Name: two peeling methods for the isolation of photoreceptor cell compartments in the mouse retina for protein analysis
Uploaded: 2021-12-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von NIH Grant EY12155, EY027193 und EY027387 to JC unterstützt. Wir danken Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) und Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) für das Korrekturlesen des Manuskripts. Wir möchten uns auch bei Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, USA) und Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, USA) für die Bereitstellung der notwendigen Ausrüstung bedanken, um das vom Autor bereitgestellte Filmmaterial zu sammeln. Material aus: Kasey Rose et al, Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis, Molecular Neurodegeneration, veröffentlicht [2017], [Springer Nature].

Alle Experimente wurden gemäß den lokalen institutionellen Richtlinien des Ausschusses für Forschung Tierpflege der University of Southern California (USC) durchgeführt.
1. Lebendzell-Netzhautpeeling-Methode
<ol><li>Zubereitung von Ames' Puffern, Peelingpapieren und Sezierschale<ol>
<li>Schneiden Sie das Zellulosefilterpapier (Grade 413) mit stumpfer Spitze (oder einem gleichwertigen Scherentyp) in Rechtecke mit den Maßen ca. 5 mm x 2,5 mm. Lagern Sie die Stecklinge fü...

<ol>
	<li>Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+proteins+and+phototransduction.">G proteins and phototransduction.</a> Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).</li><li>Molday, R. S., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptors+at+a+glance.">Photoreceptors at a glance.</a> Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).</li><li>Koch, K. W., Dell'Orco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+signaling+networks+in+vertebrate+photoreceptor+cells.">Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).</li><li>Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+light+intensity+threshold+for+retinal+damage+in+albino+rats+raised+under+6+lx.">Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx.</a> Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).</li><li>Brann, M. R., Cohen, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+expression+of+transducin+mRNA+and+translocation+of+transducin+in+rods+of+rat+retina.">Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina.</a> Science. 235 (4788), 585-587 (1987).</li><li>Philp, N. J., Chang, W., Long, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-stimulated+protein+movement+in+rod+photoreceptor+cells+of+the+rat+retina.">Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina.</a> FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).</li><li>Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+induced+shift+and+binding+of+S-antigen+in+retinal+rods.">Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods.</a> Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).</li><li>Roof, D. J., Heth, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transducin+in+retinal+rod+photoreceptor+outer+segments.">Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments.</a> Science. 241 (4867), 845-847 (1988).</li><li>Sokolov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+light-driven+translocation+of+transducin+between+the+two+major+compartments+of+rod+cells:+a+novel+mechanism+of+light+adaptation.">Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation.</a> Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).</li><li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex.">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li><li>Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+translocation+is+induced+at+a+critical+threshold+of+visual+signaling+and+is+superstoichiometric+to+bleached+rhodopsin.">Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).</li><li>Nair, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+redistribution+of+arrestin+in+vertebrate+rods+is+an+energy-independent+process+governed+by+protein-protein+interactions.">Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions.</a> Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).</li><li>Strissel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recoverin+undergoes+light-dependent+intracellular+translocation+in+rod+photoreceptors.">Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).</li><li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors.">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).</li><li>Majumder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+contributes+to+rod+survival+and+enhances+synaptic+transmission+from+rods+to+rod+bipolar+cells.">Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).</li><li>Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+photoreceptors+die+(and+why+they+don't).">Why photoreceptors die (and why they don't).</a> BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).</li><li>Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+to+light+damage+in+an+arrestin+knockout+mouse+model+of+Oguchi+disease+(stationary+night+blindness).">Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness).</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin-1+expression+level+in+rods:+balancing+functional+performance+and+photoreceptor+health.">Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health.</a> Neuroscience. 174, 37-49 (2011).</li><li>McConnell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+retinal+outer+segment+fragments.">The isolation of retinal outer segment fragments.</a> The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).</li><li>Tsang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+target+enzyme+in+deactivation+of+photoreceptor+G+protein+in+vivo.">Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo.</a> Science. 282 (5386), 117-121 (1998).</li><li>Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recordings+of+retinal+bipolar+cells+in+response+to+extracellular+electrical+stimulation+in+wholemount+mouse+retina.">Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).</li><li>Guido, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+obtain+retinal+cell+preparations+highly+enriched+in+specific+cell+types.+Suitability+for+lipid+metabolism+studies.">A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies.</a> Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).</li><li>Hayashi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+by+cyclin-dependent+protein+kinase+5+of+the+regulatory+subunit+of+retinal+cGMP+phosphodiesterase.+II.+Its+role+in+the+turnoff+of+phosphodiesterase+in+vivo.">Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).</li><li>Wolbring, G., Cook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+and+characterization+of+protein+kinase+C+from+bovine+retinal+rod+outer+segments.">Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments.</a> European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).</li><li>Williams, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+kinase+C+in+photoreceptor+outer+segments.">Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments.</a> Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).</li><li>Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTPase+activating+factor+for+transducin+in+rod+photoreceptors+is+the+complex+between+RGS9+and+type+5+G+protein+beta+subunit.">The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).</li><li>Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+rhodopsin/arrestin+complex+leads+to+retinal+degeneration+in+a+transgenic+mouse+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.">Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).</li><li>Chen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+photoresponses+and+light-induced+apoptosis+in+rods+lacking+rhodopsin+kinase.">Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mistrafficking+of+prenylated+proteins+causes+retinitis+pigmentosa+2.">Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2.</a> FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).</li><li>Weiss, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+differences+in+expression+of+G-protein-coupled+receptor+kinase+(GRK)+7+and+GRK1+in+mammalian+cone+photoreceptor+cells:+implications+for+cone+cell+phototransduction.">Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).</li><li>Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+forms+of+human+rhodopsin+kinase+(GRK1).">Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1).</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).</li><li>Newton, A. C., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+protein+kinase+C+in+the+phosphorylation+of+rhodopsin.">Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).</li><li>Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+protein+kinase+C+isoforms+are+required+for+rod+photoreceptor+differentiation.">Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).</li><li>Sokal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+kinase+C+isozymes+responsible+for+the+phosphorylation+of+photoreceptor-specific+RGS9-1+at+Ser475.">Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).</li><li>Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+photoreceptor+cell+compartments+in+mouse+retina+for+protein+analysis.">Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).</li><li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+degeneration:+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait.">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li></ol>

