Name: real-time monitoring of mitochondrial respiration in cytokine-differentiated human primary t cells
Uploaded: 2021-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells at JoVE.com

Kasper Mølgaard et Anne Rahbech ont reçu des subventions de Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaard a également reçu une subvention du Børnecancerfonden.

Les expériences ont été menées selon les directives de l’hôpital Herlev et de la région de la capitale du Danemark.
Remarque : Ce protocole contient des instructions pour une exécution d’optimisation et une exécution de tests. Il est clairement écrit dans le texte lorsque les instructions concernent une exécution d’optimisation ou une exécution de test. Exécuter une exécution d’optimisation avant de poursuivre les exécutions d’assay
1. ...

<ol>
	<li>vander Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+capacity+is+a+critical+regulator+of+CD8++T+cell+memory+development.">Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development.</a> Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).</li><li>Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+takes+a+breath--new+quantitative+perspectives+on+bioenergetics+and+signal+transduction.">Signaling takes a breath--new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction.</a> Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).</li><li>vander Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+memory+T+cells+have+a+bioenergetic+advantage+that+underlies+their+rapid+recall+ability.">CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).</li><li>Chang, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+control+of+T+cell+effector+function+by+aerobic+glycolysis.">Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis.</a> Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).</li><li>vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bioenergetics+in+T+cells+using+a+Seahorse+extracellular+flux+analyzer.">Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer.</a> Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).</li><li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li><li>Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+T-cell+reconditioning:+Improving+metabolic+fitness+for+optimal+cancer+immunotherapy.">Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Kenwood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane.">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).</li><li>Alizadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL15+enhances+CAR-T+cell+antitumor+activity+by+reducing+mTORC1+activity+and+preserving+their+stem+cell+memory+phenotype.">IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype.</a> Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).</li></ol>

La quantification détaillée et correcte de la phosphorylation oxydative est un outil indispensable pour décrire les états énergétiques des lymphocytes T. L’état de la condition mitochondriale peut être directement lié au potentiel d’activation, à la survie et à la différenciation des lymphocytes T1,5. Avec ce protocole, il est possible de déterminer les différentes propriétés de la phosphorylation oxydative (voir tableau 4 pou...

Le développement et la fonction corrects des lymphocytes T sont essentiels à la capacité du système immunitaire à reconnaître les antigènes et à y répondre. La phosphorylation oxydative mitochondriale (OxPhos) change en fonction de l’état de la cellule T. Les lymphocytes T naïfs utilisent principalement OxPhos pour produire de l’ATP, tandis que les lymphocytes T activés subissent une transition métabolique où la glycolyse devient dominante1. Après la phase effectrice, le petit sous-ensemble restant de lymphocytes T mémoire revient à un état métabolique dominé par OxPhos2,3. Les changements d’OxPhos suivent la différenciation des lymphocytes T à un tel degré que même des sous-ensembles de lymphocytes T peuvent être différenciés par leurs propriétés spécifiques d’OxPhos1. Inversement, OxPhos est important pour le fonctionnement des lymphocytes T, et il a été démontré que l’inhibition d’OxPhos bloque la prolifération et la production de cytokines des lymphocytes T4. Par conséquent, la capacité de quantifier les propriétés des lymphocytes T OxPhos de manière précise et reproductible est un outil puissant pour quiconque travaille avec des lymphocytes T.
Dans ce protocole, les propriétés des lymphocytes T OxPhos sont mesurées à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire. La fonction principale de cet analyseur est de mesurer en continu la teneur en oxygène des milieux de croissance des cellules à analyser. L’oxygène retiré du milieu de croissance est supposé être absorbé par les cellules. En traitant les cellules avec une variété d’inhibiteurs ou de modificateurs d’OxPhos, une baisse de l’absorption d’oxygène est associée à la fonction inhibée ou modulée. Par exemple, l’inhibition de l’ATP synthase entraînera une réduction de l’absorption cellulaire de l’oxygène qui serait autrement utilisé pour produire de l’ATP par phosphorylation oxydative. D’autres équipements, y compris l’électrode Clark et l’instrument Oroboros, offrent des fonctionnalités similaires, et chaque instrument présente des avantages et des inconvénients différents. Un large éventail de types de cellules peut être utilisé pour des études dans ces dispositifs, mais un type de cellule particulièrement difficile est les lymphocytes T primaires humains5. En raison de leur petite taille, de leur faible survie ex vivo et de leurs propriétés non adhérentes, les cellules T primaires humaines peuvent être difficiles à étudier.
Il s’agit d’un protocole pour étudier la respiration mitochondriale des cellules T primaires humaines par un analyseur extracellulaire. Le protocole est divisé en une série d’optimisation, où les concentrations optimales du nombre de cellules par puits, ainsi que la concentration optimale d’olligomycine et de FCCP, sont déterminées. En outre, une exécution d’essai, où les conditions optimisées sont utilisées.
En utilisant des PBMC humains d’origine sanguine et des cultures de lymphocytes T primaires ex vivo , ce protocole démontre l’importance d’une concentration optimale d’inhibiteurs et la pertinence d’utiliser une injection séparée au lieu d’une injection séquentielle d’inhibiteurs mitochondriaux lorsque vous travaillez avec des types de cellules sensibles. Enfin, il est démontré que ce test peut détecter de manière robuste des différences subtiles dans la respiration mitochondriale lors de la polarisation avec les cytokines IL-2 et IL-15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD3xCD28 beads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>For coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Heat inactivated at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>O4876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco-Thermo Fisher</td>
			<td>61870036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M glucose solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100 mM pytuvate solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200 mM glutamine solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF RPMI medium, pH7.4</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103576-100</td>
			<td>XF RPMI media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyser</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 cell culture microplates</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>XF cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 sensor cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2770-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02-060F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Flux analyzer software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time monitoring of mitochondrial respiration in cytokine-differentiated human primary t cells

