Name: two peeling methods for the isolation of photoreceptor cell compartments in the mouse retina for protein analysis
Uploaded: 2021-12-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH Grant EY12155, EY027193 en EY027387 aan JC. We zijn Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) en Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) dankbaar voor het proeflezen van het manuscript. We willen ook Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, VS) en Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, VS) bedanken voor het leveren van de benodigde apparatuur om de door de auteur verstrekte beelden te verzamelen. Materiaal van: Kasey Rose et al, Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis, Molecular Neurodegeneration, published [2017], [Springer Nature].

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de lokale institutionele richtlijnen van de commissie voor dierverzorging van de University of Southern California (USC).
1. Live cell retinal peeling methode
<ol><li>Bereiding van Ames' buffers, schilpapier en dissectieschotel<ol>
<li>Knip met een irisschaar met stompe punt (of een gelijkwaardig schaartype) het cellulosefilterpapier (grade 413) in rechthoeken van ongeveer 5 mm x 2,5 mm. Bewaar de stekken voor toekomstig gebruik.</...

<ol>
	<li>Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+proteins+and+phototransduction.">G proteins and phototransduction.</a> Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).</li><li>Molday, R. S., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptors+at+a+glance.">Photoreceptors at a glance.</a> Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).</li><li>Koch, K. W., Dell'Orco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+signaling+networks+in+vertebrate+photoreceptor+cells.">Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).</li><li>Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+light+intensity+threshold+for+retinal+damage+in+albino+rats+raised+under+6+lx.">Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx.</a> Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).</li><li>Brann, M. R., Cohen, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+expression+of+transducin+mRNA+and+translocation+of+transducin+in+rods+of+rat+retina.">Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina.</a> Science. 235 (4788), 585-587 (1987).</li><li>Philp, N. J., Chang, W., Long, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-stimulated+protein+movement+in+rod+photoreceptor+cells+of+the+rat+retina.">Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina.</a> FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).</li><li>Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+induced+shift+and+binding+of+S-antigen+in+retinal+rods.">Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods.</a> Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).</li><li>Roof, D. J., Heth, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transducin+in+retinal+rod+photoreceptor+outer+segments.">Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments.</a> Science. 241 (4867), 845-847 (1988).</li><li>Sokolov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+light-driven+translocation+of+transducin+between+the+two+major+compartments+of+rod+cells:+a+novel+mechanism+of+light+adaptation.">Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation.</a> Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).</li><li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex.">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li><li>Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+translocation+is+induced+at+a+critical+threshold+of+visual+signaling+and+is+superstoichiometric+to+bleached+rhodopsin.">Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).</li><li>Nair, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+redistribution+of+arrestin+in+vertebrate+rods+is+an+energy-independent+process+governed+by+protein-protein+interactions.">Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions.</a> Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).</li><li>Strissel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recoverin+undergoes+light-dependent+intracellular+translocation+in+rod+photoreceptors.">Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).</li><li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors.">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).</li><li>Majumder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+contributes+to+rod+survival+and+enhances+synaptic+transmission+from+rods+to+rod+bipolar+cells.">Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).</li><li>Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+photoreceptors+die+(and+why+they+don't).">Why photoreceptors die (and why they don't).</a> BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).</li><li>Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+to+light+damage+in+an+arrestin+knockout+mouse+model+of+Oguchi+disease+(stationary+night+blindness).">Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness).</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin-1+expression+level+in+rods:+balancing+functional+performance+and+photoreceptor+health.">Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health.</a> Neuroscience. 174, 37-49 (2011).</li><li>McConnell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+retinal+outer+segment+fragments.">The isolation of retinal outer segment fragments.</a> The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).</li><li>Tsang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+target+enzyme+in+deactivation+of+photoreceptor+G+protein+in+vivo.">Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo.</a> Science. 282 (5386), 117-121 (1998).</li><li>Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recordings+of+retinal+bipolar+cells+in+response+to+extracellular+electrical+stimulation+in+wholemount+mouse+retina.">Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).</li><li>Guido, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+obtain+retinal+cell+preparations+highly+enriched+in+specific+cell+types.+Suitability+for+lipid+metabolism+studies.">A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies.</a> Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).</li><li>Hayashi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+by+cyclin-dependent+protein+kinase+5+of+the+regulatory+subunit+of+retinal+cGMP+phosphodiesterase.+II.+Its+role+in+the+turnoff+of+phosphodiesterase+in+vivo.">Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).</li><li>Wolbring, G., Cook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+and+characterization+of+protein+kinase+C+from+bovine+retinal+rod+outer+segments.">Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments.</a> European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).</li><li>Williams, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+kinase+C+in+photoreceptor+outer+segments.">Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments.</a> Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).</li><li>Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+form+of+the+G+protein+beta+subunit+Gbeta5+is+specifically+expressed+in+the+vertebrate+retina.">A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).</li><li>Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTPase+activating+factor+for+transducin+in+rod+photoreceptors+is+the+complex+between+RGS9+and+type+5+G+protein+beta+subunit.">The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).</li><li>Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+rhodopsin/arrestin+complex+leads+to+retinal+degeneration+in+a+transgenic+mouse+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.">Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).</li><li>Chen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+photoresponses+and+light-induced+apoptosis+in+rods+lacking+rhodopsin+kinase.">Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mistrafficking+of+prenylated+proteins+causes+retinitis+pigmentosa+2.">Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2.</a> FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).</li><li>Weiss, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+differences+in+expression+of+G-protein-coupled+receptor+kinase+(GRK)+7+and+GRK1+in+mammalian+cone+photoreceptor+cells:+implications+for+cone+cell+phototransduction.">Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).</li><li>Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+forms+of+human+rhodopsin+kinase+(GRK1).">Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1).</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).</li><li>Newton, A. C., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+protein+kinase+C+in+the+phosphorylation+of+rhodopsin.">Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).</li><li>Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+protein+kinase+C+isoforms+are+required+for+rod+photoreceptor+differentiation.">Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).</li><li>Sokal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+kinase+C+isozymes+responsible+for+the+phosphorylation+of+photoreceptor-specific+RGS9-1+at+Ser475.">Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).</li><li>Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+photoreceptor+cell+compartments+in+mouse+retina+for+protein+analysis.">Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).</li><li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+degeneration:+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait.">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li></ol>

