Name: two peeling methods for the isolation of photoreceptor cell compartments in the mouse retina for protein analysis
Uploaded: 2021-12-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant EY12155, EY027193 og EY027387 til JC. Vi er takknemlige til Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) og Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) for korrekturlesing av manuskriptet. Vi vil også takke Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, USA) og Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, USA) for å gi nødvendig utstyr for å samle forfatteren ga opptak. Materiale fra: Kasey Rose et al, Separasjon av fotoreseptorcellerom i mus netthinne for proteinanalyse, Molecular Neurodegeneration, publisert [2017], [Springer Nature].

Alle eksperimenter ble utført i henhold til de lokale institusjonelle retningslinjene til komiteen for dyrepleie fra University of Southern California (USC).
1. Levende celle retinal peeling metode
<ol><li>Tilberedning av Ames' buffere, peelingpapir og disseksjonsfat<ol>
<li>Bruk stump spiss saks saks (eller tilsvarende saksetype), kutt cellulosefilterpapiret (grad 413) i rektangler som måler ca. 5 mm x 2,5 mm. Oppbevar stikkene til senere bruk.</li>
		<li>Forbered 1 L av ...

<ol>
	<li>Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+proteins+and+phototransduction.">G proteins and phototransduction.</a> Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).</li><li>Molday, R. S., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptors+at+a+glance.">Photoreceptors at a glance.</a> Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).</li><li>Koch, K. W., Dell'Orco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+signaling+networks+in+vertebrate+photoreceptor+cells.">Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).</li><li>Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+light+intensity+threshold+for+retinal+damage+in+albino+rats+raised+under+6+lx.">Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx.</a> Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).</li><li>Brann, M. R., Cohen, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+expression+of+transducin+mRNA+and+translocation+of+transducin+in+rods+of+rat+retina.">Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina.</a> Science. 235 (4788), 585-587 (1987).</li><li>Philp, N. J., Chang, W., Long, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-stimulated+protein+movement+in+rod+photoreceptor+cells+of+the+rat+retina.">Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina.</a> FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).</li><li>Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+induced+shift+and+binding+of+S-antigen+in+retinal+rods.">Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods.</a> Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).</li><li>Roof, D. J., Heth, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transducin+in+retinal+rod+photoreceptor+outer+segments.">Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments.</a> Science. 241 (4867), 845-847 (1988).</li><li>Sokolov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+light-driven+translocation+of+transducin+between+the+two+major+compartments+of+rod+cells:+a+novel+mechanism+of+light+adaptation.">Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation.</a> Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).</li><li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex.">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li><li>Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+translocation+is+induced+at+a+critical+threshold+of+visual+signaling+and+is+superstoichiometric+to+bleached+rhodopsin.">Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).</li><li>Nair, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+redistribution+of+arrestin+in+vertebrate+rods+is+an+energy-independent+process+governed+by+protein-protein+interactions.">Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions.</a> Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).</li><li>Strissel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recoverin+undergoes+light-dependent+intracellular+translocation+in+rod+photoreceptors.">Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).</li><li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors.">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).</li><li>Majumder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+contributes+to+rod+survival+and+enhances+synaptic+transmission+from+rods+to+rod+bipolar+cells.">Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).</li><li>Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+photoreceptors+die+(and+why+they+don't).">Why photoreceptors die (and why they don't).</a> BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).</li><li>Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+to+light+damage+in+an+arrestin+knockout+mouse+model+of+Oguchi+disease+(stationary+night+blindness).">Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness).</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin-1+expression+level+in+rods:+balancing+functional+performance+and+photoreceptor+health.">Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health.</a> Neuroscience. 174, 37-49 (2011).</li><li>McConnell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+retinal+outer+segment+fragments.">The isolation of retinal outer segment fragments.</a> The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).</li><li>Tsang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+target+enzyme+in+deactivation+of+photoreceptor+G+protein+in+vivo.">Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo.</a> Science. 282 (5386), 117-121 (1998).</li><li>Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recordings+of+retinal+bipolar+cells+in+response+to+extracellular+electrical+stimulation+in+wholemount+mouse+retina.">Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).</li><li>Guido, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+obtain+retinal+cell+preparations+highly+enriched+in+specific+cell+types.+Suitability+for+lipid+metabolism+studies.">A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies.</a> Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).</li><li>Hayashi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+by+cyclin-dependent+protein+kinase+5+of+the+regulatory+subunit+of+retinal+cGMP+phosphodiesterase.+II.+Its+role+in+the+turnoff+of+phosphodiesterase+in+vivo.">Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).</li><li>Wolbring, G., Cook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+and+characterization+of+protein+kinase+C+from+bovine+retinal+rod+outer+segments.">Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments.</a> European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).</li><li>Williams, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+kinase+C+in+photoreceptor+outer+segments.">Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments.</a> Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).</li><li>Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+form+of+the+G+protein+beta+subunit+Gbeta5+is+specifically+expressed+in+the+vertebrate+retina.">A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).</li><li>Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTPase+activating+factor+for+transducin+in+rod+photoreceptors+is+the+complex+between+RGS9+and+type+5+G+protein+beta+subunit.">The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).</li><li>Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+rhodopsin/arrestin+complex+leads+to+retinal+degeneration+in+a+transgenic+mouse+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.">Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).</li><li>Chen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+photoresponses+and+light-induced+apoptosis+in+rods+lacking+rhodopsin+kinase.">Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mistrafficking+of+prenylated+proteins+causes+retinitis+pigmentosa+2.">Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2.</a> FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).</li><li>Weiss, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+differences+in+expression+of+G-protein-coupled+receptor+kinase+(GRK)+7+and+GRK1+in+mammalian+cone+photoreceptor+cells:+implications+for+cone+cell+phototransduction.">Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).</li><li>Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+forms+of+human+rhodopsin+kinase+(GRK1).">Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1).</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).</li><li>Newton, A. C., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+protein+kinase+C+in+the+phosphorylation+of+rhodopsin.">Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).</li><li>Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+protein+kinase+C+isoforms+are+required+for+rod+photoreceptor+differentiation.">Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).</li><li>Sokal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+kinase+C+isozymes+responsible+for+the+phosphorylation+of+photoreceptor-specific+RGS9-1+at+Ser475.">Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).</li><li>Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+photoreceptor+cell+compartments+in+mouse+retina+for+protein+analysis.">Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).</li><li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+degeneration:+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait.">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li></ol>

