Name: two peeling methods for the isolation of photoreceptor cell compartments in the mouse retina for protein analysis
Uploaded: 2021-12-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo NIH Grant EY12155, EY027193 e EY027387 para JC. Somos gratos ao Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, EUA) e Natalie Chen (USC, Los Angeles, EUA) por revisar o manuscrito. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, EUA) e ao Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, EUA) por fornecerem os equipamentos necessários para coletar as imagens fornecidas pelo autor. Material de: Kasey Rose et al, Separação de compartimentos celulares fotorreceptor na retina do rato para análise de proteínas, Neurodegeneração Molecular, publicado [2017], [Springer Nature].

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais locais do comitê de pesquisa em cuidados com animais da Universidade do Sul da Califórnia (USC).
1. Método de peeling de retina de células vivas
<ol><li>Preparação dos buffers de Ames, papéis descascando e prato de dissecção<ol>
<li>Utilizando uma tesoura de íris de ponta cega (ou tipo de tesoura equivalente), corte o papel filtro de celulose (Grau 413) em retângulos medindo aproxima...

<ol>
	<li>Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+proteins+and+phototransduction.">G proteins and phototransduction.</a> Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).</li><li>Molday, R. S., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptors+at+a+glance.">Photoreceptors at a glance.</a> Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).</li><li>Koch, K. W., Dell'Orco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+signaling+networks+in+vertebrate+photoreceptor+cells.">Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).</li><li>Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+light+intensity+threshold+for+retinal+damage+in+albino+rats+raised+under+6+lx.">Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx.</a> Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).</li><li>Brann, M. R., Cohen, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+expression+of+transducin+mRNA+and+translocation+of+transducin+in+rods+of+rat+retina.">Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina.</a> Science. 235 (4788), 585-587 (1987).</li><li>Philp, N. J., Chang, W., Long, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-stimulated+protein+movement+in+rod+photoreceptor+cells+of+the+rat+retina.">Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina.</a> FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).</li><li>Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+induced+shift+and+binding+of+S-antigen+in+retinal+rods.">Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods.</a> Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).</li><li>Roof, D. J., Heth, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transducin+in+retinal+rod+photoreceptor+outer+segments.">Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments.</a> Science. 241 (4867), 845-847 (1988).</li><li>Sokolov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+light-driven+translocation+of+transducin+between+the+two+major+compartments+of+rod+cells:+a+novel+mechanism+of+light+adaptation.">Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation.</a> Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).</li><li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex.">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li><li>Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+translocation+is+induced+at+a+critical+threshold+of+visual+signaling+and+is+superstoichiometric+to+bleached+rhodopsin.">Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).</li><li>Nair, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+redistribution+of+arrestin+in+vertebrate+rods+is+an+energy-independent+process+governed+by+protein-protein+interactions.">Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions.</a> Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).</li><li>Strissel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recoverin+undergoes+light-dependent+intracellular+translocation+in+rod+photoreceptors.">Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).</li><li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors.">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).</li><li>Majumder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+contributes+to+rod+survival+and+enhances+synaptic+transmission+from+rods+to+rod+bipolar+cells.">Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).</li><li>Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+photoreceptors+die+(and+why+they+don't).">Why photoreceptors die (and why they don't).</a> BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).</li><li>Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+to+light+damage+in+an+arrestin+knockout+mouse+model+of+Oguchi+disease+(stationary+night+blindness).">Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness).</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin-1+expression+level+in+rods:+balancing+functional+performance+and+photoreceptor+health.">Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health.</a> Neuroscience. 174, 37-49 (2011).</li><li>McConnell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+retinal+outer+segment+fragments.">The isolation of retinal outer segment fragments.</a> The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).</li><li>Tsang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+target+enzyme+in+deactivation+of+photoreceptor+G+protein+in+vivo.">Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo.</a> Science. 282 (5386), 117-121 (1998).</li><li>Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recordings+of+retinal+bipolar+cells+in+response+to+extracellular+electrical+stimulation+in+wholemount+mouse+retina.">Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).</li><li>Guido, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+obtain+retinal+cell+preparations+highly+enriched+in+specific+cell+types.+Suitability+for+lipid+metabolism+studies.">A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies.</a> Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).</li><li>Hayashi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+by+cyclin-dependent+protein+kinase+5+of+the+regulatory+subunit+of+retinal+cGMP+phosphodiesterase.+II.+Its+role+in+the+turnoff+of+phosphodiesterase+in+vivo.">Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).</li><li>Wolbring, G., Cook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+and+characterization+of+protein+kinase+C+from+bovine+retinal+rod+outer+segments.">Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments.</a> European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).</li><li>Williams, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+kinase+C+in+photoreceptor+outer+segments.">Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments.</a> Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).</li><li>Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+form+of+the+G+protein+beta+subunit+Gbeta5+is+specifically+expressed+in+the+vertebrate+retina.">A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).</li><li>Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTPase+activating+factor+for+transducin+in+rod+photoreceptors+is+the+complex+between+RGS9+and+type+5+G+protein+beta+subunit.">The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).</li><li>Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+rhodopsin/arrestin+complex+leads+to+retinal+degeneration+in+a+transgenic+mouse+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.">Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).</li><li>Chen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+photoresponses+and+light-induced+apoptosis+in+rods+lacking+rhodopsin+kinase.">Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mistrafficking+of+prenylated+proteins+causes+retinitis+pigmentosa+2.">Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2.</a> FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).</li><li>Weiss, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+differences+in+expression+of+G-protein-coupled+receptor+kinase+(GRK)+7+and+GRK1+in+mammalian+cone+photoreceptor+cells:+implications+for+cone+cell+phototransduction.">Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).</li><li>Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+forms+of+human+rhodopsin+kinase+(GRK1).">Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1).</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).</li><li>Newton, A. C., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+protein+kinase+C+in+the+phosphorylation+of+rhodopsin.">Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).</li><li>Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+protein+kinase+C+isoforms+are+required+for+rod+photoreceptor+differentiation.">Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).</li><li>Sokal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+kinase+C+isozymes+responsible+for+the+phosphorylation+of+photoreceptor-specific+RGS9-1+at+Ser475.">Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).</li><li>Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+photoreceptor+cell+compartments+in+mouse+retina+for+protein+analysis.">Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).</li><li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+degeneration:+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait.">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li></ol>