Veel retinale ziekten beïnvloeden staaffotoreceptorcellen, wat leidt tot staafdood en uiteindelijk volledig verlies van het gezichtsvermogen37. Een aanzienlijk deel van de genetische en mechanistische oorsprong van menselijke retinale degeneratie is in de loop der jaren met succes samengevat in tal van muismodellen. In die context zou het vermogen om gemakkelijk en selectief individuele staafsubcellulaire compartimenten van het kleine muizennet te scheiden ons begrip van de gelokaliseerde biochem...

Staaffotoreceptorcellen, strak verpakt in de buitenste laag van het neurale netvlies, zijn een integraal onderdeel van het zicht op zwak licht. Om te functioneren als getrouwe fotonentellers, gebruiken staafjes een op G-eiwit gebaseerde signaalroute, fototransductie genaamd, om snelle, versterkte en reproduceerbare reacties op het vastleggen van enkele fotonen te genereren. Deze reactie op licht veroorzaakt uiteindelijk een verandering in de stroom bij het plasmamembraan en wordt vervolgens gesignaleerd aan de rest van het visuele systeem1. Zoals hun naam al aangeeft, heeft elke staafcel een verschillende staafachtige vorm en vertoont een sterk gepolariseerde cellulaire morfologie, bestaande uit een buitenste segment (OS), binnensegment (IS), cellichaam (CB) en synaptische terminal (ST). Elk subcellulair compartiment heeft specifieke eiwitmachines (membraangebonden en oplosbaar), biomoleculaire kenmerken en eiwitcomplexen die een cruciale rol spelen, zoals visuele fototransductie, algemene huishouding en eiwitsynthese, en synaptische transmissie2,3.
Meer dan 30 jaar geleden werd de lichtafhankelijke wederzijdse beweging van subcellulaire eiwitten, met name transducine (weg van het OS) en arrestine (naar het OS), voor het eerst waargenomen4,5,6,7. Al vroeg werd dit waargenomen fenomeen met scepsis ontvangen, deels vanwege de kwetsbaarheid van immunohistochemie voor epitoopmaskering8. In de vroege jaren 2000 werd stimulusafhankelijke eiwittranslocatie bevestigd met behulp van een rigoureuze en zware fysieke sectietechniek9. Seriële tangentiële sectie van het bevroren plat gemonteerde knaagdier retinae gevolgd door immunoblotting onthulde dat transducine9,10, arrestin11,12 en recoveryin13 allemaal subcellulaire herverdeling ondergaan als reactie op licht. Er wordt aangenomen dat lichtgestuurde translocatie van deze belangrijke signaaleiwitten niet alleen de gevoeligheid van de fototransductiecascade9,14,15 reguleert, maar ook neuroprotectief kan zijn tegen lichtschade16,17,18. Omdat lichtgedreven eiwittransport in staven zeer belangrijk lijkt te zijn voor de biologie en fysiologie van staafcellen, zijn technieken die de isolatie van verschillende subcellulaire compartimenten mogelijk maken om de eiwitverdeling te bepalen waardevolle onderzoeksinstrumenten.
Momenteel zijn er een paar methoden gericht op het isoleren van de staafsubcellulaire compartimenten. Deze methoden kunnen echter lang en moeilijk te reproduceren zijn, of vereisen een aanzienlijke hoeveelheid retinaal isolaat. Staaf buitensegment (ROS) preparaten via dichtheidsgradiënt centrifugatie19 wordt bijvoorbeeld vaak gebruikt om de ROS te scheiden van retinaal homogenaat. Deze methode wordt veel gebruikt voor western blot, maar de procedure is zeer tijdrovend en vereist een minimum van 8-12 murine retinae20. Aan de andere kant is seriële tangentiële sectie van bevroren murine en rat retinae met succes geïmplementeerd bij het isoleren van het OS, IS, CB en ST9,11,13. Deze methode is echter technisch uitdagend vanwege de noodzaak om het kleine en sterk gebogen muriene netvlies volledig af te vlakken om de retinale lagen uit te lijnen voorafgaand aan tangentiële sectie. Aangezien er een overvloed aan muismodellen en transgene muizen zijn die ziekten van het visuele systeem samenvatten, is de creatie van een techniek die betrouwbaar, snel en gemakkelijk individuele staafcompartimenten scheidt veelbelovend bij het onthullen van de fysiologische processen die zich voordoen in elk gespecialiseerd compartiment en de mechanismen die ten grondslag liggen aan visuele processen in gezondheid en ziekte.