Viele Netzhauterkrankungen betreffen Stäbchen-Photorezeptorzellen, was zum Tod des Stäbchens und letztendlich zum vollständigen Verlust des Sehvermögens führt37. Ein bedeutender Teil der genetischen und mechanistischen Ursprünge der menschlichen Netzhautdegeneration wurde im Laufe der Jahre in zahlreichen Mausmodellen erfolgreich rekapituliert. In diesem Zusammenhang würde die Fähigkeit, einzelne subzelluläre Stäbchenkompartimente einfach und selektiv von der kleinen Mausnetzhaut zu tren...

Stäbchen-Photorezeptorzellen, dicht gepackt in der äußersten Schicht der neuronalen Netzhaut, sind ein integraler Bestandteil des Dimmlichts. Um als treue Photonenzähler zu fungieren, verwenden Stäbchen einen G-Protein-basierten Signalweg, der als Phototransduktion bezeichnet wird, um schnelle, verstärkte und reproduzierbare Reaktionen auf den Einfang einzelner Photonen zu erzeugen. Diese Reaktion auf Licht löst letztendlich eine Änderung des Stroms an der Plasmamembran aus und wird anschließend dem Rest des visuellen Systems signalisiert1. Wie der Name schon sagt, hat jede Stäbchenzelle eine ausgeprägte stäbchenartige Form und weist eine stark polarisierte zelluläre Morphologie auf, die aus einem äußeren Segment (OS), einem inneren Segment (IS), einem Zellkörper (CB) und einem synaptischen Terminal (ST) besteht. Jedes subzelluläre Kompartiment hat spezifische Proteinmaschinen (membrangebunden und löslich), biomolekulare Merkmale und Proteinkomplexe, die eine entscheidende Rolle spielen, wie visuelle Phototransduktion, allgemeine Haushaltsführung und Proteinsynthese sowie synaptische Übertragung2,3.
Vor über 30 Jahren wurde erstmals die lichtabhängige reziproke Bewegung subzellulärer Proteine, insbesondere Transducin (weg vom OS) und Arrestin (in Richtung OS), beobachtet4,5,6,7. Schon früh wurde dieses beobachtete Phänomen mit Skepsis aufgenommen, was zum Teil auf die Anfälligkeit der Immunhistochemie für die Epitopmaskierung zurückzuführen ist8. In den frühen 2000er Jahren wurde die stimulusabhängige Proteintranslokation durch die Verwendung einer rigorosen und mühsamen physikalischen Schnitttechnik bestätigt9. Serielle tangentiale Abschnitte der gefrorenen flach montierten Nagetiernetzhaut, gefolgt von Immunoblotting, zeigten, dass Transducin9,10, Arrestin11,12 und Recoverin13 alle eine subzelluläre Umverteilung als Reaktion auf Licht erfahren. Es wird angenommen, dass die lichtgetriebene Translokation dieser wichtigen Signalproteine nicht nur die Empfindlichkeit der Phototransduktionskaskade reguliert9,14,15, sondern auch neuroprotektiv gegen Lichtschäden16,17,18 sein kann. Da der lichtgetriebene Proteintransport in Stäbchen für die Biologie und Physiologie der Stäbchenzellen von großer Bedeutung zu sein scheint, sind Techniken, die die Isolierung verschiedener subzellulärer Kompartimente zur Bestimmung der Proteinverteilung ermöglichen, wertvolle Forschungsinstrumente.
Derzeit gibt es einige Methoden, die darauf abzielen, die subzellulären Kompartimente des Stäbchens zu isolieren. Diese Methoden können jedoch langwierig und schwer zu reproduzieren sein oder eine beträchtliche Menge an Netzhautisolat erfordern. ROS-Präparate (Rod Outer Segment) über Dichtegradientenzentrifugation19 werden beispielsweise häufig verwendet, um das ROS vom retinalen Homogenat zu trennen. Diese Methode wird häufig für Western Blot verwendet, aber das Verfahren ist sehr zeitaufwendig und erfordert mindestens 8-12 murine Retinae20. Auf der anderen Seite wurde die serielle tangentiale Schnittführung von gefrorenen murinen und Rattennetzhaut erfolgreich bei der Isolierung von OS, IS, CB und ST9,11,13 implementiert. Diese Methode ist jedoch technisch anspruchsvoll, da die kleine und stark gekrümmte murine Netzhaut vollständig abgeflacht werden muss, um die Netzhautschichten vor dem tangentialen Schnitt auszurichten. Da es eine Fülle von Mausmodellen und transgenen Mäusen gibt, die Krankheiten des visuellen Systems rekapitulieren, ist die Schaffung einer Technik, die zuverlässig, schnell und einfach einzelne Stäbchenkompartimente trennt, vielversprechend, um die physiologischen Prozesse aufzudecken, die in jedem spezialisierten Kompartiment auftreten, und die Mechanismen, die visuellen Prozessen in Gesundheit und Krankheit zugrunde liegen.
