Name: two peeling methods for the isolation of photoreceptor cell compartments in the mouse retina for protein analysis
Uploaded: 2021-12-07T13:00:00
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이 작업은 NIH Grant EY12155, EY027193 및 EY027387에서 JC에 지원했습니다. 원고를 교정해 주신 Spyridon Michalakis 박사(Caltech, Pasadena, USA)와 Natalie Chen(USC, Los Angeles, USA)에게 감사드립니다. 또한 저자가 제공한 영상을 수집하는 데 필요한 장비를 제공해 주신 Seth Ruffins 박사(USC, 로스앤젤레스, 미국)와 Janos Peti-Peterdi 박사(USC, 로스앤젤레스, 미국)에게도 감사드립니다. 소재지: Kasey Rose et al., 단백질 분석을 위한 마우스 망막에서 광수용체 세포 구획의 분리, 분자 신경변성, [2017], [Springer Nature].

모든 실험은 서던 캘리포니아 대학 (USC)의 동물 관리 연구위원회의 지역 기관 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 살아있는 세포 망막 박리 방법
<ol><li>Ames의 완충액, 필링 종이 및 해부 접시 준비<ol>
<li>무딘 팁 아이리스 가위(또는 이와 동등한 가위 유형)를 사용하여 셀룰로오스 여과지(등급 413)를 약 5mm x 2.5mm 크기의 직사각형으로 자릅니다. 나중에 사용할 수 있도?...

