Name: two peeling methods for the isolation of photoreceptor cell compartments in the mouse retina for protein analysis
Uploaded: 2021-12-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH Grant EY12155, EY027193 og EY027387 til JC. Vi er taknemmelige over for Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) og Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) for korrekturlæsning af manuskriptet. Vi vil også gerne takke Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, USA) og Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, USA) for at have leveret det nødvendige udstyr til at indsamle forfatteren leverede optagelser. Materiale fra: Kasey Rose et al,Separation of photoreceptor cell compartments in mouse netina for protein analysis, Molecular Neurodegeneration, offentliggjort [2017], [Springer Nature].

Alle forsøg blev udført i henhold til de lokale institutionelle retningslinjer fra udvalget for forskning dyrepleje fra University of Southern California (USC).
1. Levende celle retinal peeling metode
<ol><li>Tilberedning af Ames 'buffere, skrælpapir og dissektionsskål<ol>
<li>Brug stump spids iris saks (eller tilsvarende saks type) skære cellulosefilterpapiret (Grade 413) i rektangler, der måler ca. 5 mm x 2,5 mm. Opbevar stiklinger til fremtidig brug.</li>
		<li>Forb...

<ol>
	<li>Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+proteins+and+phototransduction.">G proteins and phototransduction.</a> Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).</li><li>Molday, R. S., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptors+at+a+glance.">Photoreceptors at a glance.</a> Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).</li><li>Koch, K. W., Dell'Orco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+signaling+networks+in+vertebrate+photoreceptor+cells.">Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).</li><li>Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+light+intensity+threshold+for+retinal+damage+in+albino+rats+raised+under+6+lx.">Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx.</a> Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).</li><li>Brann, M. R., Cohen, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+expression+of+transducin+mRNA+and+translocation+of+transducin+in+rods+of+rat+retina.">Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina.</a> Science. 235 (4788), 585-587 (1987).</li><li>Philp, N. J., Chang, W., Long, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-stimulated+protein+movement+in+rod+photoreceptor+cells+of+the+rat+retina.">Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina.</a> FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).</li><li>Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+induced+shift+and+binding+of+S-antigen+in+retinal+rods.">Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods.</a> Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).</li><li>Roof, D. J., Heth, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transducin+in+retinal+rod+photoreceptor+outer+segments.">Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments.</a> Science. 241 (4867), 845-847 (1988).</li><li>Sokolov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+light-driven+translocation+of+transducin+between+the+two+major+compartments+of+rod+cells:+a+novel+mechanism+of+light+adaptation.">Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation.</a> Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).</li><li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex.">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li><li>Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+translocation+is+induced+at+a+critical+threshold+of+visual+signaling+and+is+superstoichiometric+to+bleached+rhodopsin.">Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).</li><li>Nair, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+redistribution+of+arrestin+in+vertebrate+rods+is+an+energy-independent+process+governed+by+protein-protein+interactions.">Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions.</a> Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).</li><li>Strissel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recoverin+undergoes+light-dependent+intracellular+translocation+in+rod+photoreceptors.">Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).</li><li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors.">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).</li><li>Majumder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+contributes+to+rod+survival+and+enhances+synaptic+transmission+from+rods+to+rod+bipolar+cells.">Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).</li><li>Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+photoreceptors+die+(and+why+they+don't).">Why photoreceptors die (and why they don't).</a> BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).</li><li>Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+to+light+damage+in+an+arrestin+knockout+mouse+model+of+Oguchi+disease+(stationary+night+blindness).">Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness).</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin-1+expression+level+in+rods:+balancing+functional+performance+and+photoreceptor+health.">Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health.</a> Neuroscience. 174, 37-49 (2011).</li><li>McConnell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+retinal+outer+segment+fragments.">The isolation of retinal outer segment fragments.</a> The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).</li><li>Tsang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+target+enzyme+in+deactivation+of+photoreceptor+G+protein+in+vivo.">Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo.</a> Science. 282 (5386), 117-121 (1998).</li><li>Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recordings+of+retinal+bipolar+cells+in+response+to+extracellular+electrical+stimulation+in+wholemount+mouse+retina.">Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).</li><li>Guido, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+obtain+retinal+cell+preparations+highly+enriched+in+specific+cell+types.+Suitability+for+lipid+metabolism+studies.">A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies.</a> Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).</li><li>Hayashi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+by+cyclin-dependent+protein+kinase+5+of+the+regulatory+subunit+of+retinal+cGMP+phosphodiesterase.+II.+Its+role+in+the+turnoff+of+phosphodiesterase+in+vivo.">Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).</li><li>Wolbring, G., Cook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+and+characterization+of+protein+kinase+C+from+bovine+retinal+rod+outer+segments.">Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments.</a> European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).</li><li>Williams, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+kinase+C+in+photoreceptor+outer+segments.">Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments.</a> Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).</li><li>Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+form+of+the+G+protein+beta+subunit+Gbeta5+is+specifically+expressed+in+the+vertebrate+retina.">A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).</li><li>Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTPase+activating+factor+for+transducin+in+rod+photoreceptors+is+the+complex+between+RGS9+and+type+5+G+protein+beta+subunit.">The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).</li><li>Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+rhodopsin/arrestin+complex+leads+to+retinal+degeneration+in+a+transgenic+mouse+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.">Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).</li><li>Chen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+photoresponses+and+light-induced+apoptosis+in+rods+lacking+rhodopsin+kinase.">Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mistrafficking+of+prenylated+proteins+causes+retinitis+pigmentosa+2.">Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2.</a> FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).</li><li>Weiss, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+differences+in+expression+of+G-protein-coupled+receptor+kinase+(GRK)+7+and+GRK1+in+mammalian+cone+photoreceptor+cells:+implications+for+cone+cell+phototransduction.">Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).</li><li>Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+forms+of+human+rhodopsin+kinase+(GRK1).">Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1).</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).</li><li>Newton, A. C., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+protein+kinase+C+in+the+phosphorylation+of+rhodopsin.">Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).</li><li>Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+protein+kinase+C+isoforms+are+required+for+rod+photoreceptor+differentiation.">Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).</li><li>Sokal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+kinase+C+isozymes+responsible+for+the+phosphorylation+of+photoreceptor-specific+RGS9-1+at+Ser475.">Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).</li><li>Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+photoreceptor+cell+compartments+in+mouse+retina+for+protein+analysis.">Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).</li><li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+degeneration:+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait.">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li></ol>