Um diese Untersuchungen zu erleichtern, beschreiben wir zwei Peeling-Methoden, die subzelluläre Kompartimente von Stäbchen leichter isolieren als aktuelle Protokolle. Die erste Peeling-Methode, die von einer Technik zur Freilegung fluoreszierend markierter bipolarer Zellen für die Aufzeichnung von Patch-Clampen21 angepasst wurde, verwendet Zellulosefilterpapier, um das ROS nacheinander aus einer lebenden, isolierten murinen Netzhaut zu entfernen (Abbildung 1). Die zweite Methode, angepasst an ein Verfahren, das die drei primären retinalen Zellschichten von einer Chick22- und frog23-Netzhaut isoliert, verwendet Klebeband, um das ROS- und Stäbcheninnensegment (RIS) von einer lyophilisierten Netzhaut zu entfernen (Abbildung 2). Beide Verfahren können in 1 h abgeschlossen werden und sind erheblich benutzerfreundlich. Wir bieten eine Validierung der Wirksamkeit dieser beiden Trennprotokolle für Western Blot, indem wir dunkel angepasste und lichtexponierte Netzhaut von C57BL/6J-Mäusen verwenden, um die lichtinduzierte Translokation von Stäbchentransducin (GNAT1) und Arrestin (ARR1) zu demonstrieren. Darüber hinaus liefern wir mit der Tape-Peeling-Methode zusätzliche Beweise dafür, dass unsere Technik verwendet werden kann, um Inkonsistenzen zwischen Proteinlokalisierungsdaten, die durch Immunzytochemie (ICC) und westliche Blots gewonnen wurden, zu untersuchen und zu beheben. Insbesondere zeigte unsere Technik, dass: 1) die Proteinkinase C-alpha (PKCα) Isoform nicht nur in bipolaren Zellen, sondern auch in murinem ROS und RIS vorhanden ist, wenn auch in niedrigen Konzentrationen24,25, und 2) Rhodopsinkinase (GRK1) ist überwiegend in der isolierten OS-Probe vorhanden. Diese Daten zeigen die Wirksamkeit unserer beiden Peeling-Techniken zur Trennung und Quantifizierung spezifischer Stäbchen- und Netzhautproteine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% O2 tank</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X SDS Sample Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>70607-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 and 5% CO2 tank</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames&#8217; Medium with L-glutamine, without bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 (99%, dihydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite (Anhydrous calcium sulfate, &#62;98% CaSO4, &#62;2% CoCl2)</td>
			<td>WA Hammond Drierite Co LTD</td>
			<td>21005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm)</td>
			<td>Falcon-Corning</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Falcon-Corning</td>
			<td>08-772F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Scalpel (No. 10, 40 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100499-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Scalpel (No. 11, 40 mm)</td>
			<td>VWT</td>
			<td>100499-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (99%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes pellet pestle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>z359971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Fast-Freeze Flasks</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q/de-ionized water</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (powder)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4062-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (crystal)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Sx0420-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur EDTA</td>
			<td>EMD</td>
			<td>4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur HEPES, Free Acid</td>
			<td>EMD</td>
			<td>5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Wrap Aluminum Foil</td>
			<td>Reynolds Brands</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m)</td>
			<td>Scotch-3M</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D67501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrafuge mini centrifuge</td>
			<td>Labnet International, Inc</td>
			<td>C1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue incubation chamber (purchased or custom made)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4103-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Signma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 &#956;m)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28310-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 &#956;m)</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore transfer pipet, Global Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76285-362</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two peeling methods for the isolation of photoreceptor cell compartments in the mouse retina for protein analysis