Mange netthinnesykdommer påvirker stang fotoreseptorceller, noe som fører til stangdød og til slutt fullstendig synstap37. En betydelig del av den genetiske og mekanistiske opprinnelsen til menneskelig retinal degenerasjon har blitt vellykket rekapitulert i mange musemodeller gjennom årene. I den sammenhengen vil evnen til enkelt og selektivt å skille individuelle stang subcellulære rom fra den lille mus netthinnen i stor grad forbedre vår forståelse av lokaliserte biokjemiske og molekylæ...

Rod fotoreseptorceller, tett pakket i det ytterste laget av nevral netthinnen, er en integrert del av svakt lyssyn. For å fungere som trofaste fotontellere, bruker stenger en G-proteinbasert signalvei, kalt fototransduksjon, for å generere raske, forsterkede og reproduserbare responser på enkelt fotonfangst. Denne responsen på lys utløser til slutt en endring i strømmen ved plasmamembranen og signaliseres deretter til resten av det visuelle systemet1. Som navnet antyder, har hver stangcelle en distinkt stanglignende form og viser en svært polarisert cellulær morfologi, bestående av et ytre segment (OS), indre segment (IS), cellekropp (CB) og synaptisk terminal (ST). Hvert subcellulære rom har spesifikke proteinmaskiner (membranbundet og løselig), biomolekylære egenskaper og proteinkomplekser som spiller avgjørende roller som visuell fototransduksjon, generell rengjøring og proteinsyntese og synaptisk overføring2,3.
For over 30 år siden ble den lysavhengige gjensidige bevegelsen av subcellulære proteiner, spesielt transducin (vekk fra operativsystemet) og arrestin (mot operativsystemet), først observert4,5,6,7. Tidlig ble dette observerte fenomenet mottatt med skepsis, delvis på grunn av immunhiistokjemiens sårbarhet for epitopmaskering8. Tidlig på 2000-tallet ble stimulusavhengig proteintranslokasjon bekreftet ved hjelp av en streng og krevende fysisk seksjoneringsteknikk9. Seriell tangensiell seksjonering av den frosne flatmonterte gnager netthinnen etterfulgt av immunoblotting avslørte at transducin9,10, arrestin11,12, og recoverin13 alle gjennomgår subcellulær omfordeling som svar på lys. Det antas at lysdrevet translokasjon av disse viktige signalproteinene ikke bare regulerer følsomheten til fototransduksjonskaskaden9,14,15, men kan også være nevrobeskyttende mot lysskader16,17,18. Fordi lysdrevet proteintransport i stenger ser ut til å ha stor betydning for stangcellebiologi og fysiologi, er teknikker som tillater isolering av forskjellige subcellulære rom for å bestemme proteinfordeling verdifulle forskningsverktøy.
For tiden er det noen få metoder som tar sikte på å isolere stangens subcellulære rom. Imidlertid kan disse metodene være lange og vanskelige å reprodusere, eller krever en betydelig mengde retinal isolering. Rod ytre segment (ROS) preparater via tetthet gradient sentrifugering19, for eksempel, brukes ofte til å skille ROS fra retinal homogenat. Denne metoden er mye brukt for vestlig blot, men prosedyren er svært tidkrevende og krever minst 8-12 murine netthinne20. På den annen side har seriell tangentiell seksjonering av frossen murine og rotte netthinne blitt implementert for å isolere operativsystemet, IS, CB og ST9,11,13. Denne metoden er imidlertid teknisk utfordrende på grunn av nødvendigheten av å fullt ut flate ut den lille og svært buede murine netthinnen for å justere netthinnelagene før tangentiell seksjonering. Siden det er en mengde musemodeller og transgene mus som recapitulerer sykdommer i det visuelle systemet, holder opprettelsen av en teknikk som pålitelig, raskt og enkelt skiller individuelle stangrom løfter om å avsløre de fysiologiske prosessene som oppstår i hvert spesialiserte rom og mekanismene som ligger til grunn for visuelle prosesser i helse og sykdom.