Muitas doenças da retina afetam as células fotorreceptoras da haste, levando à morte da haste e, em última instância, à perda completa da visão37. Uma parte significativa das origens genéticas e mecanicistas da degeneração da retina humana foram recapituladas com sucesso em inúmeros modelos de camundongos ao longo dos anos. Nesse contexto, a capacidade de separar facilmente e seletivamente compartimentos subcelulares individuais da pequena retina do rato aumentaria muito nossa compreens...

As células fotorreceptoras de rod, bem embaladas na camada mais externa da retina neural, são parte integrante da visão de luz fraca. Para funcionar como contadores de fótons fiéis, as hastes utilizam uma via de sinalização baseada em proteína G, denominada fototransdução, para gerar respostas rápidas, amplificadas e reprodutíveis à captura de fótons únicos. Esta resposta à luz finalmente desencadeia uma mudança na correnteza na membrana plasmática e é posteriormente sinalizada para o resto do sistema visual1. Como o nome indica, cada célula de haste tem uma forma distinta semelhante a uma haste e exibe uma morfologia celular altamente polarizada, consistindo de um segmento externo (OS), segmento interno (IS), corpo celular (CB) e terminal sináptico (ST). Cada compartimento subcelular possui máquinas proteicas específicas (ligadas à membrana e solúveis), características biomoleculares e complexos proteicos que desempenham papéis cruciais, como fototransdução visual, limpeza geral e síntese de proteínas, e transmissão sináptica2,3.
Há mais de 30 anos, o movimento recíproco dependente da luz de proteínas subcelulares, especificamente transdutina (longe do SO) e preso (em direção ao SO), foi observado pela primeira vez4,5,6,7. No início, esse fenômeno observado foi recebido com ceticismo, devido, em parte, à vulnerabilidade da imunohistoquímica ao mascaramento de epítope8. No início dos anos 2000, a translocação de proteínas dependentes de estímulos foi confirmada por meio de uma rigorosa e árdua técnica de secção física9. A seção tangencial serial da retina de roedores congelados, seguida de imunoblotting, revelou que transducin9,10, prende em 11,12, e recupera em 13 todos passam por redistribuição subcelular em resposta à luz. Acredita-se que a translocação leve dessas proteínas de sinalização chave não só regula a sensibilidade da cascata de fototransdução9,14,15, mas também pode ser neuroprotetora contra danos leves16,17,18. Como o transporte de proteínas leve em hastes parece ser muito significativo para a biologia celular e fisiologia, técnicas que permitem o isolamento de diferentes compartimentos subcelulares para determinar a distribuição de proteínas são ferramentas valiosas de pesquisa.
Atualmente, existem alguns métodos que visam isolar os compartimentos subcelulares da haste. No entanto, esses métodos podem ser longos e difíceis de reproduzir, ou requerem uma quantidade considerável de isolamento da retina. As preparações do segmento externo de rod (ROS) através da centrifugação gradiente de densidade19, por exemplo, é comumente usada para separar o ROS do homogeneato da retina. Este método é amplamente utilizado para a mancha ocidental, mas o procedimento é muito demorado e requer um mínimo de 8-12 retinas murinas20. Por outro lado, a secção tangencial serial da retina congelada de murina e rato foi implementada com sucesso na isolação do SO, IS, CB e ST9,11,13. No entanto, este método é tecnicamente desafiador devido à necessidade de achatar totalmente a pequena e altamente curvada retina murina para alinhar as camadas de retina antes da seção tangencial. Como há uma infinidade de modelos de camundongos e camundongos transgênicos recapitulando doenças do sistema visual, a criação de uma técnica que separa de forma confiável, rápida e fácil os compartimentos individuais de hastes é promissora na revelação dos processos fisiológicos que ocorrem em cada compartimento especializado e dos mecanismos que fundamentam os processos visuais em saúde e doença.