Mange retinale sygdomme påvirker stangfotoreceptorceller, hvilket fører til stangdød og i sidste ende fuldstændigt synstab37. En betydelig del af den genetiske og mekanistiske oprindelse af menneskelig retinal degeneration er med succes blevet rekapituleret i adskillige musemodeller gennem årene. I den sammenhæng vil evnen til let og selektivt at adskille individuelle stang subcellulære rum fra den lille muse nethinde i høj grad forbedre vores forståelse af de lokaliserede biokemiske og m...

Rodfotoreceptorceller, tæt pakket i det yderste lag af den neurale nethinde, er en integreret del af svagt lyssyn. For at fungere som trofaste fotontællere bruger stænger en G-proteinbaseret signalvej, nævnt fototransduktion, til at generere hurtige, forstærkede og reproducerbare reaktioner på enkelt fotonoptagelse. Denne reaktion på lys udløser i sidste ende en ændring i strømmen ved plasmamembranen og signaleres efterfølgende til resten af det visuelle system1. Som navnet antyder, har hver stangcelle en særskilt stanglignende form og udviser en stærkt polariseret cellulær morfologi, der består af et ydre segment (OS), indre segment (IS), cellelegeme (CB) og synaptisk terminal (ST). Hvert subcellulært rum har specifikke proteinmaskiner (membranbundne og opløselige), biomolekylære egenskaber og proteinkomplekser, der spiller afgørende roller såsom visuel fototransduktion, generel husholdning og proteinsyntese og synaptisk transmission2,3.
For over 30 år siden blev den lysafhængige gensidige bevægelse af subcellulære proteiner, specifikt transducin (væk fra operativsystemet) og arrestin (mod operativsystemet), først observeret4,5,6,7. Tidligt blev dette observerede fænomen modtaget med skepsis, delvis på grund af immunhistokemiens sårbarhed over for epitopmaskering8. I begyndelsen af 2000'erne blev stimulusafhængig proteintranslokation bekræftet ved hjælp af en streng og besværlig fysisk sektioneringsteknik9. Seriel tangentiel sektionering af den frosne fladmonterede gnaver nethinde efterfulgt af immunoblotting afslørede, at transducin9,10, arrestin11,12 og recoverin13 alle gennemgår subcellulær omfordeling som reaktion på lys. Det antages, at lysdrevet translokation af disse vigtige signalproteiner ikke kun regulerer følsomheden af fototransduktionskaskaden9,14,15, men kan også være neurobeskyttende mod lysskader16,17,18. Fordi lysdrevet proteintransport i stænger synes at være meget vigtig for stangcellebiologi og fysiologi, er teknikker, der tillader isolering af forskellige subcellulære rum til bestemmelse af proteinfordeling, værdifulde forskningsværktøjer.
I øjeblikket er der et par metoder, der tager sigte på at isolere stangens subcellulære rum. Disse metoder kan dog være langvarige og vanskelige at reproducere eller kræve en betydelig mængde retinal isolat. Stangens ydre segment (ROS) præparater via densitetsgradientcentrifugering19 anvendes for eksempel almindeligvis til at adskille ROS fra retinal homogenat. Denne metode anvendes i vid udstrækning til western blot, men proceduren er meget tidskrævende og kræver mindst 8-12 murine retinae20. På den anden side er seriel tangentiel sektionering af frossen murine og rotte nethinde blevet implementeret med succes i isolering af OS, IS, CB og ST9,11,13. Denne metode er imidlertid teknisk udfordrende på grund af nødvendigheden af fuldt ud at flade den lille og stærkt buede murin nethinde for at justere retinale lag inden tangentiel sektionering. Da der er en overflod af musemodeller og transgene mus, der rekapitulerer sygdomme i det visuelle system, er oprettelsen af en teknik, der pålideligt, hurtigt og let adskiller individuelle stangrum, lovende med at afsløre de fysiologiske processer, der forekommer i hvert specialiseret rum og de mekanismer, der ligger til grund for visuelle processer inden for sundhed og sygdom.
