Name: real-time monitoring of mitochondrial respiration in cytokine-differentiated human primary t cells
Uploaded: 2021-10-19T14:00:00
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Kasper Mølgaard和Anne Rahbech获得了Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat的资助。Kasper Mølgaardals还获得了Børnecancerfonden的资助。

实验是在Herlev医院和丹麦首都地区的指导下进行的。
注意：此实验方案包含优化运行和检测运行的说明。当指令用于优化运行或检测运行时，它清楚地写在文本中。先运行优化运行，然后再继续检测运行
1. 人外周血单核（PBMC）从黄褐色皮毛中分离
<ol><li>PBMC 隔离<ol>
<li>从适当的机构收集buffy外套（收集在采血袋中）。巴菲外套来自健康的捐...

<ol>
	<li>vander Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+capacity+is+a+critical+regulator+of+CD8++T+cell+memory+development.">Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development.</a> Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).</li><li>Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+takes+a+breath--new+quantitative+perspectives+on+bioenergetics+and+signal+transduction.">Signaling takes a breath--new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction.</a> Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).</li><li>vander Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+memory+T+cells+have+a+bioenergetic+advantage+that+underlies+their+rapid+recall+ability.">CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).</li><li>Chang, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+control+of+T+cell+effector+function+by+aerobic+glycolysis.">Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis.</a> Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).</li><li>vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bioenergetics+in+T+cells+using+a+Seahorse+extracellular+flux+analyzer.">Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer.</a> Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).</li><li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li><li>Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+T-cell+reconditioning:+Improving+metabolic+fitness+for+optimal+cancer+immunotherapy.">Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Kenwood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane.">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).</li><li>Alizadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL15+enhances+CAR-T+cell+antitumor+activity+by+reducing+mTORC1+activity+and+preserving+their+stem+cell+memory+phenotype.">IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype.</a> Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).</li></ol>

在描述T细胞的能量状态时，氧化磷酸化的详细和正确的定量是不可或缺的工具。线粒体适应状态可能与 T 细胞活化电位、存活和分化直接相关1，5。使用该协议，可以确定氧化磷酸化的各种性质（详见 表4 ）。精确定量氧化磷酸化的这些特性可以详细了解T细胞的能量状态。但是，为了获得可靠的结果，在设置实验时必须非常小心。 
<p cl...

正确的T细胞发育和功能对于免疫系统识别和响应抗原的能力至关重要。线粒体氧化磷酸化（OxPhos）根据T细胞的状态而变化。幼稚T细胞主要使用OxPhos产生ATP，而活化的T细胞经历代谢转变，其中糖酵解成为主导1。在效应阶段之后，记忆T细胞的一小部分剩余子集恢复到由OxPhos2，3主导的代谢状态。OxPhos的变化跟随T细胞的分化到这样的程度，甚至T细胞的亚群也可以通过其特异性OxPhos特性来分化1。相反，OxPhos对T细胞的功能很重要，并且已经证明对OxPhos的抑制可以阻断T细胞的增殖和细胞因子产生4。因此，以精确和可重复的方式量化T细胞OxPhos特性的能力对于任何使用T细胞的人来说都是一个强大的工具。
在该协议中，使用细胞外通量分析仪测量T细胞OxPhos的性质。该分析仪的核心功能是连续测量待分析细胞生长培养基的氧含量。从生长培养基中除去的氧气被细胞吸收。通过用各种OxPhos抑制剂或修饰剂处理细胞，摄氧量的下降与抑制或调节的功能有关。例如，抑制ATP合酶将导致细胞对氧气的摄取减少，否则这些摄取将用于通过氧化磷酸化产生ATP。其他设备，包括Clark电极和Oroboros仪器，提供类似的功能，每种仪器都有不同的优点和缺点。多种细胞类型可用于这些设备的研究，但一种特别具有挑战性的细胞类型是人类原发性T淋巴细胞5。由于它们的体积小， 离体存活率差，并且不粘附特性，人类原代T细胞的研究可能具有挑战性。
这是通过细胞外分析仪研究人类原代T细胞线粒体呼吸的方案。该协议分为优化运行，其中确定每孔细胞数的最佳浓度以及寡霉素和FCCP的最佳浓度。此外，使用优化条件的测定运行。
使用血源性人 PBMC 和 离体 原代 T 细胞培养物，该协议证明了最佳抑制剂浓度的重要性，以及在处理敏感细胞类型时使用单独而不是顺序注射线粒体抑制剂的相关性。最后，证明该测定可以稳健地检测细胞因子IL-2和IL-15极化时线粒体呼吸的细微差异。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD3xCD28 beads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>For coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Heat inactivated at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>O4876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco-Thermo Fisher</td>
			<td>61870036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M glucose solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100 mM pytuvate solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200 mM glutamine solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF RPMI medium, pH7.4</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103576-100</td>
			<td>XF RPMI media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyser</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 cell culture microplates</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>XF cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 sensor cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2770-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02-060F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Flux analyzer software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time monitoring of mitochondrial respiration in cytokine-differentiated human primary t cells