Para facilitar essas investigações, descrevemos dois métodos de descascamento que isolam compartimentos subcelulares de haste mais facilmente do que os protocolos atuais. O primeiro método de peeling, adaptado de uma técnica para expor células bipolares fluorescentes rotuladas para gravação de grampo de remendo21, emprega papel filtro de celulose para remover sequencialmente o ROS de uma retina murina viva e isolada (Figura 1). O segundo método, adaptado de um procedimento que isola as três camadas primárias das células da retina de uma retina de 22 e sapo, utiliza fita adesiva para remover o segmento interno de ROS e haste (RIS) de uma retina liofilizada (Figura 2). Ambos os procedimentos podem ser concluídos em 1h e são consideravelmente fáceis de usar. Fornecemos validação da eficácia desses dois protocolos de separação para a mancha ocidental utilizando retinas adaptadas à escuridão e expostas à luz de camundongos C57BL/6J para demonstrar translocação induzida pela luz de transduína de haste (GNAT1) e arrestin (ARR1). Além disso, usando o método de descascamento de fita, fornecemos evidências adicionais de que nossa técnica pode ser usada para examinar e abordar inconsistências entre dados de localização de proteínas adquiridos pela imunocitoquímica (ICC) e manchas ocidentais. Especificamente, nossa técnica mostrou que: 1) a isoforma proteína quinase C-alfa (PKCα) está presente não apenas em células bipolares, mas também em murine ROS e RIS, embora em baixas concentrações24,25, e 2) rhodopsin quinase (GRK1) está presente predominantemente na amostra isolada do SO. Esses dados demonstram a eficácia de nossas duas técnicas de descascamento para separar e quantificar proteínas específicas de vara e retina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% O2 tank</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X SDS Sample Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>70607-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 and 5% CO2 tank</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames&#8217; Medium with L-glutamine, without bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 (99%, dihydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite (Anhydrous calcium sulfate, &#62;98% CaSO4, &#62;2% CoCl2)</td>
			<td>WA Hammond Drierite Co LTD</td>
			<td>21005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm)</td>
			<td>Falcon-Corning</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Falcon-Corning</td>
			<td>08-772F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Scalpel (No. 10, 40 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100499-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Scalpel (No. 11, 40 mm)</td>
			<td>VWT</td>
			<td>100499-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (99%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes pellet pestle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>z359971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Fast-Freeze Flasks</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q/de-ionized water</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (powder)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4062-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (crystal)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Sx0420-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur EDTA</td>
			<td>EMD</td>
			<td>4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur HEPES, Free Acid</td>
			<td>EMD</td>
			<td>5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Wrap Aluminum Foil</td>
			<td>Reynolds Brands</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m)</td>
			<td>Scotch-3M</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D67501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrafuge mini centrifuge</td>
			<td>Labnet International, Inc</td>
			<td>C1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue incubation chamber (purchased or custom made)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4103-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Signma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 &#956;m)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28310-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 &#956;m)</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore transfer pipet, Global Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76285-362</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two peeling methods for the isolation of photoreceptor cell compartments in the mouse retina for protein analysis

