Name: two peeling methods for the isolation of photoreceptor cell compartments in the mouse retina for protein analysis
Uploaded: 2021-12-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами NIH EY12155, EY027193 и EY027387 для JC. Мы благодарны доктору Спиридону Михалакису (Калтех, Пасадена, США) и Натали Чен (USC, Лос-Анджелес, США) за корректуру рукописи. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Сета Раффинса (USC, Лос-Анджелес, США) и д-ра Яноша Пети-Петерди (USC, Лос-Анджелес, США) за предоставление необходимого оборудования для сбора предоставленных автором отснятого материала. Материал из: Kasey Rose et al, Разделение компартментов фоторецепторных клеток в сетчатке мыши для анализа белка, Молекулярная нейродегенерация, опубликовано [2017], [Springer Nature].

Все эксперименты проводились в соответствии с местными институциональными руководящими принципами комитета по уходу за животными из Университета Южной Калифорнии (USC).
1. Метод пилинга сетчатки живыми клетками
<ol><li>Приготовление буферов Эймса, пилинг бумаги и ...

<ol>
	<li>Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+proteins+and+phototransduction.">G proteins and phototransduction.</a> Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).</li><li>Molday, R. S., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptors+at+a+glance.">Photoreceptors at a glance.</a> Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).</li><li>Koch, K. W., Dell'Orco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+signaling+networks+in+vertebrate+photoreceptor+cells.">Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).</li><li>Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+light+intensity+threshold+for+retinal+damage+in+albino+rats+raised+under+6+lx.">Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx.</a> Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).</li><li>Brann, M. R., Cohen, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+expression+of+transducin+mRNA+and+translocation+of+transducin+in+rods+of+rat+retina.">Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina.</a> Science. 235 (4788), 585-587 (1987).</li><li>Philp, N. J., Chang, W., Long, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-stimulated+protein+movement+in+rod+photoreceptor+cells+of+the+rat+retina.">Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina.</a> FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).</li><li>Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+induced+shift+and+binding+of+S-antigen+in+retinal+rods.">Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods.</a> Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).</li><li>Roof, D. J., Heth, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transducin+in+retinal+rod+photoreceptor+outer+segments.">Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments.</a> Science. 241 (4867), 845-847 (1988).</li><li>Sokolov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+light-driven+translocation+of+transducin+between+the+two+major+compartments+of+rod+cells:+a+novel+mechanism+of+light+adaptation.">Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation.</a> Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).</li><li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex.">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li><li>Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+translocation+is+induced+at+a+critical+threshold+of+visual+signaling+and+is+superstoichiometric+to+bleached+rhodopsin.">Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).</li><li>Nair, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+redistribution+of+arrestin+in+vertebrate+rods+is+an+energy-independent+process+governed+by+protein-protein+interactions.">Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions.</a> Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).</li><li>Strissel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recoverin+undergoes+light-dependent+intracellular+translocation+in+rod+photoreceptors.">Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).</li><li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors.">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).</li><li>Majumder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducin+translocation+contributes+to+rod+survival+and+enhances+synaptic+transmission+from+rods+to+rod+bipolar+cells.">Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).</li><li>Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+photoreceptors+die+(and+why+they+don't).">Why photoreceptors die (and why they don't).</a> BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).</li><li>Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+to+light+damage+in+an+arrestin+knockout+mouse+model+of+Oguchi+disease+(stationary+night+blindness).">Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness).</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin-1+expression+level+in+rods:+balancing+functional+performance+and+photoreceptor+health.">Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health.</a> Neuroscience. 174, 37-49 (2011).</li><li>McConnell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+retinal+outer+segment+fragments.">The isolation of retinal outer segment fragments.</a> The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).</li><li>Tsang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+target+enzyme+in+deactivation+of+photoreceptor+G+protein+in+vivo.">Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo.</a> Science. 282 (5386), 117-121 (1998).</li><li>Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recordings+of+retinal+bipolar+cells+in+response+to+extracellular+electrical+stimulation+in+wholemount+mouse+retina.">Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).</li><li>Guido, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+obtain+retinal+cell+preparations+highly+enriched+in+specific+cell+types.+Suitability+for+lipid+metabolism+studies.">A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies.</a> Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).</li><li>Hayashi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+by+cyclin-dependent+protein+kinase+5+of+the+regulatory+subunit+of+retinal+cGMP+phosphodiesterase.+II.+Its+role+in+the+turnoff+of+phosphodiesterase+in+vivo.">Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).</li><li>Wolbring, G., Cook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+purification+and+characterization+of+protein+kinase+C+from+bovine+retinal+rod+outer+segments.">Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments.</a> European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).</li><li>Williams, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein+kinase+C+in+photoreceptor+outer+segments.">Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments.</a> Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).</li><li>Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+form+of+the+G+protein+beta+subunit+Gbeta5+is+specifically+expressed+in+the+vertebrate+retina.">A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).</li><li>Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GTPase+activating+factor+for+transducin+in+rod+photoreceptors+is+the+complex+between+RGS9+and+type+5+G+protein+beta+subunit.">The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).</li><li>Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+rhodopsin/arrestin+complex+leads+to+retinal+degeneration+in+a+transgenic+mouse+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.">Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).</li><li>Chen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+photoresponses+and+light-induced+apoptosis+in+rods+lacking+rhodopsin+kinase.">Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mistrafficking+of+prenylated+proteins+causes+retinitis+pigmentosa+2.">Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2.</a> FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).</li><li>Weiss, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+differences+in+expression+of+G-protein-coupled+receptor+kinase+(GRK)+7+and+GRK1+in+mammalian+cone+photoreceptor+cells:+implications+for+cone+cell+phototransduction.">Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction.</a> The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).</li><li>Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+forms+of+human+rhodopsin+kinase+(GRK1).">Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1).</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).</li><li>Newton, A. C., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+protein+kinase+C+in+the+phosphorylation+of+rhodopsin.">Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).</li><li>Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+protein+kinase+C+isoforms+are+required+for+rod+photoreceptor+differentiation.">Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).</li><li>Sokal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+kinase+C+isozymes+responsible+for+the+phosphorylation+of+photoreceptor-specific+RGS9-1+at+Ser475.">Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).</li><li>Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+photoreceptor+cell+compartments+in+mouse+retina+for+protein+analysis.">Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).</li><li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+degeneration:+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait.">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li></ol>