For at lette disse undersøgelser beskriver vi to skrælningsmetoder, der lettere isolerer stangens subcellulære rum end de nuværende protokoller. Den første peelingmetode, der er tilpasset fra en teknik til at udsætte fluorescerende mærkede bipolære celler til optagelse af plasterklemmer21, anvender cellulosefilterpapir til sekventielt at fjerne ROS fra en levende, isoleret murin nethinde (figur 1). Den anden metode, tilpasset fra en procedure, der isolerer de tre primære retinale cellelag fra en chick22 og frog23 nethinden, bruger klæbebånd til at fjerne ROS og stangens indre segment (RIS) fra en lyofiliseret nethinden (figur 2). Begge procedurer kan gennemføres på 1 time og er betydeligt brugervenlige. Vi leverer validering af effektiviteten af disse to separationsprotokoller for western blot ved at anvende mørketilpasset og lyseponeret nethinde fra C57BL/6J-mus til at demonstrere lysinduceret translokation af stangtransducin (GNAT1) og arrestin (ARR1). Desuden giver vi ved hjælp af båndskrælningsmetoden yderligere bevis for, at vores teknik kan bruges til at undersøge og adressere uoverensstemmelser mellem proteinlokaliseringsdata erhvervet af immunocytokemi (ICC) og vestlige blots. Specifikt viste vores teknik, at: 1) proteinkinase C-alfa (PKCα) isoform er til stede ikke kun i bipolære celler, men også i murin ROS og RIS, omend i lave koncentrationer24,25, og 2) rhodopsinkinase (GRK1) er overvejende til stede i den isolerede OS-prøve. Disse data viser effektiviteten af vores to peelingteknikker til adskillelse og kvantificering af specifikke stang- og retinale proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% O2 tank</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X SDS Sample Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>70607-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 and 5% CO2 tank</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames&#8217; Medium with L-glutamine, without bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 (99%, dihydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite (Anhydrous calcium sulfate, &#62;98% CaSO4, &#62;2% CoCl2)</td>
			<td>WA Hammond Drierite Co LTD</td>
			<td>21005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm)</td>
			<td>Falcon-Corning</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Falcon-Corning</td>
			<td>08-772F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Scalpel (No. 10, 40 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100499-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Scalpel (No. 11, 40 mm)</td>
			<td>VWT</td>
			<td>100499-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (99%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes pellet pestle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>z359971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Fast-Freeze Flasks</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q/de-ionized water</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (powder)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4062-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (crystal)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Sx0420-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur EDTA</td>
			<td>EMD</td>
			<td>4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur HEPES, Free Acid</td>
			<td>EMD</td>
			<td>5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Wrap Aluminum Foil</td>
			<td>Reynolds Brands</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m)</td>
			<td>Scotch-3M</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D67501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrafuge mini centrifuge</td>
			<td>Labnet International, Inc</td>
			<td>C1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue incubation chamber (purchased or custom made)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4103-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Signma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 &#956;m)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28310-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 &#956;m)</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore transfer pipet, Global Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76285-362</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two peeling methods for the isolation of photoreceptor cell compartments in the mouse retina for protein analysis