<ol>
	<li>Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+proteins+and+phototransduction.">G proteins and phototransduction.</a> Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).</li><li>Molday, R. S., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptors+at+a+glance.">Photoreceptors at a glance.</a> Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).</li><li>Koch, K. W., Dell'Orco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+signaling+networks+in+vertebrate+photoreceptor+cells.">Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).</li><li>Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+light+intensity+threshold+for+retinal+damage+in+albino+rats+raised+under+6+lx.">Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx.</a> Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).</li><li>Brann, M. R., Cohen, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+expression+of+transducin+mRNA+and+translocation+of+transducin+in+rods+of+rat+retina.">Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina.</a> Science. 235 (4788), 585-587 (1987).</li><li>Philp, N. J., Chang, W., Long, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-stimulated+protein+movement+in+rod+photoreceptor+cells+of+the+rat+retina.">Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina.</a> FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).</li><li>Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+induced+shift+and+binding+of+S-antigen+in+retinal+rods.">Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods.</a> Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).</li><li>Roof, D. J., Heth, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transducin+in+retinal+rod+photoreceptor+outer+segments.">Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments.</a> Science. 241 (4867), 845-847 (1988).</li><li>Sokolov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+light-driven+translocation+of+transducin+between+the+two+major+compartments+of+rod+cells:+a+novel+mechanism+of+light+adaptation.">Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation.</a> Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).</li><li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex.">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li><li>Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+translocation+is+induced+at+a+critical+threshold+of+visual+signaling+and+is+superstoichiometric+to+bleached+rhodopsin.">Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).</li><li>Nair, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+redistribution+of+arrestin+in+vertebrate+rods+is+an+energy-independent+process+governed+by+protein-protein+interactions.">Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions.</a> Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).</li><li>Strissel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recoverin+undergoes+light-dependent+intracellular+translocation+in+rod+photoreceptors.">Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).</li><li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors.">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).</li><li>Majumder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+contributes+to+rod+survival+and+enhances+synaptic+transmission+from+rods+to+rod+bipolar+cells.">Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).</li><li>Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+photoreceptors+die+(and+why+they+don't).">Why photoreceptors die (and why they don't).</a> BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).</li><li>Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+to+light+damage+in+an+arrestin+knockout+mouse+model+of+Oguchi+disease+(stationary+night+blindness).">Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness).</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin-1+expression+level+in+rods:+balancing+functional+performance+and+photoreceptor+health.">Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health.</a> Neuroscience. 174, 37-49 (2011).</li><li>McConnell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+retinal+outer+segment+fragments.">The isolation of retinal outer segment fragments.</a> The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).</li><li>Tsang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+target+enzyme+in+deactivation+of+photoreceptor+G+protein+in+vivo.">Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo.</a> Science. 282 (5386), 117-121 (1998).</li><li>Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recordings+of+retinal+bipolar+cells+in+response+to+extracellular+electrical+stimulation+in+wholemount+mouse+retina.">Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).</li><li>Guido, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+obtain+retinal+cell+preparations+highly+enriched+in+specific+cell+types.+Suitability+for+lipid+metabolism+studies.">A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies.</a> Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).</li><li>Hayashi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+by+cyclin-dependent+protein+kinase+5+of+the+regulatory+subunit+of+retinal+cGMP+phosphodiesterase.+II.+Its+role+in+the+turnoff+of+phosphodiesterase+in+vivo.">Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).</li><li>Wolbring, G., Cook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+and+characterization+of+protein+kinase+C+from+bovine+retinal+rod+outer+segments.">Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments.</a> European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).</li><li>Williams, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+kinase+C+in+photoreceptor+outer+segments.">Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments.</a> Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).</li><li>Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTPase+activating+factor+for+transducin+in+rod+photoreceptors+is+the+complex+between+RGS9+and+type+5+G+protein+beta+subunit.">The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).</li><li>Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+rhodopsin/arrestin+complex+leads+to+retinal+degeneration+in+a+transgenic+mouse+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.">Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).</li><li>Chen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+photoresponses+and+light-induced+apoptosis+in+rods+lacking+rhodopsin+kinase.">Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mistrafficking+of+prenylated+proteins+causes+retinitis+pigmentosa+2.">Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2.</a> FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).</li><li>Weiss, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+differences+in+expression+of+G-protein-coupled+receptor+kinase+(GRK)+7+and+GRK1+in+mammalian+cone+photoreceptor+cells:+implications+for+cone+cell+phototransduction.">Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).</li><li>Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+forms+of+human+rhodopsin+kinase+(GRK1).">Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1).</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).</li><li>Newton, A. C., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+protein+kinase+C+in+the+phosphorylation+of+rhodopsin.">Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).</li><li>Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+protein+kinase+C+isoforms+are+required+for+rod+photoreceptor+differentiation.">Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).</li><li>Sokal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+kinase+C+isozymes+responsible+for+the+phosphorylation+of+photoreceptor-specific+RGS9-1+at+Ser475.">Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).</li><li>Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+photoreceptor+cell+compartments+in+mouse+retina+for+protein+analysis.">Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).</li><li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+degeneration:+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait.">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li></ol>

많은 망막 질환이 막대 광수용체 세포에 영향을 미쳐 막대 사망으로 이어지고 궁극적으로 완전한 시력 상실37로 이어집니다. 인간 망막 변성의 유전 적 및 기계론적 기원의 상당 부분이 수년에 걸쳐 수많은 마우스 모델에서 성공적으로 재생산되었습니다. 이러한 맥락에서, 작은 마우스 망막으로부터 개별 막대 하부 세포 구획을 쉽고 선택적으로 분리하는 능력은 망막 질환의 국?...