Os fotorreceptores de rod são neurônios sensoriais altamente polarizados com compartimentos distintos. As hastes do mouse são longas (~80 μm) e finas (~2 μm) e são embaladas lateralmente na camada mais externa da retina, a camada fotorreceptora, resultando no alinhamento de compartimentos subcelulares análogos. Tradicionalmente, a seção tangencial da retina congelada montada plana tem sido usada para estudar o movimento e a localização de proteínas dentro de diferentes compartimentos de vara. No entanto, a alta curvatura da retina do rato dominante da haste torna a seção tangencial desafiadora. Motivados pelo estudo do transporte de proteínas entre compartimentos, desenvolvemos dois métodos de descascamento que isolam de forma confiável o segmento externo da haste (ROS) e outros compartimentos subcelulares para manchas ocidentais. Nossas técnicas relativamente rápidas e simples fornecem frações enriquecidas e subcelulares específicas para medir quantitativamente a distribuição e redistribuição de importantes proteínas fotorreceptoras em hastes normais. Além disso, essas técnicas de isolamento também podem ser facilmente adaptadas para isolar e investigar quantitativamente a composição proteica de outras camadas celulares dentro da retina saudável e degenerada.

As estratégias atuais foram desenvolvidas para fornecer métodos relativamente rápidos e simples para isolar e analisar proteínas entre compartimentos subcelulares específicos da haste para análise de manchas ocidentais. Aplicamos duas técnicas sequenciais de peeling (Figura 1 e Figura 2) seguidas de imunoblotting para demonstrar que esses métodos poderiam ser usados de forma confiável para detectar a distribuição conhecida de transdutina de haste (GNA...

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Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

Este protocolo apresenta duas técnicas para isolar os compartimentos subcelulares de fotorreceptores de haste murina para análise de proteínas. O primeiro método utiliza papel filtro de retina viva e celulose para separar segmentos externos da haste, enquanto o segundo emprega retina liofilizada e fita adesiva para descascar camadas internas e externas do segmento.

Dois métodos de descascamento para o isolamento de compartimentos celulares fotorreceptor na retina do rato para análise de proteínas