For å lette disse undersøkelsene beskriver vi to peelingmetoder som isolerer stang subcellulære rom lettere enn dagens protokoller. Den første peelingmetoden, tilpasset fra en teknikk for å eksponere fluorescerende merkede bipolare celler for patchklemmeopptak21, bruker cellulosefilterpapir for sekvensielt å fjerne ROS fra en levende, isolert murine netthinne (figur 1). Den andre metoden, tilpasset fra en prosedyre som isolerer de tre primære netthinnecellelagene fra en kylling22 og frog23 netthinne, bruker tape for å fjerne ROS og stang indre segment (RIS) fra en lyofilisert netthinne (figur 2). Begge prosedyrene kan fullføres i 1 time og er betydelig brukervennlige. Vi gir validering av effektiviteten til disse to separasjonsprotokollene for vestlig blotte ved å bruke mørktilpasset og lys eksponert netthinne fra C57BL/6J-mus for å demonstrere lysindusert translokasjon av stangtransducin (GNAT1) og arrestin (ARR1). Videre, ved hjelp av tape peeling-metoden, gir vi ytterligere bevis på at teknikken vår kan brukes til å undersøke og adressere inkonsekvenser mellom proteinlokaliseringsdata som er samlet inn av immunocytokjemi (ICC) og vestlige flekker. Spesielt viste vår teknikk at: 1) protein kinase C-alfa (PKCα) isoform er til stede ikke bare i bipolare celler, men også i murine ROS og RIS, om enn i lave konsentrasjoner24,25, og 2) rhodopsin kinase (GRK1) er for tiden hovedsakelig i den isolerte OS-prøven. Disse dataene viser effektiviteten av våre to peeling teknikker for separering og kvantifisering av spesifikke stang og retinal proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% O2 tank</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X SDS Sample Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>70607-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 and 5% CO2 tank</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames&#8217; Medium with L-glutamine, without bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 (99%, dihydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite (Anhydrous calcium sulfate, &#62;98% CaSO4, &#62;2% CoCl2)</td>
			<td>WA Hammond Drierite Co LTD</td>
			<td>21005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm)</td>
			<td>Falcon-Corning</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Falcon-Corning</td>
			<td>08-772F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Scalpel (No. 10, 40 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100499-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Scalpel (No. 11, 40 mm)</td>
			<td>VWT</td>
			<td>100499-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (99%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes pellet pestle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>z359971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Fast-Freeze Flasks</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q/de-ionized water</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (powder)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4062-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (crystal)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Sx0420-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur EDTA</td>
			<td>EMD</td>
			<td>4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur HEPES, Free Acid</td>
			<td>EMD</td>
			<td>5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Wrap Aluminum Foil</td>
			<td>Reynolds Brands</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m)</td>
			<td>Scotch-3M</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D67501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrafuge mini centrifuge</td>
			<td>Labnet International, Inc</td>
			<td>C1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue incubation chamber (purchased or custom made)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4103-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Signma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 &#956;m)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28310-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 &#956;m)</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore transfer pipet, Global Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76285-362</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two peeling methods for the isolation of photoreceptor cell compartments in the mouse retina for protein analysis