Stäbchen-Photorezeptoren sind hochpolarisierte sensorische Neuronen mit unterschiedlichen Kompartimenten. Mausstäbchen sind lang (~80 μm) und dünn (~2 μm) und sind seitlich in der äußersten Schicht der Netzhaut, der Photorezeptorschicht, verpackt, was zu einer Ausrichtung analoger subzellulärer Kompartimente führt. Traditionell wurde der tangentiale Schnitt der gefrorenen, flach montierten Netzhaut verwendet, um die Bewegung und Lokalisation von Proteinen in verschiedenen Stäbchenkompartimenten zu untersuchen. Die hohe Krümmung der stäbchendominanten Mausnetzhaut macht die tangentiale Sektionierung jedoch zu einer Herausforderung. Motiviert durch die Untersuchung des Proteintransports zwischen Kompartimenten haben wir zwei Peeling-Methoden entwickelt, die das äußere Stäbchensegment (ROS) und andere subzelluläre Kompartimente für westliche Blots zuverlässig isolieren. Unsere relativ schnellen und einfachen Techniken liefern angereicherte und subzellulär-spezifische Fraktionen, um die Verteilung und Umverteilung wichtiger Photorezeptorproteine in normalen Stäbchen quantitativ zu messen. Darüber hinaus können diese Isolationstechniken auch leicht angepasst werden, um die Proteinzusammensetzung anderer Zellschichten sowohl in gesunden als auch in degenerierenden Netzhäuten zu isolieren und quantitativ zu untersuchen.