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

As duas técnicas de peeling demonstradas aqui isolam compartimentos subcelulares individuais da haste, e podem ajudar a revelar os importantes processos fisiológicos que ocorrem em cada compartimento especializado em hastes saudáveis e doentes. Isolar diferentes compartimentos de células de vara da retina do rato pode ser um desafio. Estas técnicas simples usam materiais de laboratório baratos e comuns para isolar de forma confiável compartimentos subcelulares de haste para análise de proteínas.Para começar, coloque um pedaço de papel filtro em uma placa de Petri cheia de tampão Ames HEPES borbulhado com 100% de oxigênio. Em seguida, usando uma pipeta de transferência de furo largo, transfira um retângulo de retina dissecado de um rato C57 Black 6J de dois a três meses de idade. Oriente a retina particionada côncave para cima e certifique-se de que os fotorreceptores estão voltados para baixo em direção ao fundo do prato.Em seguida, usando pinças, segure levemente os lados da retina pela metade e mova-a em cima do papel filtro. Uma vez centrada na retina, mova o papel do filtro para cima para que a retina pela metade toque no papel do filtro para criar o segmento externo da haste ou ROS para filtrar a adesão do papel. Levante cuidadosamente o papel do filtro com a retina anexada do tampão Ames HEPES.Coloque o lado inferior do papel do filtro sobre uma toalha de papel e dab duas a três vezes para secar. Adicione uma gota de Ames HEPES na lateral do papel filtro com a retina e coloque novamente o papel filtro sobre a toalha de papel para secar. Em seguida, coloque o papel filtro com a retina de volta na placa de Petri, e usando pinças, empurre suavemente todas as bordas da retina pela metade para cima e para longe do papel filtro em todos os lados.Descasque delicadamente a retina do papel filtro, tocando apenas o perímetro extremo da retina para preservar sua integridade estrutural. Em seguida, retire o papel filtro da placa de Petri e remova o excesso de líquido em uma toalha de papel, garantindo que o lado em contato com a retina não entre em contato com a toalha de papel. Coloque o papel filtro com a camada ROS parcial em um tubo rotulado no gelo e mantenha a retina descascada submersa no tampão Ames HEPES.Repita o processo de descascamento desta retina pela metade aproximadamente sete a oito vezes para remover toda a camada ROS. Após cada casca, coloque o papel filtro no mesmo tubo para combinar todos os ROS isolados de uma retina pela metade. Mantenha o tubo contendo todas as cascas de papel filtro da ROS isolada no gelo para uso imediato.Usando pinças, transfira a retina descascada para um tubo devidamente rotulado e mantenha o tubo no gelo para uso imediato. Para preparar a amostra de retina para liofilização, coloque um pedaço de papel filtro e transfira uma retina pela metade em uma placa de Petri cheia de tampão de Ringer frio. Em seguida, usando pinças, vire cuidadosamente a retina para que ela seja orientada côncave para cima e mova-a para descansar em cima do papel filtro.Levante o papel do filtro pelas bordas para cima para que o pedaço de retina pela metade toque no papel do filtro. Continue a tirar o papel do filtro da solução de Ringer. Em seguida, coloque o lado inferior do papel filtro sobre uma toalha de papel e cuidadosamente dab duas a três vezes para remover o excesso de líquido.Em seguida, pegue o papel filtro com pinças e adicione uma gota de ringer frio na lateral do papel filtro com a retina. Novamente, coloque o papel filtro sobre a toalha de papel para remover o excesso de líquido. Armazene cada amostra de papel de retina e filtro aderido em uma placa de Petri cheia de Ringer frio até estar pronto para congelar todas as amostras.Em seguida, usando pinças, retire cada amostra do tampão do Ringer frio, garantindo que as pinças entrem em contato apenas com as bordas do papel do filtro, evitando a retina pela metade. Coloque o lado inferior de cada papel filtro sobre uma toalha de papel para remover o excesso de líquido. Em seguida, adicione uma gota de PBS frio na lateral do papel filtro onde a retina é aderida e dab o papel filtro sobre a toalha de papel novamente.Coloque todos os pedaços de papel filtro na placa de Petri, e usando papel de tecido sem fiapos, afaste qualquer excesso de líquido ao redor do papel filtro. Em seguida, enrole firmemente toda a placa com papel alumínio e certifique-se de que as