在激活过程中，T细胞的新陈代谢适应影响其命运的变化。线粒体氧化磷酸化的增加对于T细胞活化是必不可少的，而记忆T细胞的存活取决于线粒体重塑。因此，这会影响癌症免疫疗法的长期临床结果。T细胞质量的变化通常通过使用众所周知的表面标志物的流式细胞术进行研究，而不是直接通过其代谢状态进行研究。这是一种优化的方案，用于使用细胞外通量分析仪和细胞因子IL-2和IL-15测量原代人T细胞的实时线粒体呼吸，它们对T细胞代谢的影响不同。结果表明，通过测量抑制代谢途径中关键复合物时的耗氧量可以清楚地区分T细胞的代谢状态，并且这些测量的准确性高度依赖于最佳抑制剂浓度和抑制剂注射策略。这种标准化方案将有助于实施线粒体呼吸作为监测和研究癌症免疫疗法中T细胞适应性的标准。

正确测定OxPhos特性是研究T细胞时不可或缺的工具。但是，如果检测条件尚未优化，则存在误导性或错误结果的很大风险。在该协议中，非常注重每孔细胞数的优化以及要使用的寡霉素和FCCP的浓度。在所述设置中，将寡霉素和FCCP增量添加到同一孔中，增加线粒体调节剂的浓度。寡霉素和FCCP的最佳浓度可以从得到的孔的OCR曲线中确定为达到平台的浓度。
在代表性运行中，寡霉?...

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Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells

代谢适应是 T 细胞的基础，因为它决定了分化、持久性和细胞毒性。本文介绍了一种用于监测 离体 细胞因子分化的人原代T细胞中线粒体呼吸的优化方案。

实时监测细胞因子分化人原代T细胞中的线粒体呼吸

During activation, the metabolism of T cells adapts to changes that impact their fate. An increase in mitochondrial oxidative phosphorylation is ...