Die vorliegenden Strategien wurden entwickelt, um relativ schnelle und einfache Methoden zur Isolierung und Analyse von Proteinen unter spezifischen subzellulären Stäbchenkompartimenten für die Western-Blot-Analyse bereitzustellen. Wir wandten zwei sequentielle Peeling-Techniken (Abbildung 1 und Abbildung 2) an, gefolgt von Immunoblotting, um zu zeigen, dass diese Methoden zuverlässig verwendet werden können, um die bekannte Verteilung von Stäbchentransduc...

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Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

Dieses Protokoll stellt zwei Techniken vor, um die subzellulären Kompartimente von murinen Stäbchen-Photorezeptoren für die Proteinanalyse zu isolieren. Die erste Methode verwendet lebendes Netzhaut- und Zellulosefilterpapier, um die äußeren Segmente der Stäbchen zu trennen, während die zweite Methode lyophilisierte Netzhaut und Klebeband verwendet, um die inneren und äußeren Segmentschichten der Stäbchen abzuziehen.

Zwei Peeling-Methoden zur Isolierung von Photorezeptor-Zellkompartimenten in der Netzhaut der Maus zur Proteinanalyse

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

Die beiden hier demonstrierten Peeling-Techniken isolieren einzelne subzelluläre Stäbchenkompartimente und können dazu beitragen, die wichtigen physiologischen Prozesse aufzudecken, die in jedem spezialisierten Kompartiment bei gesunden und kranken Stäbchen ablaufen. Die Isolierung verschiedener Stäbchenzellkompartimente von der Netzhaut der Maus kann eine Herausforderung darstellen. Diese einfachen Techniken verwenden kostengünstige und alltägliche Labormaterialien, um subzelluläre Kompartimente für die Proteinanalyse zuverlässig zu isolieren.Legen Sie zunächst ein Stück Filterpapier in eine Petrischale, die mit Ames HEPES-Puffer gefüllt ist, der mit 100% Sauerstoff gefüllt ist. Übertragen Sie dann mit einer Breitrohr-Transferpipette ein retinales Rechteck, das von einer zwei bis drei Monate alten C57 Black 6J-Maus seziert wurde. Richten Sie die unterteilte Netzhaut konkav aus und stellen Sie sicher, dass die Photorezeptoren nach unten zum Boden der Schale zeigen.Greifen Sie dann mit einer Pinzette leicht die Seiten der halbierten Netzhaut und bewegen Sie sie auf das Filterpapier. Sobald die Netzhaut zentriert ist, bewegen Sie das Filterpapier nach oben, so dass die halbierte Netzhaut das Filterpapier berührt, um ein äußeres Segment zu erzeugen, oder ROS, um die Papierhaftung zu filtern. Heben Sie das Filterpapier mit der angebrachten Netzhaut vorsichtig aus dem Ames HEPES-Puffer heraus.Legen Sie die Unterseite des Filterpapiers auf ein Papiertuch und tupfen Sie zwei- bis dreimal zum Trocknen ab. Fügen Sie einen Tropfen Ames HEPES mit der Netzhaut auf die Seite des Filterpapiers und legen Sie das Filterpapier zum Trocknen erneut auf das Papiertuch. Als nächstes legen Sie das Filterpapier mit der Netzhaut zurück in die Petrischale und drücken Sie mit einer Pinzette vorsichtig alle Ränder der halbierten Netzhaut nach oben und weg vom Filterpapier auf allen Seiten.Ziehen Sie die Netzhaut vorsichtig vom Filterpapier weg und berühren Sie nur den äußersten Umfang der Netzhaut, um ihre strukturelle Integrität zu erhalten. Heben Sie dann das Filterpapier aus der Petrischale und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit auf einem Papiertuch, um sicherzustellen, dass die Seite, die mit der Netzhaut in Kontakt kommt, das Papiertuch nicht berührt. Legen Sie das Filterpapier mit der partiellen ROS-Schicht in ein markiertes Rohr auf Eis und halten Sie die geschälte Netzhaut in den Ames HEPES-Puffer getaucht.Wiederholen Sie den Peeling-Vorgang für diese halbierte Netzhaut etwa sieben bis acht Mal, um die gesamte ROS-Schicht zu entfernen. Legen Sie das Filterpapier nach jedem Abziehen in dasselbe Röhrchen, um alle ROS zu kombinieren, die von einer halbierten Netzhaut isoliert sind. Bewahren Sie das Rohr mit allen Filterpapierschalen des isolierten ROS zur sofortigen Verwendung auf Eis auf.