Name: real-time monitoring of mitochondrial respiration in cytokine-differentiated human primary t cells
Uploaded: 2021-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells at JoVE.com

Kasper Mølgaard und Anne Rahbech erhielten Stipendien von Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaard erhielt auch ein Stipendium von Børnecancerfonden.

Die Experimente wurden nach den Richtlinien des Herlev-Krankenhauses und der Hauptstadtregion Dänemarks durchgeführt.
HINWEIS: Dieses Protokoll enthält Anweisungen für einen Optimierungslauf und einen Assays-Lauf. Es steht klar im Text, wenn Anweisungen für einen Optimierungslauf oder einen Assay-Lauf gelten. Führen Sie einen Optimierungslauf durch, bevor Sie mit den Assay-Läufen fortfahren
1. Menschliche periphere Blut mononukleär (PBMC) Isolierung vo...

<ol>
	<li>vander Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+capacity+is+a+critical+regulator+of+CD8++T+cell+memory+development.">Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development.</a> Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).</li><li>Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+takes+a+breath--new+quantitative+perspectives+on+bioenergetics+and+signal+transduction.">Signaling takes a breath--new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction.</a> Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).</li><li>vander Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+memory+T+cells+have+a+bioenergetic+advantage+that+underlies+their+rapid+recall+ability.">CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).</li><li>Chang, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+control+of+T+cell+effector+function+by+aerobic+glycolysis.">Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis.</a> Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).</li><li>vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bioenergetics+in+T+cells+using+a+Seahorse+extracellular+flux+analyzer.">Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer.</a> Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).</li><li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li><li>Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+T-cell+reconditioning:+Improving+metabolic+fitness+for+optimal+cancer+immunotherapy.">Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Kenwood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane.">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).</li><li>Alizadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL15+enhances+CAR-T+cell+antitumor+activity+by+reducing+mTORC1+activity+and+preserving+their+stem+cell+memory+phenotype.">IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype.</a> Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).</li></ol>

Eine detaillierte und korrekte Quantifizierung der oxidativen Phosphorylierung ist ein unverzichtbares Werkzeug bei der Beschreibung der Energiezustände von T-Zellen. Der Zustand der mitochondrialen Fitness kann in direktem Zusammenhang mit dem T-Zell-Aktivierungspotenzial, dem Überleben und der Differenzierung stehen1,5. Mit diesem Protokoll ist es möglich, die verschiedenen Eigenschaften der oxidativen Phosphorylierung zu bestimmen (siehe Tabelle 4</...