Rod fotoreseptorer er svært polariserte sensoriske nevroner med forskjellige rom. Musestenger er lange (~ 80 μm) og tynne (~ 2 μm) og er sidelengs pakket i det ytterste laget av netthinnen, fotoreseptorlaget, noe som resulterer i justering av analoge subcellulære rom. Tradisjonelt har tangentiell seksjonering av den frosne flatmonterte netthinnen blitt brukt til å studere bevegelse og lokalisering av proteiner i forskjellige stangrom. Imidlertid gjør den høye krumningen i den stangdomenerende mus netthinnen tangentielle seksjoner utfordrende. Motivert av studiet av proteintransport mellom rom, utviklet vi to peelingmetoder som pålitelig isolerer stangens ytre segment (ROS) og andre subcellulære rom for vestlige flekker. Våre relativt raske og enkle teknikker leverer berikede og subcellulære fraksjoner for kvantitativt å måle fordelingen og omfordelingen av viktige fotoreseptorproteiner i normale stenger. Videre kan disse isolasjonsteknikkene også enkelt tilpasses for å isolere og kvantitativt undersøke proteinsammensetningen av andre cellulære lag innen både sunn og degenererende netthinne.

De nåværende strategiene ble utviklet for å gi relativt raske og enkle metoder for å isolere og analysere proteiner blant spesifikke stang subcellulære rom for vestlig blotanalyse. Vi brukte to sekvensielle peeling teknikker (figur 1 og figur 2) etterfulgt av immunoblotting for å demonstrere at disse metodene på en pålitelig måte kunne brukes til å oppdage den kjente fordelingen av stangtransducin (GNAT1) og arrestin (ARR1) hos både mørk- og lystilpa...

Watch this Scientific Journal Video about Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis at JoVE.com

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

Denne protokollen presenterer to teknikker for å isolere de subcellulære rommene til murine rod fotoreseptorer for proteinanalyse. Den første metoden benytter levende netthinne og cellulosefilterpapir for å skille stang ytre segmenter, mens den andre bruker lyofilisert netthinne og tape for å skrelle bort stang indre og ytre segmentlag.

To peeling metoder for isolering av photoreceptor celle rom i musen netthinnen for protein analyse