Lors de l’activation, le métabolisme des lymphocytes T s’adapte aux changements qui ont un impact sur leur devenir. Une augmentation de la phosphorylation oxydative mitochondriale est indispensable pour l’activation des lymphocytes T, et la survie des lymphocytes T mémoire dépend du remodelage mitochondrial. Par conséquent, cela affecte le résultat clinique à long terme des immunothérapies anticancéreuses. Les changements dans la qualité des lymphocytes T sont souvent étudiés par cytométrie en flux à l’aide de marqueurs de surface bien connus et non directement par leur état métabolique. Il s’agit d’un protocole optimisé pour mesurer la respiration mitochondriale en temps réel des cellules T humaines primaires à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire et des cytokines IL-2 et IL-15, qui affectent différemment le métabolisme des cellules T. Il est démontré que l’état métabolique des lymphocytes T peut être clairement distingué en mesurant la consommation d’oxygène lors de l’inhibition de complexes clés dans la voie métabolique et que la précision de ces mesures dépend fortement de la concentration optimale d’inhibiteurs et de la stratégie d’injection d’inhibiteurs. Ce protocole normalisé aidera à mettre en œuvre la respiration mitochondriale en tant que norme pour l’aptitude des lymphocytes T dans la surveillance et l’étude des immunothérapies contre le cancer.

Une détermination correcte des propriétés d’OxPhos est un outil indispensable lors de l’étude des lymphocytes T. Toutefois, si les conditions d’essai n’ont pas été optimisées, il existe un risque important de résultats trompeurs ou erronés. Dans ce protocole, l’accent est mis sur l’optimisation du nombre de cellules par puits et des concentrations d’oligomycine et de FCCP à utiliser. Dans la configuration décrite, l’oligomycine et le FCCP sont ajoutés progressivement au même puits, ce qui aug...

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Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells

L’adaptation métabolique est fondamentale pour les lymphocytes T car elle dicte la différenciation, la persistance et la cytotoxicité. Ici, un protocole optimisé pour surveiller la respiration mitochondriale dans les cellules T primaires humaines différenciées par cytokines ex vivo est présenté.

Surveillance en temps réel de la respiration mitochondriale dans les cellules T primaires humaines différenciées par cytokines

During activation, the metabolism of T cells adapts to changes that impact their fate. An increase in mitochondrial oxidative phosphorylation is ...