신경 망막의 최외곽층에 단단히 포장 된 막대 광수용체 세포는 희미한 빛 시력의 필수적인 부분입니다. 충실한 광자 카운터 역할을 하기 위해 로드는 광형질도입(phototransduction)이라고 불리는 G-단백질 기반 신호전달 경로를 활용하여 단일 광자 포획에 대한 신속하고 증폭되며 재현 가능한 반응을 생성합니다. 빛에 대한 이러한 반응은 궁극적으로 원형질막에서 전류의 변화를 촉발시키고 그 후 시각 시스템의 나머지 부분에 신호를 보냅니다1. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, 각 막대 세포는 뚜렷한 막대 모양의 모양을 가지며 외부 세그먼트 (OS), 내부 세그먼트 (IS), 세포체 (CB) 및 시냅스 말단 (ST)으로 구성된 고도로 편광 된 세포 형태를 나타냅니다. 각 세포 하부 구획에는 특정 단백질 기계 (막 결합 및 용해성), 생체 분자 특징 및 시각적 광형질도입, 일반적인 하우스 키핑 및 단백질 합성, 시냅스 전달과 같은 중요한 역할을하는 단백질 복합체가 있습니다2,3.
30여 년 전, 아세포 단백질, 특히 트랜스듀신(OS로부터 멀어짐)과 어레스틴(OS를 향하여)의 광의존적 상호 이동이 처음 관찰되었다4,5,6,7. 초기에, 이 관찰된 현상은 부분적으로는 에피토프 마스킹에 대한 면역조직화학의 취약성 때문에 회의론으로 받아들여졌다8. 2000년대 초에, 자극-의존성 단백질 전좌는 엄격하고 힘든 물리적 절편 기술9을 사용하여 확인되었다. 면역블롯팅에 이어 동결된 평탄한 설치류 망막의 직렬 접선 절편은 트랜스듀신9,10, arrestin11,12 및 recoverin13이 모두 빛에 반응하여 세포하 재분배를 겪는다는 것을 밝혀냈다. 이러한 주요 신호전달 단백질의 광구동 전좌는 광형질도입 캐스케이드9,14,15의 감도를 조절할 뿐만 아니라, 광손상에 대한 신경보호가 될 수도 있다고 여겨진다16,17,18. 막대에서의 광 구동 단백질 수송은 막대 세포 생물학 및 생리학에 매우 중요한 것으로 보이기 때문에 단백질 분포를 결정하기 위해 다른 세포 하위 구획을 분리 할 수있는 기술은 귀중한 연구 도구입니다.
현재, 막대 세포 하부 구획을 분리하기위한 몇 가지 방법이 있습니다. 그러나 이러한 방법은 길고 재현하기 어렵거나 상당한 양의 망막 분리가 필요할 수 있습니다. 밀도 구배 원심분리19를 통한 막대 외부 세그먼트(ROS) 제제는 예를 들어, 망막 균질물로부터 ROS를 분리하는데 일반적으로 사용된다. 이 방법은 웨스턴 블롯에 널리 사용되지만 절차는 매우 시간이 많이 걸리고 최소 8-12 뮤린 레티네20이 필요합니다. 한편, 냉동 뮤린 및 래트 망막의 직렬 접선 절편은 OS, IS, CB, 및 ST9,11,13을 단리하는데 성공적으로 구현되었다. 그러나이 방법은 접선 절편화 전에 망막 층을 정렬하기 위해 작고 고도로 구부러진 뮤린 망막을 완전히 평평하게 할 필요가 있기 때문에 기술적으로 어렵습니다. 시각 시스템의 질병을 되풀이하는 마우스 모델과 트랜스제닉 마우스가 과다하기 때문에 개별 막대 구획을 안정적이고 신속하며 쉽게 분리하는 기술의 생성은 각 특수 구획에서 발생하는 생리 학적 과정과 건강 및 질병의 시각적 과정의 기초가되는 메커니즘을 드러내는 데 공약을 가지고 있습니다.
이러한 조사를 용이하게하기 위해, 우리는 현재의 프로토콜보다 더 쉽게 막대 세포 하부 구획을 분리하는 두 가지 박리 방법을 설명합니다. 패치 클램프 기록21을 위해 형광 표지된 양극성 세포를 노출시키는 기술로부터 적응된 첫 번째 박리 방법은 셀룰로오스 여과지를 사용하여 살아있는 분리된 뮤린 망막으로부터 ROS를 순차적으로 제거한다(도 1). 병아리22 및 개구리23 망막으로부터 3개의 일차 망막 세포층을 분리하는 절차에서 적응된 두 번째 방법은 접착 테이프를 사용하여 동결건조된 망막으로부터 ROS 및 막대 내부 세그먼트(RIS)를 제거한다(그림 2). 두 절차 모두 1 시간 내에 완료 할 수 있으며 상당히 사용자 친화적입니다. 우리는 로드 트랜스듀신(GNAT1) 및 어레스틴(ARR1)의 광유도 전좌를 입증하기 위해 C57BL/6J 마우스로부터의 어두운 적응 및 광노출 망막을 활용하여 웨스턴 블롯에 대한 이러한 두 가지 분리 프로토콜의 효과에 대한 검증을 제공합니다. 또한, 테이프 필링 방법을 사용하여, 우리는 우리의 기술이 면역 세포 화학 (ICC)에 의해 획득 된 단백질 국소화 데이터와 서양 블로트 사이의 불일치를 조사하고 해결하는 데 사용될 수 있다는 추가적인 증거를 제공합니다. 구체적으로, 우리의 기술은 1) 단백질 키나아제 C-알파 (PKCα) 이소형이 양극성 세포뿐만 아니라 뮤린 ROS 및 RIS에도 존재하며, 낮은 농도임에도 불구하고24,25, 및 2) 로돕신 키나아제 (GRK1)가 단리된 OS 샘플에 우세하게 존재한다는 것을 보여주었다. 이 데이터는 특정 막대와 망막 단백질을 분리하고 정량화하기위한 두 가지 박리 기술의 효과를 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% O2 tank</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X SDS Sample Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>70607-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 and 5% CO2 tank</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames&#8217; Medium with L-glutamine, without bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 (99%, dihydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite (Anhydrous calcium sulfate, &#62;98% CaSO4, &#62;2% CoCl2)</td>
			<td>WA Hammond Drierite Co LTD</td>
			<td>21005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm)</td>
			<td>Falcon-Corning</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Falcon-Corning</td>
			<td>08-772F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Scalpel (No. 10, 40 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100499-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Scalpel (No. 11, 40 mm)</td>
			<td>VWT</td>
			<td>100499-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (99%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes pellet pestle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>z359971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Fast-Freeze Flasks</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q/de-ionized water</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (powder)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4062-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (crystal)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Sx0420-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur EDTA</td>
			<td>EMD</td>
			<td>4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur HEPES, Free Acid</td>
			<td>EMD</td>
			<td>5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Wrap Aluminum Foil</td>
			<td>Reynolds Brands</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m)</td>
			<td>Scotch-3M</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D67501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrafuge mini centrifuge</td>
			<td>Labnet International, Inc</td>
			<td>C1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue incubation chamber (purchased or custom made)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4103-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Signma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 &#956;m)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28310-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 &#956;m)</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore transfer pipet, Global Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76285-362</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two peeling methods for the isolation of photoreceptor cell compartments in the mouse retina for protein analysis