Die korrekte Entwicklung und Funktion von T-Zellen ist für die Fähigkeit des Immunsystems, Antigene zu erkennen und darauf zu reagieren, unerlässlich. Die mitochondriale oxidative Phosphorylierung (OxPhos) ändert sich je nach Zustand der T-Zelle. Naive T-Zellen verwenden OxPhos überwiegend zur Produktion von ATP, während aktivierte T-Zellen einen metabolischen Übergang durchlaufen, bei dem die Glykolyse dominant wird1. Nach der Effektorphase kehrt die kleine verbleibende Teilmenge der Gedächtnis-T-Zellen in einen von OxPhos2,3 dominierten Stoffwechselzustand zurück. Die Veränderungen von OxPhos folgen der Differenzierung von T-Zellen in einem solchen Maße, dass auch Teilmengen von T-Zellen durch ihre spezifischen OxPhos-Eigenschaften unterschieden werden können1. Umgekehrt ist OxPhos wichtig für die Funktion von T-Zellen, und die Hemmung von OxPhos blockiert nachweislich die Proliferation und Zytokinproduktion von T-Zellen4. Daher ist die Fähigkeit, die Eigenschaften von T-Zell-OxPhos präzise und reproduzierbar zu quantifizieren, ein leistungsfähiges Werkzeug für jeden, der mit T-Zellen arbeitet.
In diesem Protokoll werden die Eigenschaften von T-Zell-OxPhos mit einem extrazellulären Flussanalysator gemessen. Die Kernfunktion dieses Analysators besteht darin, kontinuierlich den Sauerstoffgehalt der Wachstumsmedien der zu analysierenden Zellen zu messen. Es wird angenommen, dass Sauerstoff, der aus den Wachstumsmedien entfernt wird, von den Zellen aufgenommen wird. Durch die Behandlung der Zellen mit einer Vielzahl von Oxphos-Inhibitoren oder Modifikatoren ist ein Abfall der Sauerstoffaufnahme mit der gehemmten oder modulierten Funktion verbunden. Zum Beispiel führt die Hemmung der ATP-Synthase zu einer reduzierten zellulären Aufnahme von Sauerstoff, der sonst zur Herstellung von ATP durch oxidative Phosphorylierung verwendet würde. Andere Geräte, einschließlich der Clark-Elektrode und des Oroboros-Instruments, bieten eine ähnliche Funktionalität, und jedes Instrument hat unterschiedliche Vorteile und Mängel. Eine breite Palette von Zelltypen kann für Studien in diesen Geräten verwendet werden, aber ein besonders herausfordernder Zelltyp sind menschliche primäre T-Lymphozyten5. Aufgrund ihrer geringen Größe, ihres schlechten Ex-vivo-Überlebens und ihrer nicht adhärenten Eigenschaften können menschliche primäre T-Zellen schwierig zu untersuchen sein.
Dies ist ein Protokoll zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung menschlicher primärer T-Zellen durch einen extrazellulären Analysator. Das Protokoll ist in einen Optimierungslauf unterteilt, bei dem optimale Konzentrationen der Zellzahl pro Well, sowie die optimale Konzentration von Oligomycin und FCCP, bestimmt werden. Weiterhin ein Assay-Lauf, bei dem die optimierten Bedingungen genutzt werden.
Unter Verwendung von aus Blut gewonnenen humanen PBMCs und ex vivo primären T-Zellkulturen zeigt dieses Protokoll die Bedeutung einer optimalen Inhibitorkonzentration und die Relevanz der Verwendung separater anstelle einer sequentiellen Injektion von mitochondrialen Inhibitoren bei der Arbeit mit empfindlichen Zelltypen. Schließlich wird gezeigt, dass dieser Assay subtile Unterschiede in der mitochondrialen Atmung bei Polarisation mit den Zytokinen IL-2 und IL-15 robust nachweisen kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD3xCD28 beads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>For coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Heat inactivated at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>O4876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco-Thermo Fisher</td>
			<td>61870036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M glucose solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100 mM pytuvate solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200 mM glutamine solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF RPMI medium, pH7.4</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103576-100</td>
			<td>XF RPMI media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyser</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 cell culture microplates</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>XF cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 sensor cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2770-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02-060F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Flux analyzer software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time monitoring of mitochondrial respiration in cytokine-differentiated human primary t cells

Während der Aktivierung passt sich der Stoffwechsel von T-Zellen an Veränderungen an, die sich auf ihr Schicksal auswirken. Eine Erhöhung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung ist für die T-Zell-Aktivierung unerlässlich, und das Überleben von Gedächtnis-T-Zellen hängt vom mitochondrialen Umbau ab. Folglich beeinflusst dies das langfristige klinische Ergebnis von Krebsimmuntherapien. Veränderungen der T-Zell-Qualität werden oft durch Durchflusszytometrie unter Verwendung bekannter Oberflächenmarker und nicht direkt durch ihren Stoffwechselzustand untersucht. Dies ist ein optimiertes Protokoll zur Messung der mitochondrialen Atmung primärer menschlicher T-Zellen in Echtzeit mit einem extrazellulären Flussanalysator und den Zytokinen IL-2 und IL-15, die den T-Zell-Stoffwechsel unterschiedlich beeinflussen. Es wird gezeigt, dass der Stoffwechselzustand von T-Zellen durch die Messung des Sauerstoffverbrauchs bei der Hemmung von Schlüsselkomplexen im Stoffwechselweg eindeutig unterschieden werden kann und dass die Genauigkeit dieser Messungen in hohem Maße von der optimalen Inhibitorkonzentration und der Inhibitorinjektionsstrategie abhängt. Dieses standardisierte Protokoll wird dazu beitragen, die mitochondriale Atmung als Standard für die T-Zell-Fitness bei der Überwachung und Untersuchung von Krebsimmuntherapien zu implementieren.