Многие заболевания сетчатки поражают палочковые фоторецепторные клетки, приводя к гибели палочки и, в конечном счете, полной потере зрения37. Значительная часть генетического и механистического происхождения дегенерации сетчатки человека была успешно воспроизведена в м?...

Палочковые фоторецепторные клетки, плотно упакованные в самый внешний слой нервной сетчатки, являются неотъемлемой частью зрения тусклого света. Чтобы функционировать как верные счетчики фотонов, палочки используют сигнальный путь на основе G-белка, называемый фототрансдукцией, для генерации быстрых, усиленных и воспроизводимых реакций на захват одного фотона. Эта реакция на свет в конечном итоге вызывает изменение тока на плазматической мембране и впоследствии сигнализируется остальной части зрительной системы1. Как следует из названия, каждая палочковая клетка имеет отличную палочковидную форму и демонстрирует высокополяризованную клеточную морфологию, состоящую из внешнего сегмента (OS), внутреннего сегмента (IS), тела клетки (CB) и синаптической терминали (ST). Каждый субклеточный компартмент имеет специфический белковый механизм (связанный с мембраной и растворимый), биомолекулярные особенности и белковые комплексы, которые играют решающую роль, такие как визуальная фототрансдукция, общее ведение хозяйства и синтез белка, а также синаптическая передача2,3.
Более 30 лет назад впервые наблюдалось светозависимое реципрокное движение субклеточных белков, в частности трансдуцина (от ОС) и арестина (к ОС), 4,5,6,7. Вначале это наблюдаемое явление было воспринято скептически, отчасти из-за уязвимости иммуногистохимии к эпитопной маскировке8. В начале 2000-х годов транслокация белка, зависящая от стимула, была подтверждена с помощью строгой и трудной техники физического сечения9. Последовательное тангенциальное сечение замороженной плоской сетчатки грызунов с последующим иммуноблоттингом показало, что трансдуцин9,10, арестин11,12 и восстановление13 подвергаются субклеточному перераспределению в ответ на свет. Считается, что световая транслокация этих ключевых сигнальных белков не только регулирует чувствительность каскада фототрансдукции9,14,15, но также может быть нейропротекторной против повреждения светом16,17,18. Поскольку легкий транспорт белка в палочках, по-видимому, очень важен для биологии и физиологии стержневых клеток, методы, которые позволяют выделять различные субклеточные компартменты для определения распределения белка, являются ценными инструментами исследования.
В настоящее время существует несколько методов, направленных на изоляцию стержневых субклеточных компартментов. Однако эти методы могут быть длительными и трудными для воспроизведения или требуют значительного количества изолята сетчатки. Например, препараты внешнего сегмента стержня (АФК) посредством центрифугирования градиента плотности19 обычно используются для отделения АФК от гомогената сетчатки. Этот метод широко используется для вестерн-блоттинга, но процедура очень трудоемкая и требует минимум 8-12 мышиных сетчаток20. С другой стороны, последовательное тангенциальное сечение замороженных мышей и сетчатки крыс было успешно реализовано в изоляции OS, IS, CB и ST9,11,13. Однако этот метод является технически сложным из-за необходимости полного сглаживания маленькой и сильно изогнутой мышиной сетчатки для выравнивания слоев сетчатки перед тангенциальным сечением. Поскольку существует множество мышиных моделей и трансгенных мышей, повторяющих заболевания зрительной системы, создание техники, которая надежно, быстро и легко разделяет отдельные стержневые отсеки, имеет перспективы в выявлении физиологических процессов, которые происходят в каждом специализированном отсеке, и механизмов, лежащих в основе зрительных процессов в здоровье и болезни.