막대 광수용체는 뚜렷한 구획을 가진 고도로 편광 된 감각 뉴런입니다. 마우스 막대는 길고 (∼80 μm) 얇고 (~2 μm) 망막의 최외곽층, 광수용체 층에 측방으로 패킹되어, 유사한 세포 하부 구획의 정렬을 초래한다. 전통적으로, 동결된 평탄한 망막의 접선 절편은 상이한 막대 구획 내의 단백질의 이동 및 국소화를 연구하는데 사용되어 왔다. 그러나, 막대 지배적 마우스 망막의 높은 곡률은 접선 단면화를 어렵게 만든다. 구획 사이의 단백질 수송에 대한 연구에 동기를 부여하여, 우리는 막대 외부 세그먼트 (ROS)와 서부 블로트를위한 다른 세포 하부 구획을 안정적으로 분리하는 두 가지 박리 방법을 개발했습니다. 우리의 비교적 빠르고 간단한 기술은 농축 및 아세포 특이적 분획을 제공하여 정상 막대에서 중요한 광수용체 단백질의 분포 및 재분포를 정량적으로 측정합니다. 더욱이, 이러한 분리 기술은 또한 건강한 망막 및 퇴행성 망막 내의 다른 세포층의 단백질 조성을 분리하고 정량적으로 조사하기 위해 쉽게 적응될 수 있다.