线粒体代谢是T细胞耐久性和记忆力的重要调节剂。因此，测量线粒体呼吸可以对T细胞的性质提供重要的见解。海马机可以实时测量活人原发性T淋巴细胞中线粒体呼吸的各种元素，而无需任何标记。该方法非常适合监测T细胞的适应性和记忆潜力，是癌症免疫治疗成功的重要预测因素。首先，通过将每百万个细胞中12.5微升微粒转移到微量离心管中，并在管中每12.5微升微升珠子中加入12.5微升PBS来洗涤CD3 / CD28微珠。然后，将微量离心管放在合适的磁铁上一分钟，丢弃缓冲液，并将微珠重悬于原始体积的T细胞培养基中。接下来，以1至2个微珠与细胞的比例每百万个细胞加入12.5微升的微珠，并将细胞分成两个条件，每个条件中约有500万个细胞。然后，将正确体积的细胞因子添加到每种条件下，并将细胞转移到多孔板中。将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育三天。孵育三天后，制备具有双倍浓度细胞因子的新鲜T细胞培养基。通过将每个孔的一半体积转移到新孔中来重悬并分裂细胞。然后，向每个孔中加入相同体积的新鲜制备的T细胞培养基。对于细胞外通量测定，制备含有碳酸氢钠，Cell-Tak和氢氧化钠的包衣溶液。然后，打开新鲜的XF细胞培养板，并向每个孔中加入12微升新鲜制备的包衣溶液，确保包衣溶液均匀分布在所有孔的底部。将板在室温下孵育，盖上盖子30分钟。然后，丢弃所有孔中剩余的液体溶液。用200微升无菌水清洗板，并丢弃液体。接下来，用200微升细胞培养级无菌PBS洗涤板。丢弃液体后，让板在室温下干燥30分钟。为了将T细胞接种在XF细胞培养板中，根据实验设置将合适的XF RPMI培养基与葡萄糖，丙酮酸和谷氨酰胺混合来制备50毫升测定培养基。在非二氧化碳调节的培养箱中将制备的培养基加热至37摄氏度，并将pH值设置为7.4。确保有足够的培养基用于种植细胞和制备寡霉素和FCCP溶液。接下来，设计一个板布局，每个孔的细胞数量增加，用于优化或分析运行。使用四个充满培养基并注入培养基的孔进行背景测量。在计数先前制备的T细胞后，根据板布局将适当数量的细胞移液到先前包衣的XF细胞培养板的每个孔中。要将T细胞粘附到涂覆的表面上，离心XF细胞培养板。然后，用200微升测定培养基洗涤细胞。丢弃培养基，并加入180微升新鲜测定培养基。在确保细胞附着并均匀分布在孔表面后，将XF细胞培养板在非二氧化碳调节的加热柜中以37摄氏度孵育30分钟。对于优化运行，在测定培养基中制备寡霉素和FCCP的工作溶液。然后，将寡霉素或FCCP的工作溶液加载到传感器墨盒的注射口中。确保没有注入口只包含空气。用测定培养基填充所有空端口。然后，通过轻轻敲击桌子上板的边缘来去除注射口中的潜在气泡。对于测定运行，制备20微摩尔抗霉素A溶液。然后，根据板布局，将20微升寡霉素或FCCP加载到传感器墨盒的注射端口A中，并向所有孔的注射口B添加22微升抗霉素A。在具有代表性的寡霉素优化运行中，当累积浓度达到1微摩尔时，达到氧气消耗率或OCR的平台。从这个浓度开始，OCR没有进一步降低。对于用浓度增加的解耦FCCP处理的细胞，OCR水平增加到0.2微摩尔FCCP，然后达到平台，表明获得了完全解耦。在具有代表性的细胞浓度优化运行中，使用200， 000个细胞运行的初始OCR大约是400， 000个细胞的一半。FCCP处理后，200， 000个细胞的最大OCR为每分钟61.6皮摩尔，400， 000个细胞的最大OCR为每分钟190.4皮摩尔。在寡霉素治疗后，200， 000个细胞的OCR崩溃成个位数，并且低于400， 000个细胞的运行。研究细胞因子白细胞介素-2和白细胞介素-15对T细胞代谢的影响表明，白细胞介素-15培养的细胞具有更高的最大呼吸和备用呼吸能力。然而，基础呼吸和ATP产生没有受到影响。研究人类T细胞中的线粒体代谢为它们的耐久性和生存潜力提供了重要线索。这导致对T细胞适应性的了解增加，并最终可以提高癌症免疫治疗反应率。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T细胞受体在小鼠T细胞的逆转录病毒转导

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

科研

免疫与感染

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

从初级人类的幼稚和记忆T细胞的诱导调节性T细胞的生成

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac转座子初级人类T细胞系统改造

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

T细胞实时成像实时信号复合物的形成

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

量<em在体外</em&gt;激活的主人微血管内皮细胞在静态条件下测量的检测，以中性粒细胞粘附

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

一种优化的协议分析和糖酵解线粒体呼吸的淋巴细胞

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

人外周血和淋巴组织中原发性 T 细胞突触界面的评价

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

人正常记忆 b 细胞与长寿浆细胞体外分化模型

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

用于嵌合抗原受体 T 细胞的实时效力测定，用于定位固体和血液癌细胞

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

恒流中原发性人类内皮细胞的肺炎球菌感染

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...