bordas da folha de alumínio sejam fixas e suavemente pressionadas no fundo da placa de Petri. Puna um punhado de furos de 0,1 a 0,2 milímetros na tampa da folha de alumínio.Em seguida, usando pinças metálicas, gradualmente reduza a placa de Petri coberta de papel alumínio em nitrogênio líquido. Mantenha as amostras em nitrogênio líquido até liofilizar. Para liofilização, coloque a placa de Petri coberta de papel alumínio em um frasco de secagem congelante e conecte-a à máquina de liofilizador seguindo o protocolo do fabricante.Lyophilize a retina por 30 minutos. Após a liofilização, colete a haste externa e interna do segmento, colocando cuidadosamente um pequeno pedaço de fita em cima da retina liofilizada e aplicando uma leve pressão com a pinça para garantir que ela se liga à camada fotorreceptora. Retire lentamente a fita e certifique-se de que tanto o ROS quanto o RIS tenham aderido à fita.Um filme branco e fino estará presente na superfície fraturada. Este é o RIS. Para separar este RIS, coloque outro pedaço de fita e empurre a fita para baixo na superfície fraturada.Em seguida, coloque o pedaço de fita com apenas a camada laranja-rosa em um tubo de microcentrifuuge rotulado como ROS, e pedaços de fita com a fina camada branca em outro tubo rotulado RIS. Em seguida, usando fita, colete o tecido remanescente da retina localizado no papel do filtro descascando a camada branca e grossa. Em seguida, coloque este isolado em um tubo rotulado OIS.Se usar no mesmo dia, armazene as camadas isoladas da retina liofilizada à temperatura ambiente. Em animais adaptados ao escuro, a distribuição de GNAT1 e ARR1 coincidiu com suas distribuições conhecidas de estado escuro, onde o sinal GNAT1 era visivelmente mais forte no isolamento ROS, e o sinal ARR1 era mais robusto no isolamento ros. A quantificação dos sinais GNAT1 e ARR1 mostrou diferenças significativas entre as condições de luz escura para GNAT1 e ARR1 em amostras ROS e ROS.Em amostras escuras e claras, g beat 5S, citocromo C e sinais de actina são excluídos das amostras ROS, demonstrando ausência de contaminação de outras camadas celulares. Além disso, o sinal beta 5L G era claramente visível nas amostras ROS. A microscopia eletrônica de varredura das superfícies da retina linofilizada intacta e descascada mostrou que, antes de descascar com fita adesiva, a superfície da retina liofilizada intacta correspondia intimamente à ros cilíndrica característica.Após a casca da fita inicial, o ROS e o RIS pareciam ser totalmente removidos, como evidenciado pela camada nuclear uniforme presente na superfície da retina remanescente, descascada e liofilizada. As cascas de fita subsequentes removeram ris da superfície livre da camada descascada. Esta técnica também demonstrou que a imunoreatividade GRK1 foi mais intensa em amostras de ROS em retinas expostas à luz, e ausente em amostras de OIS.Por outro lado, amostras de ROS e RIS apresentaram um sinal fraco para pkc alfa, que é comumente não detectado em ROS ou RIS por coloração de imunofluorescência. Finalmente, o peeling de fita subótimal pode produzir amostras ligeiramente contaminadas. A amostra ris foi contaminada com alguma amostra de OIS, produzindo ambas as bandas G beta 5L e G beta 5S, e um sinal alfa PKC mais alto.Deve-se tomar cuidado ao liofilizar a retina. Se uma técnica de liofilização inadequada for usada, a retina pode derreter, tornando impossível isolar diferentes camadas subcelulares de haste por fita. O uso deste método de descascamento de fita em conjunto com o qRT-PCR permitiu a separação de transcrições fotorreceptoras do resto da retina.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Neurociência

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Adult Neurogenesis

Os métodos para a modulação e Análise de NF-kB-dependente Adulto Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratome Seccionamento Rato Retina de Preparar culturas Fotorreceptoras

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Métodos de medidas de capacitância ligado por células em Rato Adrenal Cromafim celular

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imagem Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics nos terminais Cone fotorreceptores Axon do mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Onde cortar matérias: Uma dissecção e análise de guia para a orientação espacial da Retina do rato de Marcos Ocular

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...