Übertragen Sie die übrig gebliebene geschälte Netzhaut mit einer Pinzette in eine entsprechend gekennzeichnete Röhre und halten Sie die Tube zur sofortigen Verwendung auf Eis. Um die Netzhautprobe für die Lyophilisation vorzubereiten, legen Sie ein Stück Filterpapier und geben Sie eine halbierte Netzhaut in eine Petrischale, die mit kaltem Ringerpuffer gefüllt ist. Als nächstes drehen Sie die Netzhaut mit einer Pinzette vorsichtig um, so dass sie konkav nach oben ausgerichtet ist, und bewegen Sie sie, um auf dem Filterpapier zu ruhen.Heben Sie das Filterpapier an den Rändern nach oben an, so dass das halbierte Stück Netzhaut das Filterpapier berührt. Heben Sie das Filterpapier weiterhin aus der Ringer-Lösung heraus. Legen Sie dann die Unterseite des Filterpapiers auf ein Papiertuch und tupfen Sie es zwei- bis dreimal vorsichtig ab, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.Als nächstes nehmen Sie das Filterpapier mit einer Pinzette auf und fügen Sie einen Tropfen kalter Ringer auf die Seite des Filterpapiers mit der Netzhaut hinzu. Legen Sie das Filterpapier erneut auf das Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Lagern Sie jede geklebte Netzhaut- und Filterpapierprobe in einer Petrischale, die mit kalten Ringern gefüllt ist, bis alle Proben eingefroren werden können.Heben Sie dann mit einer Pinzette jede Probe aus dem Puffer des kalten Ringers heraus und stellen Sie sicher, dass die Pinzette nur die Filterpapierränder berührt und die halbierte Netzhaut vermeidet. Legen Sie die Unterseite jedes Filterpapiers auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Fügen Sie dann einen Tropfen kaltes PBS auf die Seite des Filterpapiers auf, wo die Netzhaut haftet, und tupfen Sie das Filterpapier erneut auf das Papiertuch.Legen Sie alle Filterpapierstücke in die Petrischale und leiten Sie mit fusselfreiem Seidenpapier überschüssige Flüssigkeit ab, die das Filterpapier umgibt. Wickeln Sie dann die gesamte Schale mit Alufolie fest ein und stellen Sie sicher, dass die Kanten der Aluminiumfolie gesichert und sanft in den Boden der Petrischale gedrückt werden. Eine Handvoll 0,1 bis 0,2 Millimeter große Löcher in den Deckel der Aluminiumfolie einstechen.Als nächstes senken Sie mit einer Metallzange die mit Aluminiumfolie überzogene Petrischale allmählich in flüssigen Stickstoff ab. Bewahren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff auf, bis sie zur Lyophilisation bereit sind. Zur Lyophilisation legen Sie die mit Aluminiumfolie überzogene Petrischale in einen Gefriertrocknungskolben und befestigen Sie sie gemäß dem Protokoll des Herstellers an der Lyophilisatormaschine.Lyophilisieren Sie die Netzhaut für 30 Minuten. Sammeln Sie nach der Lyophilisation das äußere und innere Segment des Stabes, indem Sie vorsichtig ein kleines Stück Klebeband auf die lyophilisierte Netzhaut legen und leichten Druck mit der Pinzette ausüben, um sicherzustellen, dass sie sich mit der Photorezeptorschicht verbindet. Ziehen Sie das Band langsam ab und stellen Sie sicher, dass sowohl der ROS als auch der RIS am Band haften.Ein dünner, weißer Film wird an der gebrochenen Oberfläche vorhanden sein. Das ist das RIS. Um dieses RIS zu trennen, legen Sie ein weiteres Stück Klebeband und drücken Sie das Band auf die gebrochene Oberfläche.Legen Sie dann das Stück Klebeband mit nur der orange-rosa Schicht in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das als ROS gekennzeichnet