Om deze onderzoeken te vergemakkelijken, beschrijven we twee peelingmethoden die staafsubcellulaire compartimenten gemakkelijker isoleren dan de huidige protocollen. De eerste peelingmethode, aangepast van een techniek om fluorescerend gelabelde bipolaire cellen bloot te leggen voor patchklemregistratie21, maakt gebruik van cellulosefilterpapier om de ROS sequentieel te verwijderen van een levend, geïsoleerd murine netvlies (figuur 1). De tweede methode, aangepast van een procedure die de drie primaire retinale cellagen isoleert van een chick22 en frog23 retina, maakt gebruik van plakband om het ROS- en staafbinnensegment (RIS) van een gelyofiliseerd netvlies te verwijderen (figuur 2). Beide procedures kunnen in 1 uur worden voltooid en zijn aanzienlijk gebruiksvriendelijk. We bieden validatie van de effectiviteit van deze twee scheidingsprotocollen voor western blot door gebruik te maken van donker-aangepast en aan licht blootgesteld netvlies van C57BL / 6J-muizen om lichtgeïnduceerde translocatie van staaftransducine (GNAT1) en arrestine (ARR1) aan te tonen. Bovendien leveren we met behulp van de tape peeling-methode aanvullend bewijs dat onze techniek kan worden gebruikt om inconsistenties tussen eiwitlokalisatiegegevens verkregen door immunocytochemie (ICC) en western blots te onderzoeken en aan te pakken. Concreet toonde onze techniek aan dat: 1) het eiwitkinase C-alfa (PKCα) isovorm niet alleen aanwezig is in bipolaire cellen, maar ook in murine ROS en RIS, zij het in lage concentraties24,25, en 2) rhodopsinekinase (GRK1) voornamelijk aanwezig is in het geïsoleerde OS-monster. Deze gegevens tonen de effectiviteit aan van onze twee peelingtechnieken voor het scheiden en kwantificeren van specifieke staaf- en retinale eiwitten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% O2 tank</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X SDS Sample Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>70607-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 and 5% CO2 tank</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames&#8217; Medium with L-glutamine, without bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 (99%, dihydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite (Anhydrous calcium sulfate, &#62;98% CaSO4, &#62;2% CoCl2)</td>
			<td>WA Hammond Drierite Co LTD</td>
			<td>21005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm)</td>
			<td>Falcon-Corning</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Falcon-Corning</td>
			<td>08-772F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Scalpel (No. 10, 40 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100499-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Scalpel (No. 11, 40 mm)</td>
			<td>VWT</td>
			<td>100499-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (99%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes pellet pestle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>z359971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Fast-Freeze Flasks</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q/de-ionized water</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (powder)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4062-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (crystal)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Sx0420-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur EDTA</td>
			<td>EMD</td>
			<td>4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur HEPES, Free Acid</td>
			<td>EMD</td>
			<td>5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Wrap Aluminum Foil</td>
			<td>Reynolds Brands</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m)</td>
			<td>Scotch-3M</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D67501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrafuge mini centrifuge</td>
			<td>Labnet International, Inc</td>
			<td>C1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue incubation chamber (purchased or custom made)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4103-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Signma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 &#956;m)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28310-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 &#956;m)</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore transfer pipet, Global Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76285-362</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two peeling methods for the isolation of photoreceptor cell compartments in the mouse retina for protein analysis