Rodfotoreceptorer er stærkt polariserede sensoriske neuroner med forskellige rum. Musestænger er lange (~ 80 μm) og tynde (~ 2 μm) og pakkes sideværts i det yderste lag af nethinden, fotoreceptorlaget, hvilket resulterer i justering af analoge subcellulære rum. Traditionelt er tangentiel sektionering af den frosne fladmonterede nethinde blevet brugt til at studere bevægelsen og lokaliseringen af proteiner inden for forskellige stangrum. Den høje krumning af den stangdominerende musenehinden gør imidlertid tangentiel sektionering udfordrende. Motiveret af undersøgelsen af proteintransport mellem rum udviklede vi to skrælningsmetoder, der pålideligt isolerer stangens ydre segment (ROS) og andre subcellulære rum til vestlige pletter. Vores relativt hurtige og enkle teknikker leverer berigede og subcellulære specifikke fraktioner til kvantitativt at måle fordelingen og omfordelingen af vigtige fotoreceptorproteiner i normale stænger. Desuden kan disse isolationsteknikker også let tilpasses til at isolere og kvantitativt undersøge proteinsammensætningen af andre cellulære lag inden for både sund og degenererende nethinde.

De nuværende strategier blev udviklet til at give relativt hurtige og enkle metoder til at isolere og analysere proteiner blandt specifikke stang subcellulære rum til western blot analyse. Vi anvendte to sekventielle peelingteknikker (figur 1 og figur 2) efterfulgt af immunoblotting for at påvise, at disse metoder pålideligt kunne anvendes til at påvise den kendte fordeling af stangtransducin (GNAT1) og arrestin (ARR1) hos både mørke- og lystilpassede dyr...

Watch this Scientific Journal Video about Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis at JoVE.com

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

Denne protokol præsenterer to teknikker til at isolere de subcellulære rum af murine stang fotoreceptorer til proteinanalyse. Den første metode bruger levende nethinde- og cellulosefilterpapir til at adskille stangens ydre segmenter, mens den anden anvender lyofiliseret nethinde og klæbebånd til at skrælle stangens indre og ydre segmentlag væk.

To peelingmetoder til isolering af fotoreceptorcellerum i musenehinden til proteinanalyse