Чтобы облегчить эти исследования, мы описываем два метода пилинга, которые изолируют стержневые субклеточные компартменты легче, чем современные протоколы. Первый метод пилинга, адаптированный из метода воздействия флуоресцентно меченых биполярных клеток для записи зажима пластыря21, использует целлюлозную фильтровальную бумагу для последовательного удаления АФК из живой, изолированной мышиной сетчатки (рисунок 1). Второй метод, адаптированный из процедуры, которая изолирует три первичных слоя клеток сетчатки от сетчатки chick22 и frog23, использует клейкую ленту для удаления внутреннего сегмента АФК и палочки (РИС) из лиофилизированной сетчатки (рисунок 2). Обе процедуры могут быть выполнены за 1 час и значительно удобны для пользователя. Мы обеспечиваем проверку эффективности этих двух протоколов разделения для вестерн-блоттинга путем использования адаптированной к темноте и подверженной воздействию света сетчатки от мышей C57BL / 6J для демонстрации светоиндуцированной транслокации стержневого трансдуцина (GNAT1) и арестина (ARR1). Кроме того, используя метод ленточного пилинга, мы предоставляем дополнительные доказательства того, что наша методика может быть использована для изучения и устранения несоответствий между данными локализации белка, полученными иммуноцитохимией (ICC), и западными пятнами. В частности, наша методика показала, что: 1) изоформа протеинкиназы С-альфа (PKCα) присутствует не только в биполярных клетках, но и в мышиных АФК и РИС, хотя и в низких концентрациях24,25, и 2) родопсинкиназа (GRK1) присутствует преимущественно в изолированном образце ОС. Эти данные демонстрируют эффективность наших двух методов пилинга для разделения и количественной оценки конкретных стержневых и сетчаточных белков.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% O2 tank</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X SDS Sample Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>70607-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 and 5% CO2 tank</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames&#8217; Medium with L-glutamine, without bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 (99%, dihydrate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite (Anhydrous calcium sulfate, &#62;98% CaSO4, &#62;2% CoCl2)</td>
			<td>WA Hammond Drierite Co LTD</td>
			<td>21005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm)</td>
			<td>Falcon-Corning</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Falcon-Corning</td>
			<td>08-772F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Scalpel (No. 10, 40 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100499-578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Scalpel (No. 11, 40 mm)</td>
			<td>VWT</td>
			<td>100499-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (99%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes pellet pestle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>z359971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Fast-Freeze Flasks</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q/de-ionized water</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (powder)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4062-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (crystal)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Sx0420-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur EDTA</td>
			<td>EMD</td>
			<td>4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur HEPES, Free Acid</td>
			<td>EMD</td>
			<td>5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reynolds Wrap Aluminum Foil</td>
			<td>Reynolds Brands</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m)</td>
			<td>Scotch-3M</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D67501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrafuge mini centrifuge</td>
			<td>Labnet International, Inc</td>
			<td>C1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue incubation chamber (purchased or custom made)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>4103-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Signma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine</td>
			<td>SP Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 &#956;m)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28310-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 &#956;m)</td>
			<td>Whatman/GE Healthcare</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore transfer pipet, Global Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76285-362</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two peeling methods for the isolation of photoreceptor cell compartments in the mouse retina for protein analysis