Staaffotoreceptoren zijn sterk gepolariseerde sensorische neuronen met verschillende compartimenten. Muizenstaafjes zijn lang (~ 80 μm) en dun (~ 2 μm) en zijn zijdelings verpakt in de buitenste laag van het netvlies, de fotoreceptorlaag, wat resulteert in uitlijning van analoge subcellulaire compartimenten. Traditioneel is tangentiële sectie van het bevroren plat gemonteerde netvlies gebruikt om de beweging en lokalisatie van eiwitten binnen verschillende staafcompartimenten te bestuderen. De hoge kromming van het staaf-dominante muizennet maakt tangentiële sectie echter een uitdaging. Gemotiveerd door de studie van eiwittransport tussen compartimenten, ontwikkelden we twee peelingmethoden die het staafbuitensegment (ROS) en andere subcellulaire compartimenten voor western blots betrouwbaar isoleren. Onze relatief snelle en eenvoudige technieken leveren verrijkte en subcellulair-specifieke fracties om de verdeling en herverdeling van belangrijke fotoreceptoreiwitten in normale staafjes kwantitatief te meten. Bovendien kunnen deze isolatietechnieken ook gemakkelijk worden aangepast om de eiwitsamenstelling van andere cellulaire lagen in zowel gezond als degenererend netvlies te isoleren en kwantitatief te onderzoeken.

De huidige strategieën zijn ontwikkeld om relatief snelle en eenvoudige methoden te bieden om eiwitten te isoleren en te analyseren tussen specifieke staafsubcellulaire compartimenten voor western blot-analyse. We pasten twee sequentiële peelingtechnieken toe (figuur 1 en figuur 2), gevolgd door immunoblotting om aan te tonen dat deze methoden betrouwbaar kunnen worden gebruikt om de bekende verdeling van staaftransducine (GNAT1) en arrestine (ARR1) bij zowel ...

Watch this Scientific Journal Video about Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis at JoVE.com

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

Dit protocol presenteert twee technieken om de subcellulaire compartimenten van muizenstaaffotoreceptoren te isoleren voor eiwitanalyse. De eerste methode maakt gebruik van levend retinae en cellulosefilterpapier om de buitenste segmenten van de staaf te scheiden, terwijl de tweede gebruik maakt van gelyofiliseerd netvlies en plakband om de binnenste en buitenste segmentlagen van de staaf weg te pellen.

Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

De twee peelingtechnieken die hier worden gedemonstreerd, isoleren individuele staafsubcellulaire compartimenten en kunnen helpen de belangrijke fysiologische processen te onthullen die zich in elk gespecialiseerd compartiment voordoen bij gezonde en zieke staafjes. Het isoleren van verschillende staafcelcompartimenten van het netvlies van de muis kan een uitdaging zijn. Deze eenvoudige technieken maken gebruik van goedkope en alledaagse laboratoriummaterialen om staafsubcellulaire compartimenten betrouwbaar te isoleren voor eiwitanalyse.Plaats om te beginnen een stuk filterpapier in een petrischaal gevuld met Ames HEPES-buffer met 100% zuurstof. Breng vervolgens met behulp van een transpetpet met brede boring één retinale rechthoek over die is ontleed van een twee tot drie maanden oude C57 Black 6J-muis. Oriënteer het gewanden van het netvlies omhoog en zorg ervoor dat de fotoreceptoren naar beneden gericht zijn naar de onderkant van de schaal.Pak vervolgens met een pincet de zijkanten van het gehalveerde netvlies lichtjes vast en beweeg deze bovenop het filterpapier. Zodra het netvlies gecentreerd is, beweegt u het filterpapier naar boven zodat het gehalveerde netvlies het filterpapier raakt om het buitenste segment van de staaf te maken, of ROS om de hechting van het papier te filteren. Til het filterpapier met het aangesloten netvlies voorzichtig uit de Ames HEPES-buffer.Leg de onderkant van het filtreerpapier op een keukenpapier en dep twee tot drie keer om te drogen. Voeg een druppel Ames HEPES toe aan de zijkant van het filterpapier met het netvlies en leg het filtreerpapier opnieuw op het keukenpapier om te drogen. Plaats vervolgens het filterpapier met het netvlies terug in de petrischaal en duw met een pincet voorzichtig alle randen van het gehalveerde netvlies aan alle kanten omhoog en weg van het filterpapier.Pel het netvlies voorzichtig weg van het filterpapier en raak alleen de extreme omtrek van het netvlies aan om de structurele integriteit te behouden. Til vervolgens het filterpapier uit de petrischaal en verwijder overtollige vloeistof op een papieren handdoek, zodat de kant die in contact komt met het netvlies geen contact maakt met het keukenpapier. Plaats het filterpapier met de gedeeltelijke ROS-laag in een gelabelde buis op ijs en houd het geschilde netvlies ondergedompeld in de Ames HEPES-buffer.Herhaal het peelingproces voor dit gehalveerde netvlies ongeveer zeven tot acht keer om de hele ROS-laag te verwijderen. Plaats na elke peeling het filterpapier in dezelfde buis om alle ROS geïsoleerd uit één gehalveerd netvlies te combineren. Bewaar de buis met alle filterpapierschillen van de geïsoleerde ROS op ijs voor onmiddellijk gebruik.Breng met een pincet het overgebleven geschilde netvlies over in een op de juiste manier gelabelde buis en houd de buis op ijs voor onmiddellijk gebruik. Om het retinale monster voor te bereiden op lyofilisatie, plaatst u een stuk filterpapier en brengt u een gehalveerd netvlies over in een petrischaal gevuld met koude Ringer's buffer. Draai vervolgens met een pincet het netvlies voorzichtig om zodat het concaaf omhoog is georiënteerd en beweeg het om op het filterpapier te rusten.Til het filtreerpapier bij de randen omhoog zodat het gehalveerde stuk netvlies het filterpapier raakt. Blijf het filterpapier uit de oplossing van Ringer tillen. Plaats vervolgens de onderkant van het filterpapier op een keukenpapier en dep voorzichtig twee tot drie keer om overtollige vloeistof te verwijderen.Pak vervolgens het filterpapier op met een pincet en voeg een druppel koude Ringer's toe aan de zijkant van het filterpapier met het netvlies. Plaats het filtreerpapier nogmaals op het keukenpapier om overtollige vloeistof te verwijderen. Bewaar elk geplakt netvlies- en filterpapiermonster in een petrischaal gevuld met koude Ringer's totdat het klaar is om alle monsters in te vriezen.Til vervolgens met een pincet elk monster uit de buffer van de koude Ringer en zorg ervoor dat het pincet alleen contact maakt met de randen van het filterpapier, waardoor het gehalveerde netvlies wordt vermeden. Plaats de onderkant van elk filtreerpapier op een papieren handdoek om overtollige vloeistof te verwijderen. Voeg vervolgens een druppel koude PBS toe aan de zijkant van het filterpapier waar het netvlies is geplakt en dep het filterpapier opnieuw op het keukenpapier.Plaats alle stukjes filterpapier in de petrischaal en gebruik pluisvrij tissuepapier om overtollige vloeistof rond het filterpapier af te voeren. Wikkel vervolgens de hele schaal goed in met aluminiumfolie en zorg ervoor dat de randen van de aluminiumfolie worden vastgezet en soepel in de bodem van de petrischaal worden gedrukt. Prik een handvol gaten van 0,1 tot 0,2 millimeter in het deksel van