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

De to peelingteknikker, der demonstreres her, isolerer individuelle stang subcellulære rum og kan hjælpe med at afsløre de vigtige fysiologiske processer, der forekommer i hvert specialiseret rum i sunde og syge stænger. Det kan være en udfordring at isolere forskellige stangcellerum fra musenehinden. Disse enkle teknikker bruger billige og almindelige laboratoriematerialer til pålideligt at isolere stangens subcellulære rum til proteinanalyse.Til at begynde med skal du placere et stykke filterpapir i en petriskål fyldt med Ames HEPES-buffer boblet med 100% ilt. Derefter overføres en retinal rektangel dissekeret fra en to til tre måneder gammel C57 Black 6J-mus ved hjælp af en bredboret overførselspipette. Orienter den opdelte nethinde konkav op og sørg for, at fotoreceptorerne vender ned mod bunden af fadet.Brug derefter pincet til let at gribe fat i siderne af den halverede nethinde og flyt den oven på filterpapiret. Når nethinden er centreret, skal du flytte filterpapiret opad, så den halverede nethinde berører filterpapiret for at skabe stangens ydre segment eller ROS for at filtrere papiradhæsion. Løft forsigtigt filterpapiret med den fastgjorte nethinde ud af Ames HEPES-bufferen.Læg undersiden af filterpapiret på et køkkenrulle, og dup to til tre gange for at tørre. Tilsæt en dråbe Ames HEPES på siden af filterpapiret med nethinden, og læg filterpapiret på papirhåndklædet igen for at tørre. Læg derefter filterpapiret med nethinden tilbage i petriskålen, og skub forsigtigt alle kanter af den halverede nethinde op og væk fra filterpapiret på alle sider med en pincet.Skræl nethinden delikat væk fra filterpapiret, og rør kun ved nethindens ekstreme omkreds for at bevare dens strukturelle integritet. Løft derefter filterpapiret fra petriskålen og fjern overskydende væske på et papirhåndklæde, og sikre, at den side, der er i kontakt med nethinden, ikke kommer i kontakt med papirhåndklædet. Læg filterpapiret med det delvise ROS-lag i et mærket rør på is, og hold den skrællede nethinde nedsænket i Ames HEPES-buffer.Gentag skrælningsprocessen for denne halverede nethinde cirka syv til otte gange for at fjerne hele ROS-laget. Efter hver skræl skal du placere filterpapiret i det samme rør for at kombinere al ROS isoleret fra en halveret nethinden. Opbevar røret, der indeholder alle filterpapirskræller af den isolerede ROS, på is til øjeblikkelig brug.Brug pincet til at overføre den resterende skrællede nethinde til et passende mærket rør og holde røret på is til øjeblikkelig brug. For at forberede retinalprøven til lyofilisering skal du placere et stykke filterpapir og overføre en halveret nethinde til en petriskål fyldt med kold Ringers buffer. Brug derefter pincetten til forsigtigt at vende nethinden, så den er orienteret konkavt op og flyt den til hvile oven på filterpapiret.Løft filterpapiret ved kanterne opad, så det halverede stykke nethinde berører filterpapiret. Fortsæt med at løfte filterpapiret ud af Ringers løsning. Læg derefter undersiden af filterpapiret på et papirhåndklæde og dup forsigtigt to til tre gange for at fjerne overskydende væske.Tag derefter filterpapiret op med en pincet og tilsæt en dråbe kolde Ringer's på siden af filterpapiret med nethinden. Læg igen filterpapiret på papirhåndklædet for at fjerne overskydende væske. Opbevar hver vedhæftet nethinde- og filterpapirprøve i en petriskål fyldt med kolde Ringer's, indtil den er klar til at fryse alle prøver.Løft derefter hver prøve ud af den kolde Ringers buffer ved hjælp af pincet, og det sikres, at pincetten kun kommer i kontakt med filterpapirkanterne og undgår den halverede nethinde. Læg undersiden af hvert filterpapir på et papirhåndklæde for at fjerne overskydende væske. Tilsæt derefter en dråbe kold PBS på siden af filterpapiret, hvor nethinden klæbes, og dup filterpapiret på papirhåndklædet igen.Læg alle filterpapirstykker i petriskålen, og brug fnugfrit silkepapir til at transportere overskydende væske, der omgiver filterpapiret, væk. Pak derefter hele fadet tæt ind med aluminiumsfolie og sørg for, at aluminiumsfoliens kanter er fastgjort og glat presset ind i bunden af petriskålen. Punktere en håndfuld 0,1 til 0,2 millimeter huller i aluminiumsfoliens låg.Derefter sænkes den aluminiumsfoliedækkede petriskål gradvist til flydende nitrogen ved hjælp af metaltang. Opbevar prøverne i