본 전략은 웨스턴 블롯 분석을 위해 특정 막대 세포 구획들 사이에서 단백질을 분리하고 분석하는 비교적 빠르고 간단한 방법을 제공하기 위해 개발되었다. 우리는 두 가지 순차적 박리 기술 (그림 1 및 그림 2)을 적용한 다음 면역 블롯팅을 적용하여 이러한 방법이 암흑 및 광 적응 동물 모두에서 막대 트랜스 듀신 (GNAT1) 및 어레스틴 (ARR1)의 알려진 분?...

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Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

이 프로토콜은 단백질 분석을 위해 뮤린 막대 광수용체의 세포 하부 구획을 분리하는 두 가지 기술을 제시합니다. 첫 번째 방법은 살아있는 망막과 셀룰로오스 여과지를 사용하여 막대 외부 세그먼트를 분리하는 반면, 두 번째 방법은 동결 건조 된 망막과 접착 테이프를 사용하여 막대 내부 및 외부 세그먼트 층을 제거합니다.

단백질 분석을 위한 마우스 망막에서 광수용체 세포 구획의 단리를 위한 두 가지 박리 방법

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

여기에서 입증 된 두 가지 필링 기술은 개별 막대 세포 하부 구획을 분리하고 건강하고 병든 막대의 각 특수 구획에서 발생하는 중요한 생리 학적 과정을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 마우스 망막에서 다른 막대 세포 구획을 분리하는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한 간단한 기술은 저렴하고 평범한 실험실 재료를 사용하여 단백질 분석을 위해 막대 세포 하부 구획을 안정적으로 분리합니다.시작하려면 100 % 산소로 버블 링된 Ames HEPES 버퍼로 채워진 페트리 접시에 여과지 조각을 넣으십시오. 그런 다음, 넓은 보어 전달 피펫을 사용하여, 두세 달 된 C57 Black 6J 마우스로부터 해부된 망막 사각형 하나를 옮긴다. 분할 된 망막을 오목하게 향하게하고 광수용체가 접시의 바닥을 향해 아래로 향하고 있는지 확인하십시오.그런 다음 핀셋을 사용하여 반으로 줄어든 망막의 측면을 가볍게 잡고 여과지 위로 옮깁니다. 망막이 중앙에 배치되면 여과지를 위쪽으로 움직여 반으로 줄인 망막이 여과지에 닿아 막대 외부 세그먼트를 만들거나 ROS를 필터링하여 용지 접착을 만듭니다. 부착된 망막이 있는 여과지를 조심스럽게 Ames HEPES 버퍼에서 들어올립니다.여과지의 아래쪽을 종이 타월에 놓고 두세 번 닦아 말립니다. 망막이있는 여과지 측면에 Ames HEPES 한 방울을 넣고 여과지를 종이 타월에 다시 올려 놓고 말리십시오. 그런 다음 망막이있는 여과지를 페트리 접시에 다시 넣고 핀셋을 사용하여 반으로 줄어든 망막의 모든 가장자리를 부드럽게 밀어 올리고 모든면의 여과지에서 멀리 떨어 뜨립니다.망막을 여과지에서 섬세하게 벗겨 내고 망막의 극한 둘레만 만져서 구조적 완전성을 유지합니다. 그런 다음 페트리 접시에서 여과지를 들어 올리고 종이 타월에서 과도한 액체를 제거하여 망막과 접촉하는 쪽이 종이 타월에 닿지 않도록하십시오. 부분 ROS 층이 있는 여과지를 얼음 위에 라벨이 붙은 튜브에 넣고, 껍질을 벗긴 망막을 Ames HEPES 완충액에 잠기게 유지한다.이 반으로 줄어든 망막에 대해 박리 과정을 대략 일곱 번에서 여덟 번 반복하여 전체 ROS 층을 제거한다. 각각의 껍질 후에, 여과지를 동일한 튜브에 넣어 하나의 반으로 줄어든 망막으로부터 분리된 모든 ROS를 결합시킨다. 