aluminiumfolie.Laat vervolgens met behulp van een metalen tang de met aluminiumfolie bedekte petrischaal geleidelijk zakken tot vloeibare stikstof. Bewaar de monsters in vloeibare stikstof totdat ze klaar zijn om te lyofieliseren. Voor lyofilisatie plaatst u de met aluminiumfolie bedekte petrischaal in een vriesdroogkolf en bevestigt u deze aan de lyofilisatormachine volgens het protocol van de fabrikant.Lyofiliseer het netvlies gedurende 30 minuten. Verzamel na lyofilisatie het buitenste en binnenste segment van de staaf door voorzichtig een klein stukje tape op het gelyofiliseerde netvlies te leggen en lichte druk uit te oefenen met het pincet om ervoor te zorgen dat het zich bindt met de fotoreceptorlaag. Trek de tape langzaam weg en zorg ervoor dat zowel de ROS als RIS zich aan de tape hebben vastgehecht.Een dunne, witte film zal aanwezig zijn op het gebroken oppervlak. Dit is de RIS. Om deze RIS te scheiden, plaatst u nog een stuk tape en duwt u de tape naar beneden op het gebroken oppervlak.Plaats vervolgens het stuk tape met alleen de oranje-roze laag in een microcentrifugebuis met het label ROS en stukjes tape met de dunne, witte laag in een andere buis met het label RIS. Verzamel vervolgens met behulp van tape het resterende retinale weefsel op het filterpapier door de dikke, witte laag af te pellen. Plaats dit isolaat vervolgens in een buis met het label OIS.Als u dezelfde dag wordt gebruikt, bewaar dan de geïsoleerde lagen van het gelyofiliseerde netvlies bij kamertemperatuur. Bij aan het donker aangepaste dieren kwam de verdeling van GNAT1 en ARR1 nauw overeen met hun bekende dark-state distributies, waarbij het GNAT1-signaal zichtbaar het sterkst was in de ROS-isolatie en het ARR1-signaal robuuster was in de ROS-isolatie. Kwantificering van de GNAT1- en ARR1-signalen toonde significante verschillen tussen donkerlichtomstandigheden voor GNAT1 en ARR1 in ROS- en ROS-monsters.In zowel donkere als licht-aangepaste monsters zijn G beat 5S, cytochroom C en actine signalen uitgesloten van de ROS-monsters, wat een afwezigheid van besmetting van andere cellulaire lagen aantoont. Bovendien was het G beta 5L-signaal duidelijk zichtbaar in de ROS-monsters. Scanning elektronenmicroscopie van de oppervlakken van intact en geschild gelyofiliseerd netvlies toonde aan dat, vóór het pellen met plakband, het oppervlak van intact gelyofiliseerd netvlies nauw overeenkwam met de karakteristieke cilindrische ROS.Na de eerste tape peeling leken de ROS en RIS volledig te zijn verwijderd, zoals blijkt uit de uniforme nucleaire laag die aanwezig is op het oppervlak van het overgebleven, geschilde, gelyofiliseerde netvlies. Volgende tapepeelings verwijderden RIS van het vrije oppervlak van de geschilde laag. Deze techniek toonde ook aan dat GRK1-immunoreactiviteit het meest intens was in ROS-monsters in aan licht blootgesteld netvlies en afwezig in OIS-monsters.Omgekeerd vertoonden ROS- en RIS-monsters een zwak signaal voor PKC-alfa, dat gewoonlijk niet wordt gedetecteerd in ROS of RIS door immunofluorescentiekleuring. Ten slotte kan suboptimale tapepeeling licht verontreinigde monsters opleveren. Het RIS-monster was besmet met een OIS-monster, waardoor zowel G beta 5L- als G beta 5S-banden en een hoger PKC-alfasignaal werden geproduceerd.Voorzichtigheid is geboden bij het lyofiliseren van het netvlies. Als een onjuiste lyofilisatietechniek wordt gebruikt, kan het netvlies smelten, waardoor het isoleren van verschillende staafsubcellulaire lagen met tape onmogelijk wordt. Het gebruik van deze tape peeling methode in combinatie met qRT-PCR heeft de scheiding van fotoreceptor transcripties van de rest van het netvlies mogelijk gemaakt.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Adult Neurogenesis

Methoden voor de modulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke Adult Neurogenese

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Beoordeling van de Vasculaire Regeneratie in het CZS met de muis Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratome Sectioning Mouse Retina te Fotoreceptor culturen Bereid

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Methoden voor-Cell bevestigd Capaciteitsmetingen in Muis bijnier Chromaffinecellen Cell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamiek in Cone fotoreceptorcellen Axon Terminals van de Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Een grondige fysiologische analyse van Defined Cell Populaties in Acute Tissue Slices van de Muis Vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Waar je knippen zaken: Een dissectie en analyse-gids voor de ruimtelijke oriëntatie van het netvlies muis van oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Twee-foton beeldvorming van corticale neuronen in neonatale muizen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...