Le métabolisme mitochondrial est un régulateur essentiel de la durabilité et de la mémoire des lymphocytes T. La mesure de la respiration mitochondriale donne donc un aperçu important des propriétés des lymphocytes T. La machine Seahorse peut mesurer divers éléments de la respiration mitochondriale, en temps réel, dans des lymphocytes T primaires humains vivants, sans avoir besoin d’un marquage.Cette méthode est très appropriée pour surveiller la capacité physique des lymphocytes T et le potentiel de mémoire, qui sont des prédicteurs importants du succès de l’immunothérapie du cancer. Pour commencer, lavez les billes CD3/CD28 en transférant 12,5 microlitres de perles par million de cellules dans un tube de microcentrifugation et en ajoutant 12,5 microlitres de PBS par 12,5 microlitres de perles dans le tube. Ensuite, placez le tube de microcentrifugation sur un aimant approprié pendant une minute, jetez le tampon et remettez en suspension les billes dans le volume d’origine du milieu cellulaire T.Ensuite, ajoutez 12,5 microlitres de perles par million de cellules à un rapport de une à deux perles par cellules, et divisez les cellules en deux conditions avec environ cinq millions de cellules dans chacune. Ensuite, ajoutez le volume correct de cytokines à chaque condition et transférez les cellules sur des plaques multi-puits. Incuber les cellules pendant trois jours à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Après trois jours d’incubation, préparez un milieu de lymphocytes T frais avec le double de la concentration de cytokines. Resuspendez et divisez les cellules en transférant la moitié du volume de chaque puits dans un nouveau puits. Ensuite, ajoutez le même volume de milieu cellulaire T fraîchement préparé à chaque puits.Pour le test de flux extracellulaire, préparez une solution de revêtement contenant du bicarbonate de sodium, du Cell-Tak et de l’hydroxyde de sodium. Ensuite, ouvrez une plaque de culture cellulaire XF fraîche et ajoutez 12 microlitres de la solution de revêtement fraîchement préparée à chaque puits, assurant une distribution uniforme de la solution de revêtement au fond de tous les puits. Incuber la plaque à température ambiante avec le couvercle pendant 30 minutes.Ensuite, jetez la solution liquide restante de tous les puits. Lavez la plaque avec 200 microlitres d’eau stérile et jetez le liquide. Ensuite, lavez la plaque avec 200 microlitres de PBS stérile de qualité culture cellulaire.Après avoir jeté le liquide, laissez sécher la plaque pendant 30 minutes à température ambiante. Pour plaquer les lymphocytes T dans la plaque de culture cellulaire XF, préparez 50 millilitres de milieux d’essai en mélangeant des milieux XF RPMI appropriés avec du glucose, du pyruvate et de la glutamine selon la configuration expérimentale. Chauffer le milieu préparé à 37 degrés Celsius dans un incubateur non régulé au dioxyde de carbone et régler le pH à 7,4.Assurez-vous d’avoir suffisamment de milieux pour planter des cellules et préparer les solutions d’olligomycine et de FCCP. Ensuite, concevez une disposition de plaque avec un nombre croissant de cellules par puits pour l’optimisation ou l’exécution du test. Utilisez quatre puits remplis de milieux et injectés avec des milieux pour les mesures de fond.Après avoir compté les lymphocytes T préparés plus tôt, pipeter un nombre approprié de cellules dans chaque puits de la plaque de culture cellulaire XF précédemment revêtue en fonction de la disposition de la plaque. Pour faire adhérer les lymphocytes T à la surface revêtue, centrifugez la plaque de culture cellulaire XF. Ensuite, lavez les cellules avec 200 microlitres de milieux d’essai.Jetez le média et ajoutez 180 microlitres de milieux d’essai frais. Après vous être assuré que les cellules sont fixées et réparties uniformément sur la surface du puits, incuber la plaque de culture cellulaire XF à 37 degrés Celsius dans l’armoire chauffante non régulée au dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Pour l’exécution de l’optimisation, préparez des solutions de travail d’oligomycine et de FCCP dans des milieux d’essai.Ensuite, chargez les solutions de travail d’oligomycine ou de FCCP dans les orifices d’injection de la cartouche du capteur. Assurez-vous qu’aucun orifice d’injection ne contient uniquement de l’air. Remplissez tous les ports vides avec un support de test.Ensuite, éliminez les bulles potentielles dans les orifices d’injection en frappant doucement les bords de la plaque sur la table. Pour l’essai, préparez une solution d’antimycine A de 20 micromolaires. Ensuite, selon la disposition de la plaque, chargez 20 microlitres d’oligomycine ou de FCCP dans le port d’injection A de la cartouche du capteur et ajoutez 22 microlitres d’antimycine A au port d’injection B de tous les puits.Dans une série représentative d’optimisation de l’oligomycine, un plateau du taux de consommation d’oxygène, ou OCR, est atteint lorsque la concentration accumulative atteint un micromole. À partir de cette concentration, l’OCR n’a pas été réduite davantage. Pour les cellules traitées avec des concentrations croissantes du fccP découpleur, les niveaux d’OCR ont augmenté jusqu’à 0,2 FCCP micromolaire, puis ont atteint un plateau, indiquant que le découplage complet a été obtenu.Dans une exécution d’optimisation de la concentration cellulaire représentative, l’OCR initial pour une exécution avec 200 000 cellules est d’environ la moitié de cela, avec 400 000 cellules. Après traitement FCCP, l’OCR maximale est de 61,6 picomoles par minute pour 200 000 cellules et de 190,4 picomoles par minute pour 400 000 cellules. Après un traitement à l’oligomycine, l’OCR dans la course avec 200 000 cellules s’effondre en un seul chiffre et est inférieur à celui de la course avec 400 000 cellules.L’étude de l’effet des cytokines interleukine-2 et interleukine-15 sur le métabolisme des lymphocytes T a révélé que les cellules cultivées à l’interleukine-15 possédaient une respiration maximale plus élevée et une capacité respiratoire de rechange. Cependant, la respiration basale et la production d’ATP n’ont pas été affectées. L’étude du métabolisme mitochondrial dans les lymphocytes T humains donne des indices importants sur leur durabilité et leur potentiel de survie.Il en résulte une meilleure connaissance de la condition physique des lymphocytes T et peut finalement améliorer les taux de réponse à l’immunothérapie du cancer.

Research

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