즉시 사용할 수 있도록 분리된 ROS의 모든 여과지 껍질이 들어있는 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.핀셋을 사용하여 남은 껍질을 벗긴 망막을 적절하게 라벨이 붙은 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 보관하여 즉시 사용하십시오. 동결 건조를위한 망막 샘플을 준비하려면 여과지 조각을 놓고 반으로 줄어든 망막을 차가운 링거의 버퍼로 채워진 페트리 접시에 옮깁니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 망막을 조심스럽게 뒤집어 오목한 방향으로 향하게하고 여과지 위에 놓이도록 움직입니다.절반으로 줄어든 망막 조각이 여과지에 닿도록 가장자리를 위쪽으로 들어 올립니다. 계속해서 Ringer의 솔루션에서 필터 페이퍼를 들어올립니다. 그런 다음 여과지의 바닥면을 종이 타월에 놓고 조심스럽게 두세 번 닦아 과도한 액체를 제거하십시오.그런 다음 핀셋이있는 여과지를 집어 들고 망막이있는 여과지 측면에 차가운 링거 한 방울을 추가하십시오. 다시 한 번, 과도한 액체를 제거하기 위해 종이 타월에 여과지를 놓습니다. 부착 된 각 망막과 여과지 샘플을 모든 샘플을 동결 할 준비가 될 때까지 차가운 링거로 채워진 페트리 접시에 보관하십시오.그런 다음 핀셋을 사용하여 각 샘플을 차가운 링거의 버퍼에서 들어 올려 핀셋이 여과지 가장자리에만 닿도록하여 반으로 줄어든 망막을 피하십시오. 각 여과지의 아래쪽을 종이 타월에 올려 놓고 과도한 액체를 제거하십시오. 그런 다음 망막이 부착 된 여과지 측면에 차가운 PBS 한 방울을 넣고 여과지를 종이 타월에 다시 닦으십시오.모든 여과지 조각을 페트리 접시에 넣고 보풀이없는 티슈 페이퍼를 사용하여 여과지 주변의 과도한 액체를 제거합니다. 그런 다음 접시 전체를 알루미늄 호일로 단단히 감싸고 알루미늄 호일의 가장자리가 고정되어 페트리 접시의 바닥에 부드럽게 눌러지도록하십시오. 알루미늄 호일 뚜껑에 0.1 ~ 0.2 밀리미터 구멍 몇 개를 뚫습니다.다음으로, 금속 집게를 사용하여 알루미늄 호일로 덮인 페트리 접시를 액체 질소로 서서히 내립니다. 동결건조할 준비가 될 때까지 샘플을 액체 질소에 보관하십시오. 동결 건조를 위해 알루미늄 호일로 덮인 페트리 접시를 동결 건조 플라스크에 넣고 제조업체의 프로토콜에 따라 동결 건조기 기계에 부착하십시오.망막을 30 분 동안 동결 건조하십시오. 동결건조 후, 동결건조된 망막 위에 작은 테이프 조각을 조심스럽게 깔고 핀셋으로 약간의 압력을 가하여 광수용체 층과 결합하도록 하여 막대 외부 및 내부 세그먼트를 수집합니다. 테이프를 천천히 떼어내고 ROS와 RIS가 모두 테이프에 부착되었는지 확인합니다.얇은 흰색 필름이 골절 된 표면에 나타납니다. 이것이 RIS입니다. 이 RIS를 분리하려면 다른 테이프 조각을 놓고 테이프를 파쇄된 표면에 아래로 밀어 넣습니다.그런 다음 주황색 분홍색 층만 있는 테이프 조각을 ROS로 표시된 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 얇고 흰색 층이 있는 테이프 조각을 RIS라고 표시된 다른 튜브에 넣습니다. 다음으로, 테이프를 사용하여, 두껍고 하얀 층을 벗겨냄으로써 여과지 상에 위치된 남아있는 망막 조직을 수집한다. 그런 다음, 이것을 분리하여 OIS라고 표시된 튜브에 넣는다.같은 날 사용하는 경우, 동결건조된 망막으로부터 분리된 층을 실온에서 저장한다. 