomströmning för att studera interaktionen mellan proteiner och DNA, har applicerats i DNA-reparation19,20,21, målsökning 22 och LLPS17,23,24. Flödescellen i DNA-gardiner är belagd med biotinylerade lipid-dubbelskikt för att passivera ytan och låta biomolekylerna diffundera på ytan. De nanofabricerade sicksackmönstren begränsar DNA-rörelsen. Biotinylerade Lambda DNA-substrat kan rikta sig längs barriärkanterna och sträckas ut av det orienterade buffertflödet. Samma start- och slutsekvenser av alla molekyler möjliggör spårning av proteinet på DNA och beskriver positionsfördelningen av bindningshändelserna25,26. Dessutom hjälper kombinationen av DNA-gardiner med total intern reflektionsfluorescensmikroskopi (TIRFM) att minimera bakgrundsbruset och detektera signaler på en enda molekylnivå. Således kan DNA-gardiner vara en lovande metod för att undersöka dynamiken i transkriptionskondensatbildning på DNA-motiv. Detta dokument beskriver exemplet på en FUS / EWS / TAF15 (FET) familj fusion onkoprotein, EWS-FLI1, genererad av kromosomal translokation. Lambda-DNA innehållande 25× GGAA-bindningssekvensen för EWS-FLI127- användes som DNA-substrat i DNA-gardinerna för att observera hur EWS-FLI1-molekyler genomgår LLPS på DNA. Detta manuskript diskuterar det experimentella protokollet och dataanalysmetoderna i detalj.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>488 nm diodepumped solid-state laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS488LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm diodepumped solid-state laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>OBIS561LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Rhawn</td>
			<td>R003215-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotinylated DOPE</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>870273P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>1595C027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating Electra 92</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-PC 5090.02</td>
			<td>The conductive protective coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5139-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z805939-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3013S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda Packing Extracts</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>MP5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport</td>
			<td>Idex</td>
			<td>N-333-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZCYM Broth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3643-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-2000 DOPE</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880130P-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4%</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-P 649.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 950K, ANISOLE 2%</td>
			<td>Allresist GmbH</td>
			<td>AR-P 672.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime 95B Scientific CMOS camera</td>
			<td>PHOTOMETRICS</td>
			<td>Prime95B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>NEB</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica glass slide</td>
			<td>G.Finkenbeiner</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-way injection valve</td>
			<td>Idex</td>
			<td>MXP9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S888</td>
			<td>Diluted with ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Pump11 Elite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0146V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YOYO-1 Iodide (491/509)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Y3601</td>
			<td>Diluted with DMSO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule imaging of ews-fli1 condensates assembling on dna

Fusionsgenerna som härrör från kromosomal translokation har hittats i många solida tumörer eller leukemi. EWS-FLI1, som tillhör FUS / EWS / TAF15 (FET) -familjen av fusionsonkoproteiner, är en av de mest involverade fusionsgenerna i Ewing sarkom. Dessa FET-familjefusionsproteiner har vanligtvis en lågkomplexitetsdomän (LCD) av FET-protein vid deras N-terminal och en DNA-bindande domän (DBD) vid deras C-terminal. EWS-FLI1 har bekräftats bilda biomolekylära kondensat vid dess målbindande loci på grund av LCD-LCD och LCD-DBD-interaktioner, och dessa kondensat kan rekrytera RNA-polymeras II för att förbättra gentranskriptionen. Hur dessa kondensat monteras på sina bindningsställen är dock fortfarande oklart. Nyligen tillämpades en enmolekylär biofysikmetod-DNA-gardiner-för att visualisera dessa monteringsprocesser av EWS-FLI1-kondensat. Här diskuteras det detaljerade experimentella protokollet och dataanalysmetoderna för tillämpning av DNA-gardiner för att studera de biomolekylära kondensaten som monteras på mål-DNA.

Schemat för DNA-gardiner visas i figur 1A, figur 1B och figur 1D. Den klonade målsekvensen som innehåller 25 oavbrutna upprepningar av GGAA finns i NORB1-promotorn i Ewing sarkom. Denna målsekvens är avgörande för EWS-FLI1 rekrytering28. EWS-FLI1-molekyler visualiserades genom att detektera de mCherry-märkta EWS-FLI1-signalerna erhållna med en 561 nm laser (figur 1C och ...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA at JoVE.com

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Här beskriver vi användningen av den enmolekylära avbildningsmetoden, DNA-gardiner, för att studera den biofysiska mekanismen för EWS-FLI1-kondensat som monteras på DNA.