Палочковые фоторецепторы представляют собой высокополяризованные сенсорные нейроны с отчетливыми отсеками. Мышиные стержни длинные (~80 мкм) и тонкие (~2 мкм) и сбоку упакованы в самый внешний слой сетчатки, слой фоторецепторов, что приводит к выравниванию аналогичных субклеточных компартментов. Традиционно тангенциальное сечение замороженной плоской сетчатки использовалось для изучения движения и локализации белков в разных стержневых отсеках. Однако высокая кривизна стержневой доминантной сетчатки мыши затрудняет тангенциальное сечение. Мотивированные изучением транспорта белка между компартментами, мы разработали два метода пилинга, которые надежно изолируют стержневой внешний сегмент (АФК) и другие субклеточные компартменты для вестерн-блотов. Наши относительно быстрые и простые методы обеспечивают обогащенные и субклеточные специфические фракции для количественного измерения распределения и перераспределения важных белков фоторецепторов в нормальных палочках. Кроме того, эти методы изоляции также могут быть легко адаптированы для выделения и количественного исследования белкового состава других клеточных слоев как в здоровых, так и в дегенеративных сетчатках.

Настоящие стратегии были разработаны для обеспечения относительно быстрых и простых методов выделения и анализа белков среди специфических стержневых субклеточных компартментов для анализа вестерн-блоттинга. Мы применили два метода последовательного пилинга (рисунок 1</s...

Watch this Scientific Journal Video about Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis at JoVE.com

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

В этом протоколе представлены два метода выделения субклеточных компартментов фоторецепторов мышечных стержней для анализа белка. Первый способ использует живую сетчатку и целлюлозную фильтровальную бумагу для разделения наружных сегментов стержня, в то время как второй использует лиофилизированные сетчатки и клейкую ленту для удаления слоев внутреннего и наружного сегментов стержня.

Два метода пилинга для выделения компартментов фоторецепторных клеток в сетчатке мыши для анализа белка