ist, und Stücke von Klebeband mit der dünnen, weißen Schicht in ein anderes Röhrchen mit der Bezeichnung RIS. Als nächstes sammeln Sie mit Klebeband das verbleibende Netzhautgewebe, das sich auf dem Filterpapier befindet, indem Sie die dicke, weiße Schicht abziehen. Legen Sie dieses Isolat dann in eine Röhre mit der Bezeichnung OIS.Wenn Sie am selben Tag verwenden, lagern Sie die isolierten Schichten der lyophilisierten Netzhaut bei Raumtemperatur. Bei dunkel angepassten Tieren stimmte die Verteilung von GNAT1 und ARR1 eng mit ihren bekannten Dunkelzustandsverteilungen überein, wobei das GNAT1-Signal in der ROS-Isolierung sichtbar am stärksten war und das ARR1-Signal in der ROS-Isolierung robuster war. Die Quantifizierung der GNAT1- und ARR1-Signale zeigte signifikante Unterschiede zwischen den Dunkellichtbedingungen für GNAT1 und ARR1 in ROS- und ROS-Proben.Sowohl in dunklen als auch in lichtangepassten Proben werden G-Beat-5S-, Cytochrom-C- und Aktinsignale aus den ROS-Proben ausgeschlossen, was eine Abwesenheit von Kontamination durch andere Zellschichten zeigt. Zusätzlich war das G beta 5L-Signal in den ROS-Proben deutlich sichtbar. Die Rasterelektronenmikroskopie der Oberflächen intakter und geschälter lyophilisierter Netzhaut zeigte, dass vor dem Ablösen mit Klebeband die Oberfläche der intakten lyophilisierten Netzhaut eng mit dem charakteristischen zylindrischen ROS übereinstimmte.Nach dem anfänglichen Bandpeeling schienen ROS und RIS vollständig entfernt zu sein, wie die gleichmäßige Kernschicht auf der Oberfläche der übrig gebliebenen, geschälten, lyophilisierten Netzhaut zeigt. Nachfolgende Bandabschalen entfernten RIS von der freien Oberfläche der geschälten Schicht. Diese Technik zeigte auch, dass die GRK1-Immunreaktivität in ROS-Proben in lichtexponierten Netzhäuten am intensivsten war und in OIS-Proben fehlte.Umgekehrt zeigten ROS- und RIS-Proben ein schwaches Signal für PKC alpha, das in ROS oder RIS üblicherweise nicht durch Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen wird. Schließlich könnte ein suboptimales Bandpeeling leicht kontaminierte Proben ergeben. Die RIS-Probe war mit einer OIS-Probe kontaminiert, wodurch sowohl G beta 5L- als auch G beta 5S-Bänder und ein höheres PKC-Alpha-Signal erzeugt wurden.Bei der Lyophilisation der Netzhaut ist Vorsicht geboten. Wenn eine unsachgemäße Lyophilisationstechnik verwendet wird, kann die Netzhaut schmelzen, was die Isolierung verschiedener subzellulärer Stäbchenschichten durch Klebeband unmöglich macht. Die Verwendung dieser Bandpeeling-Methode in Verbindung mit der qRT-PCR hat die Trennung von Photorezeptortranskripten vom Rest der Netzhaut ermöglicht.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Forschung

Neurowissenschaften

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Adult Neurogenesis

Methoden zur Analyse und Modulation von NF-kappaB-abhängigen adulte Neurogenese

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Beurteilung der Gefäß Regeneration im ZNS Verwenden der Maus Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratom Schnitte Maus-Retina zu Photorezeptor Kulturen vorbereiten

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Methoden für die Cell-Attached-Kapazitätsmessungen in Maus-chromaffinen Nebennierenzell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In eingehenden Physiologische Analyse definierter Zellpopulationen bei der akuten Gewebeschnitten der Maus Vomeronasalorgans

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Wo schneiden Sie Angelegenheiten: Eine Dissektion und Analyse-Leitfaden für die räumliche Orientierung der Netzhaut Maus von okulären Sehenswürdigkeiten

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...