암흑적응 동물에서, GNAT1 및 ARR1의 분포는 공지된 암흑 상태 분포와 밀접하게 일치하였으며, 여기서 GNAT1 신호는 ROS 분리에서 눈에 띄게 가장 강했고, ARR1 신호는 ROS 분리에서 더 강했다. GNAT1 및 ARR1 신호의 정량화는 ROS 및 ROS 샘플에서 GNAT1 및 ARR1에 대한 암흑도 조건 사이에 유의한 차이를 보였다.어두운 샘플과 밝은 적응 샘플 모두에서 G beat 5S, 시토크롬 C 및 액틴 신호는 ROS 샘플에서 제외되어 다른 세포 층으로부터의 오염이 없음을 입증합니다. 추가적으로, G 베타 5L 신호는 ROS 샘플에서 명확하게 볼 수 있었다. 무손상되고 박리된 동결건조된 망막의 표면의 주사 전자 현미경 검사는, 접착 테이프로 박리하기 전에, 무손상 동결건조된 망막의 표면이 특징적인 원통형 ROS와 밀접하게 일치한다는 것을 보여주었다.초기 테이프 박리 후, ROS 및 RIS는 남은 망막, 박리, 동결건조된 망막의 표면 상에 존재하는 균일한 핵층에 의해 입증된 바와 같이 완전히 제거되는 것으로 나타났다. 후속 테이프 박리는 박리된 층의 자유 표면으로부터 RIS를 제거하였다. 이 기술은 또한 GRK1 면역반응성이 광-노출된 망막에서 ROS 샘플에서 가장 강렬하고, OIS 샘플에는 부재한다는 것을 입증하였다.반대로, ROS 및 RIS 샘플은 PKC 알파에 대해 희미한 신호를 표시했는데, 이는 일반적으로 면역형광 염색에 의해 ROS 또는 RIS에서 검출되지 않는다. 마지막으로, 차선책의 테이프 필링은 약간 오염 된 샘플을 생성 할 수 있습니다. RIS 샘플은 일부 OIS 샘플로 오염되어 G 베타 5L 및 G 베타 5S 대역 및 더 높은 PKC 알파 신호를 생성했습니다.망막을 동결 건조 할 때는주의를 기울여야합니다. 부적절한 동결 건조 기술을 사용하면 망막이 녹아 테이프로 다른 막대 하부 세포 층을 분리하는 것이 불가능해질 수 있습니다. qRT-PCR과 함께 이러한 테이프 박리 방법을 사용하여 망막의 나머지 부분으로부터 광수용체 전사체의 분리를 허용하였다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

연구

신경과학

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Adult Neurogenesis

NF-κB에 의존하는 성인 신경 발생의 변조 및 분석을위한 방법

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

마우스 망막을 사용하여 중추 신경계의 혈관 재생의 평가

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

에 vibratome 단면 마우스 망막 광 수용체의 문화를 준비하는 방법

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

마우스 부신하는 chromaffin 세포에서 세포 부착 된 정전 용량 측정을위한 방법

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

이미징 CA<sup&gt; 2 +</sup마우스 망막의 광 수용체 콘 축삭 터미널에서&gt; 역학

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

어디 당신이 문제: 한 해 부 자르고 눈 랜드마크에서 마우스 망막의 공간적 방향에 대 한 분석 가이드

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...