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

Два метода пилинга, продемонстрированные здесь, изолируют отдельные стержневые субклеточные компартменты и могут помочь выявить важные физиологические процессы, происходящие в каждом специализированном отделении в здоровых и больных стержнях. Выделение различных стержневых клеточных отсеков сетчатки мыши может быть сложной задачей. Эти простые методы используют недорогие и обычные лабораторные материалы для надежного выделения стержневых субклеточных компартментов для анализа белка.Для начала поместите лист фильтровальной бумаги в чашку Петри, наполненную буфером Ames HEPES, наполненным 100% кислородом. Затем, используя широкодисперсную передаточную пипетку, перенесите один прямоугольник сетчатки, рассеченный от двух-трехмесячной мыши C57 Black 6J. Ориентируйте разделенную сетчатку вверх и убедитесь, что фоторецепторы обращены вниз к нижней части чашки.Затем, используя пинцет, слегка обхватите боковые стороны половинчатой сетчатки и переместите ее поверх фильтровальной бумаги. Как только сетчатка будет центрирована, переместите фильтровальную бумагу вверх, чтобы разрезанная пополам сетчатка коснулась фильтровальной бумаги, чтобы создать внешний сегмент стержня, или ROS для адгезии фильтрующей бумаги. Осторожно поднимите фильтровальную бумагу с прикрепленной сетчаткой из буфера Ames HEPES.Положите нижнюю сторону фильтровальной бумаги на бумажное полотенце и два-три раза смажьте для высыхания. Добавьте каплю Ames HEPES на боковую часть фильтровальной бумаги с сетчаткой и снова поместите фильтровальную бумагу на бумажное полотенце для высыхания. Затем поместите фильтровальную бумагу с сетчаткой обратно в чашку Петри и, используя пинцет, осторожно оттолкните все края половинчатой сетчатки вверх и подальше от фильтровальной бумаги со всех сторон.Деликатно отсоедините сетчатку от фильтровальной бумаги, коснувшись только крайнего периметра сетчатки, чтобы сохранить ее структурную целостность. Затем поднимите фильтровальную бумагу из чашки Петри и удалите лишнюю жидкость на бумажном полотенце, убедившись, что сторона, контактирующая с сетчаткой, не контактирует с бумажным полотенцем. Поместите фильтровальную бумагу с частичным слоем ROS в меченую трубку на льду и держите очищенную сетчатку погруженной в буфер Ames HEPES.Повторите процесс пилинга для этой половинчатой сетчатки примерно семь-восемь раз, чтобы удалить весь слой АФК. После каждого пилинга поместите фильтровальную бумагу в одну и ту же трубку, чтобы объединить все АФК, выделенные из одной половинки сетчатки. Держите трубку, содержащую все кожуры фильтровальной бумаги изолированного АФК, на льду для немедленного использования.Используя пинцет, перенесите оставшуюся очищенную сетчатку в соответствующим образом маркированную трубку и держите трубку на льду для немедленного использования. Чтобы подготовить образец сетчатки к лиофилизации, поместите лист фильтровальной бумаги и переложите половинчатую сетчатку в чашку Петри, наполненную холодным буфером Рингера. Далее, используя пинцет, осторожно переверните сетчатку так, чтобы она была ориентирована вогнутой вверх и переместите ее, чтобы она опиралась поверх фильтровальной бумаги.Поднимите фильтровальную бумагу по краям вверх, чтобы разрезанный пополам кусок сетчатки коснулся фильтровальной бумаги. Продолжайте поднимать фильтровальную бумагу из раствора Рингера. Затем поместите нижнюю сторону фильтровальной бумаги на бумажное полотенце и тщательно смажьте два-три раза, чтобы удалить лишнюю жидкость.Далее возьмите фильтровальную бумагу пинцетом и добавьте каплю холодного Ringer's на бок фильтровальной бумаги с сетчаткой. Опять же, поместите фильтровальную бумагу на бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость. Храните каждый прилипший образец сетчатки и фильтровальной бумаги в чашке Петри, наполненной холодными образцами Рингера, пока они не будут готовы заморозить все образцы.Затем, используя пинцет, поднимите каждый образец из буфера холодного рингера, убедившись, что пинцет контактирует только с краями фильтрующей бумаги, избегая половинки сетчатки. Поместите нижнюю сторону каждой фильтровальной бумаги на бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость. Затем добавьте каплю холодного PBS на сторону фильтровальной бумаги, где приклеивается сетчатка, и снова нанесите фильтровальную бумагу на бумажное полотенце.Поместите все кусочки фильтровальной бумаги в чашку Петри и, используя безворсовую папиросную бумагу, удалите лишнюю жидкость, окружающую фильтровальную бумагу. Затем плотно оберните всю посуду алюминиевой фольгой и убедитесь, что края алюминиевой фольги закреплены и плавно вдавлены в дно чашки Петри. Проколите несколько отверстий от 0,1 до 0,2 миллиметра в крышке из алюминиевой фольги.