Enmolekylär avbildning av EWS-FLI1-kondensat som monteras på DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Vi tillhandahåller en enda molekylanalys för att observera fasseparationen av transkriptionsfaktorer på DNA Denna teknik möjliggör realtidsrealisering av den dynamiska processen med transkriptionsfaktorer som monteras som en vätskedroppe på DNA. EWS-FL1 är en av de mest involverade fusionsgenerna i Ewing sarkom tumorigenesis. Vår forskning kan identifiera förhållandet mellan DNA-motivnummer och EWS-FL1-kondensatbildning som är associerad med en karg gentranskription i tumörceller, och kanske till hjälp för prognosen.Denna metod kan tillämpas för att studera alla transkriptionskondensat eller komplex in vitro, som P53 och MED1. För att förbereda en flödescell med sicksacknanotillverkade barriärer för ett DNA-gardinexperiment, anslut ingångs- och utgångsrören i rätt riktning. Tvätta sedan flödescellen med 2,5 ml lipidbuffert med två tre milliliterssprutor, så att det inte finns någon bubbla i flödescellen.Ta bort sprutan från utgången och injicera en milliliter liposomlösning tre gånger med en fem minuters inkubation mellan varje injektion. För läkning, tvätta flödescellen långsamt med 2,5 ml lipidbuffert och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter. Under inkubationen, förbered BSA-bufferten som nämns i textmanuskriptet.Tvätta sedan flödescellen med 2,5 ml BSA-buffert från utgångssidan efter 30 minuters läkning. Injicera sedan 800 mikroliter streptavidinbuffert i flödescellen från ingångssidan i två steg med en 10 minuters inkubation efter varje steg. Tvätta sedan flödescellen med 2,5 ml BSA-buffert för att ta bort alla fria streptavidinmolekyler.Späd sedan biotin Lambda-DNA med klonade motiv med BSA-buffert och injicera det fyra gånger långsamt med fem minuters mellanrum. Under injektionen, slå på mikroskopet i det vetenskapliga kompletterande metalloxidhalvledarsystemet. Tvätta sedan slangen med 10 ml dubbeldestillerat vatten och skölj prisman och slangkontakten med vatten, 2% flytande kyvettrengörare och 99% etanol.Dra sedan upp minst 20 ml av bildbufferten i en 30 ml spruta. Ställ in flödescellen på mikroskopsteget och anslut den till mikrofluidiksystemet. Använd en flödeshastighet på 0,03 ml per minut, spola DNA-molekylerna till barriären i 10 minuter.Stäng sedan av det mikrofluidiska systemet och inkubera i 30 minuter. med flödet stoppat, så att DNA kan diffundera i sidled. För att avbilda EWS-FLI1-kondensbildningen på DNA-gardiner, öppna bildprogramvaran och hitta och markera positionerna för de nio sicksackmönstren under ljusfält.Slå sedan på flödet med 0,2 ml per minut för att fläcka DNA med dubbelsträngat DNA-färgämne i 10 minuter. Späd sedan mCherry EWS-FLI1-proteinet med bildbufferten i en koncentration av 100 nanomol i 100 mikroliter. Ladda sedan proteinprovet genom ventilen med en 100 mikroliter glasspruta och ändra flödeshastigheten till 0,4 ml per minut.Efter att ha slagit på 488 nanometer laserförskannar varje region för att kontrollera DNA-fördelningstillståndet och välj det område där DNA-molekylerna fördelar sig jämnt. Ställ sedan in lasereffekten på 10% för 488 nanometerlasern och 20% för 561 nanometerlasern. Och med hjälp av effektmätaren mäter du den verkliga laserkraften nära prismat.Börja ta bilder med två sekunders intervall med både 488 och 561 nanometer lasrar samtidigt. Byt sedan ventilen från manuellt läge till injektionsläge för att låta bildbufferten spola proteinprovet i flödescellen efter 60 sekunder. För att ta bort den fria EWS-FLI1, fortsätt tvätta flödescellen med bildbufferten i fem minuter med endast 561 nanometerlasern påslagen.Stoppa sedan flödet och inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter. Efter 10 minuter, slå på flödet med 0,4 ml per minut för att låta DNA sträcka sig och förvärva bilder med två sekunders intervall mellan olika ramar för att erhålla hög genomströmningsdata för EWS-FLI1-kondensatbildning. EWS-FLI1-molekyler visualiserades genom att detektera de mCherry-märkta EWS-FLI1-signalerna erhållna med en 561 nanometerlaser.In vitro-bildningen av EWS-FLI1-kondensat vid platsen för de 25 GGAA-upprepningarna i DNA-substratet kunde visualiseras direkt. Specificiteten hos mCherry EWS-FLI1 som används i DNA-gardiner bekräftades av en elektroforetisk mobilitetsskiftanalys med hjälp av en DNA-mall med och utan de 25 GGAA-upprepningarna separat. När EWS-FLI1-koncentrationen titrerades från 20 till 500 nanomol ökade EWS-FLI1-intensiteten dramatiskt.Medan förändringen i FLI en DBD-intensitet var försumbar när proteinerna mättades för att täcka GGAA-upprepningarna, vilket tyder på att EWS-FLI1 bildade kondensat på DNA. Injektionen ska vara mycket långsam och mjuk så att liposomen och DNA kan fördelas jämnt på flödescellen. Det är viktigt att utföra MSA för att bekräfta att en renad transkriptionsfaktor specifikt binder till målsekvensen in vitro.Denna teknik gör det möjligt för människor att utforska om kondensatet kommer att underlätta målsökningen av transkriptionsfaktorer och dess effekt på transkription.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Enda molekyl Super-upplösning avbildning av Fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat i plasmamembranet med nya fluorescerande Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust och hög genomströmning enda molekyl Flow Stretching Assay genomförandet för att studera Transport av molekyler längs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Singel-molekyl Manipulation av G-quadruplexes av magnetisk pincett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalent immobilisering av proteiner för den enda molekyl kraft spektroskopin

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

En in vitro-analys för enmolekylsavbildning för analys av cap-beroende översättningskinetik

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enmolekyl fluorescens energiöverföringsstudie av ribosomproteinsyntes

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

En optimerad enmolekylär pull-down-analys för kvantifiering av proteinfosforylering

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...