flydende nitrogen, indtil de er klar til lyofilisering. Til lyofilisering anbringes den aluminiumsfoliedækkede petriskål i en frysetørringskolbe og fastgøres til lyophilizer-maskinen efter producentens protokol.Lyofiliser nethinden i 30 minutter. Efter lyofilisering skal du samle stangens ydre og indre segment ved forsigtigt at lægge et lille stykke tape oven på den lyofiliserede nethinde og anvende let tryk med pincetten for at sikre, at den binder sig til fotoreceptorlaget. Skræl langsomt tapen væk, og sørg for, at både ROS og RIS har klæbet til båndet.En tynd, hvid film vil være til stede ved den brudte overflade. Dette er RIS. For at adskille denne RIS skal du placere et andet stykke tape og skubbe båndet ned på den brudte overflade.Anbring derefter tapestykket med kun det orange-lyserøde lag i et mikrocentrifugerør mærket som ROS og stykker tape med det tynde, hvide lag i et andet rør mærket RIS. Derefter samles det resterende retinale væv placeret på filterpapiret ved hjælp af tape ved at skrælle det tykke, hvide lag af. Anbring derefter dette isolat i et rør mærket OIS.Hvis du bruger samme dag, skal du opbevare de isolerede lag fra den lyofiliserede nethinde ved stuetemperatur. Hos mørkt tilpassede dyr matchede fordelingen af GNAT1 og ARR1 nøje deres kendte mørktilstandsfordelinger, hvor GNAT1-signalet var synligt stærkest i ROS-isolationen, og ARR1-signalet var mere robust i ROS-isolationen. Kvantificering af GNAT1- og ARR1-signalerne viste signifikante forskelle mellem mørkelysforholdene for GNAT1 og ARR1 i ROS- og ROS-prøver.I både mørke og lyse tilpassede prøver udelukkes G-beat 5S, cytokrom C og actinsignaler fra ROS-prøverne, hvilket viser fravær af kontaminering fra andre cellulære lag. Derudover var G beta 5L-signalet tydeligt synligt i ROS-prøverne. Scanning elektronmikroskopi af overfladerne af intakt og skrællet lyofiliseret nethinde viste, at overfladen af intakt lyofiliseret nethinde, før den skrælles med tape, nøje matchede den karakteristiske cylindriske ROS.Efter den indledende båndskræl syntes ROS og RIS at være helt fjernet, som det fremgår af det ensartede nukleare lag, der er til stede på overfladen af den resterende, skrællede, lyofiliserede nethinden. Efterfølgende båndskræl fjernede RIS fra den frie overflade af det skrællede lag. Denne teknik viste også, at GRK1-immunreaktivitet var mest intens i ROS-prøver i lyseksponeret nethinde og fraværende i OIS-prøver.Omvendt viste ROS- og RIS-prøver et svagt signal for PKC alpha, som almindeligvis ikke påvises i ROS eller RIS ved immunofluorescensfarvning. Endelig kan suboptimal tape peeling give let forurenede prøver. RIS-prøven var forurenet med nogle OIS-prøver, der producerede både G beta 5L- og G beta 5S-bånd og et højere PKC-alfa-signal.Der skal udvises forsigtighed ved lyofilisering af nethinden. Hvis der anvendes en forkert lyofiliseringsteknik, kan nethinden smelte, hvilket gør det umuligt at isolere forskellige stangundercellulære lag med tape. Brug af denne båndskrælningsmetode i forbindelse med qRT-PCR har gjort det muligt at adskille fotoreceptortranskripter fra resten af nethinden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Adult Neurogenesis

Metoder til Modulation og analyse af NF-KB-afhængige Adult Neurogenese

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, to kulturer: isolering og dyrkning af voksne neurale stamceller fra Two Neurogene zoner Individuel Mus

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Vurdering af Vascular Regeneration i CNS Brug af musen Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratome Sektionsinddeling Mouse Retina Forbered fotoreceptoren kulturer

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Metoder til Cell-attached kapacitansmålinger i Mus Adrenal chromaffinceller Cell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics i Cone Lysmodtageren Axon Terminals i Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Dybdegående Fysiologisk Analyse af Definerede Cell populationer i Akut Tissue Skiver af Mouse vomeronasale organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Hvor du klippe spørgsmål: En dissektion og analyse Guide for den rumlige orientering af musen nethinden fra okulær vartegn

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo To-foton billeddannelse af kortikale neuroner i Neonatal mus

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...