Затем, используя металлические щипцы, постепенно опустите покрытую алюминиевой фольгой чашку Петри в жидкий азот. Храните образцы в жидком азоте до готовности к лиофилизации. Для лиофилизации поместите покрытую алюминиевой фольгой чашку Петри в флягу для сублимационной сушки и прикрепите ее к лиофилизирующей машине в соответствии с протоколом производителя.Лиофилизируйте сетчатку в течение 30 минут. После лиофилизации соберите стержень наружного и внутреннего сегмента, аккуратно положив небольшой кусочек ленты поверх лиофилизированной сетчатки и приложив небольшое давление пинцетом, чтобы убедиться, что он связывается с фоторецепторным слоем. Медленно снимите ленту и убедитесь, что ROS и RIS прилипли к ленте.Тонкая белая пленка будет присутствовать на трещиноватой поверхности. Это РИС. Чтобы отделить эту РИС, поместите еще один кусок ленты и надавите лентой вниз на трещиноватую поверхность.Затем поместите кусок ленты только с оранжево-розовым слоем в микроцентрифужную трубку, помеченную как ROS, и кусочки ленты с тонким белым слоем в другую трубку с маркировкой RIS. Затем, используя ленту, соберите оставшуюся ткань сетчатки, расположенную на фильтровальной бумаге, отклеив толстый белый слой. Затем поместите этот изолят в трубку с маркировкой OIS.При использовании в тот же день храните изолированные слои от лиофилизированной сетчатки при комнатной температуре. У животных, адаптированных к темноте, распределение GNAT1 и ARR1 близко соответствовало их известным распределениям в темном состоянии, где сигнал GNAT1 был заметно сильнее в изоляции ROS, а сигнал ARR1 был более надежным в изоляции ROS. Количественная оценка сигналов GNAT1 и ARR1 показала значительные различия между условиями темного света для GNAT1 и ARR1 в образцах ROS и ROS.Как в темных, так и в светоадаптированных образцах сигналы G beat 5S, цитохром C и актин исключены из образцов ROS, демонстрируя отсутствие загрязнения из других клеточных слоев. Кроме того, сигнал G beta 5L был хорошо виден в образцах ROS. Сканирующая электронная микроскопия поверхностей интактной и шелушащейся лиофилизированной сетчатки показала, что перед отслаиванием клейкой лентой поверхность интактной лиофилизированной сетчатки близко соответствовала характерной цилиндрической АФК.После первоначального лущения ленты АФК и РИС, по-видимому, были полностью удалены, о чем свидетельствует однородный ядерный слой, присутствующий на поверхности оставшейся, очищенной, лиофилизированной сетчатки. Последующие ленточные пилинги удаляют РИС со свободной поверхности отслаивающегося слоя. Этот метод также продемонстрировал, что иммунореактивность GRK1 была наиболее интенсивной в образцах АФК в сетчатке, подвергшихся воздействию света, и отсутствовала в образцах OIS.И наоборот, образцы АФК и РИС показали слабый сигнал для PKC альфа, который обычно не обнаруживается в АФК или РИС путем иммунофлуоресцентного окрашивания. Наконец, неоптимальное лущение ленты может привести к слегка загрязненным образцам. Образец RIS был загрязнен некоторым образцом OIS, продуцирующим как G beta 5L, так и G бета 5S диапазоны, а также более высокий альфа-сигнал PKC.Необходимо соблюдать осторожность при лиофилизации сетчатки. Если используется неправильная техника лиофилизации, сетчатка может расплавиться, что делает невозможным выделение различных палочковых субклеточных слоев лентой. Использование этого метода лущения ленты в сочетании с qRT-PCR позволило отделить транскрипты фоторецепторов от остальной части сетчатки.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

В естественных условиях Электропорация развивающихся Мышь Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÃƒÅ½Ã‚ÂºB-dependent Adult Neurogenesis

Методы модуляции и анализа NF-kB-зависимой нейрогенез

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Один мышь, двух культур: Выделение и культивирование взрослых нервных стволовых клеток из двух Нейрогенные зон отдельных мышей

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Оценка сосудистой регенерации в ЦНС Использование мыши Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratome секционирования мыши Retina Подготовка фоторецептора культур

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Методы клеточной прилагается измерения емкости в мышь надпочечников хромаффинных Cell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Са изображений<sup&gt; 2+</sup&gt; Динамика колбочек аксонов мыши Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Углубленный Физиологический анализ клеточных популяций Defined при остром Tissue Ломтики Мыши вомероназальные органа

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Где вы режете вопросы: Рассечение и анализа руководство для пространственной ориентации мыши сетчатки от глазной достопримечательности

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

В естественных условиях Двух фотонных изображений корковых нейронов в новорожденных мышей

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...