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

De to peeling-teknikkene som demonstreres her isolerer individuelle stang subcellulære rom, og kan bidra til å avsløre de viktige fysiologiske prosessene som forekommer i hvert spesialiserte rom i sunne og syke stenger. Det kan være utfordrende å isolere forskjellige stangcellerom fra muse netthinnen. Disse enkle teknikkene bruker billige og vanlige laboratoriematerialer for pålitelig å isolere stang subcellulære rom for proteinanalyse.Til å begynne med, legg et stykke filterpapir i en Petri-tallerken fylt med Ames HEPES-buffer boblet med 100% oksygen. Deretter overfører du et retinal rektangel som er dissekert fra en to til tre måneder gammel C57 Black 6J-mus ved hjelp av en bredboret overføringspipette. Orienter den partisjonerte netthinnen konkav opp og sørg for at fotoreseptorene vender ned mot bunnen av parabolen.Deretter, ved hjelp av pinsett, ta lett tak i sidene på den halverte netthinnen og flytt den på toppen av filterpapiret. Når netthinnen er sentrert, flytter du filterpapiret oppover slik at den halverte netthinnen berører filterpapiret for å lage stang ytre segment, eller ROS for å filtrere papiradhesjon. Løft filterpapiret forsiktig med den vedlagte netthinnen ut av Ames HEPES-bufferen.Legg undersiden av filterpapiret på et papirhåndkle og tørk to til tre ganger for å tørke. Tilsett en dråpe Ames HEPES på siden av filterpapiret med netthinnen, og legg filterpapiret på papirhåndkleet igjen for å tørke. Deretter plasserer du filterpapiret med netthinnen tilbake i Petri-parabolen, og bruk pinsett, skyv forsiktig alle kantene på den halverte netthinnen opp og bort fra filterpapiret på alle sider.Skrell netthinnen forsiktig bort fra filterpapiret, og beveg bare den ekstreme omkretsen av netthinnen for å bevare dens strukturelle integritet. Løft deretter filterpapiret fra Petri-fatet og fjern overflødig væske på et papirhåndkle, og sørg for at siden i kontakt med netthinnen ikke kommer i kontakt med papirhåndkleet. Plasser filterpapiret med det delvise ROS-laget i et merket rør på is, og hold den skrellede netthinnen nedsenket i Ames HEPES-buffer.Gjenta peelingprosessen for denne halverte netthinnen omtrent syv til åtte ganger for å fjerne hele ROS-laget. Etter hver peeling plasserer du filterpapiret i samme rør for å kombinere all ROS isolert fra en halvert netthinne. Hold røret som inneholder alle filterpapirskall av den isolerte ROS på isen for umiddelbar bruk.Bruk pinsett, overfør den resterende skrellede netthinnen til et passende merket rør og hold røret på is for umiddelbar bruk. For å forberede retinal prøven for lyofilisering, legg et stykke filterpapir og overfør en halvert netthinne til en Petri-tallerken fylt med kald Ringers buffer. Deretter, ved hjelp av pinsett, snu netthinnen forsiktig slik at den er orientert konkav opp og flytt den til hvile på toppen av filterpapiret.Løft filterpapiret etter kantene oppover slik at det halverte netthinnen berører filterpapiret. Fortsett å løfte filterpapiret ut av Ringers løsning. Plasser deretter undersiden av filterpapiret på et papirhåndkle og forsiktig dab to til tre ganger for å fjerne overflødig væske.Deretter plukker du opp filterpapiret med pinsett og legger til en dråpe kalde Ringer's på siden av filterpapiret med netthinnen. Sett igjen filterpapiret på papirhåndkleet for å fjerne overflødig væske. Oppbevar hver reparert netthinne og filterpapirprøve i en Petri-tallerken fylt med kalde Ringer's til de er klare til å fryse alle prøver.Deretter, ved hjelp av pinsett, løft hver prøve ut av den kalde Ringers buffer, og sørg for at pinsettene bare kontakter filterpapirkantene, og unngår den halverte netthinnen. Legg undersiden av hvert filterpapir på et papirhåndkle for å fjerne overflødig væske. Deretter legger du til en dråpe kald PBS på siden av filterpapiret der netthinnen festes og dab filterpapiret på papirhåndkleet igjen.Legg alle filterpapirstykker i Petri-parabolen, og bruk lofritt papir, veke bort overflødig væske rundt filterpapiret. Pakk deretter hele parabolen tett med aluminiumsfolie og sørg for at kantene på aluminiumsfolien er sikret og jevnt presset inn i bunnen av Petri-parabolen. Punkter en håndfull hull på 0,1 til 0,2 millimeter inn i aluminiumsfolielokket.Deretter, ved hjelp av metall tang, gradvis senke aluminium folie dekket Petri parabolen i flytende nitrogen. Oppbevar prøvene i flytende nitrogen til de er klare til å lyofilisere. For lyofilisering, plasser den aluminiumsfoliebelagte Petri-parabolen i en frysetørkende kolbe og fest den til lyofilisatormaskinen etter produsentens protokoll.Lyofiliser netthinnen i 30 minutter. Etter lyofilisering samler du stangens ytre og indre segment ved å forsiktig legge et lite stykke tape på toppen av den lyofiliserte netthinnen og påføre litt trykk med pinsettene for å sikre at den binder seg til fotoreseptorlaget. Skrell tapen langsomt bort og sørg for at både ROS og RIS har festet seg til båndet.En tynn, hvit film vil være til stede på den oppsprukne overflaten. Dette er RIS. For å skille denne RIS, plasser et annet stykke tape og skyv båndet ned på den oppsprukne overflaten.Plasser deretter tapestykket med bare det oransje-rosa laget i et mikrosenterrør merket som ROS, og biter av tape med det tynne, hvite laget i et annet rør merket RIS. Deretter samler du det gjenværende netthinnevevet som ligger på filterpapiret ved å skrelle av det tykke, hvite laget. Deretter plasserer du denne isolasjonen i et rør merket OIS.Hvis du bruker samme dag, må du lagre de isolerte lagene fra den lyofiliserte netthinnen ved romtemperatur. I mørktilpassede dyr samsvarte fordelingen av GNAT1 og ARR1 tett med deres kjente mørketilstandsfordelinger, der GNAT1-signalet var synlig sterkest i ROS-isolasjonen, og ARR1-signalet var mer robust i ROS-isolasjonen. Kvantifisering av GNAT1- og ARR1-signalene viste signifikante forskjeller mellom mørke lysforhold for GNAT1 og ARR1 i ROS- og ROS-prøver.I både mørke og lystilpassede prøver er G beat 5S, cytokrom C og aktinsignaler utelukket fra ROS-prøvene, noe som viser fravær av forurensning fra andre cellulære lag. I tillegg var G beta 5L-signal tydelig synlig i ROS-prøvene. Skanning av elektronmikroskopi av overflatene av intakt og skrelt lyofilisert netthinne viste at før peeling med tape, samsvarte overflaten av intakt lyofilisert netthinne tett med den karakteristiske sylindriske ROS.Etter den første tapeskallen så ROS og RIS ut til å være helt fjernet, noe som fremgår av det ensartede atomlaget som er tilstede på overflaten av rester, skrelles, lyofilisert netthinne. Etterfølgende tapeskall fjernet RIS fra den frie overflaten av det skrellede laget. Denne teknikken viste også at GRK1 immunoreaktivitet var mest intens i ROS-prøver i lyseksponert netthinne, og fraværende i OIS-prøver.På den annen side viste ROS- og RIS-prøver et svakt signal for PKC-alfa, som vanligvis ikke oppdages i ROS eller RIS ved immunfluorescensfarging. Til slutt kan suboptimal tape peeling gi litt forurensede prøver. RIS-prøven ble forurenset med noe OIS-prøve, og produserte både G beta 5L- og G beta 5S-bånd, og et høyere PKC alfasignal.Det må utvises forsiktighet ved lyofilisering av netthinnen. Hvis en feil lyofiliseringsteknikk brukes, kan netthinnen smelte, noe som gjør det umulig å isolere forskjellige stangundercellulære lag med tape. Ved hjelp av denne tape peeling metoden i forbindelse med qRT-PCR har tillatt for separasjon av fotoreseptor transkripsjoner fra resten av netthinnen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Adult Neurogenesis

Metoder for Modulation og analyse av NF-κB-avhengig Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, to kulturer: Isolation and Culture of Adult nevrale stamceller fra de to nevrogene Soner Individuell Mus

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Assessment of Vascular Regeneration i CNS Bruke musen Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratome Seksjonering Mouse Retina å Forbered fotoreseptorlidelser kulturer

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Metoder for Cell-festet måling av kapasitans i Mouse Adrenal chromaffin Cell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics i Cone fotoreseptor Axon terminaler Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Dyptgående Fysiologisk Analyse av Definerte cellepopulasjoner i Akutt vevssnitt av musen Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Hvor du klippe saker: En disseksjon og analyse Guide romlig orientering musen netthinnen fra okulær landemerker

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

I Vivo To-fotonet avbilding av kortikale nevroner i Neonatal mus

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...