Eine korrekte Bestimmung der OxPhos-Eigenschaften ist ein unverzichtbares Werkzeug bei der Untersuchung von T-Zellen. Wenn die Assay-Bedingungen jedoch nicht optimiert wurden, besteht ein erhebliches Risiko irreführender oder fehlerhafter Ergebnisse. In diesem Protokoll liegt ein starker Fokus auf der Optimierung der Zellzahl pro Vertiefung und der zu verwendenden Konzentrationen von Oligomycin und FCCP. In der beschriebenen Einrichtung werden Oligomycin und FCCP inkrementell in dieselbe Vertiefung gegeben, wodurch die ...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells at JoVE.com

Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells

Die metabolische Anpassung ist für T-Zellen von grundlegender Bedeutung, da sie Differenzierung, Persistenz und Zytotoxizität bestimmt. Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Überwachung der mitochondrialen Atmung in ex vivo Zytokin-differenzierten humanen primären T-Zellen vorgestellt.

Echtzeitüberwachung der mitochondrialen Atmung in zytokindifferenzierten humanen primären T-Zellen

During activation, the metabolism of T cells adapts to changes that impact their fate. An increase in mitochondrial oxidative phosphorylation is ...

Der mitochondriale Stoffwechsel ist ein wesentlicher Regulator der Haltbarkeit und des Gedächtnisses von T-Zellen. Die Messung der mitochondrialen Atmung liefert daher wichtige Einblicke in die Eigenschaften von T-Zellen. Die Seahorse-Maschine kann verschiedene Elemente der mitochondrialen Atmung in Echtzeit in lebenden menschlichen primären T-Lymphozyten messen, ohne dass eine Markierung erforderlich ist.Diese Methode eignet sich sehr gut zur Überwachung der T-Zell-Fitness und des Gedächtnispotenzials, die wichtige Prädiktoren für den Erfolg der Krebsimmuntherapie sind. Waschen Sie zunächst CD3 / CD28-Perlen, indem Sie 12,5 Mikroliter Perlen pro Million Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und 12,5 Mikroliter PBS pro 12,5 Mikroliter der Perlen in der Tube hinzufügen. Legen Sie dann das Mikrozentrifugenröhrchen für eine Minute auf einen geeigneten Magneten, entsorgen Sie den Puffer und suspendieren Sie die Perlen im ursprünglichen Volumen des T-Zell-Mediums.Als nächstes fügen Sie 12,5 Mikroliter Perlen pro Million Zellen in einem Verhältnis von eins zu zwei Perlen zu Zellen hinzu und teilen Sie die Zellen in zwei Bedingungen mit jeweils etwa fünf Millionen Zellen auf. Fügen Sie dann jedem Zustand das richtige Volumen an Zytokinen hinzu und übertragen Sie die Zellen auf Multi-Well-Platten. Inkubieren Sie die Zellen drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Nach drei Tagen Inkubation frisches T-Zell-Medium mit doppelter Zytokinkonzentration herstellen. Suspendieren und teilen Sie die Zellen auf, indem Sie die Hälfte des Volumens von jedem Bohrloch in ein neues Bohrloch übertragen. Fügen Sie dann das gleiche Volumen an frisch zubereitetem T-Zell-Medium zu jeder Vertiefung hinzu.Für den extrazellulären Flussmittelassay ist eine Beschichtungslösung herzustellen, die Natriumbicarbonat, Cell-Tak und Natriumhydroxid enthält. Öffnen Sie dann eine frische XF-Zellkulturplatte und fügen Sie 12 Mikroliter der frisch zubereiteten Beschichtungslösung zu jeder Vertiefung hinzu, um eine gleichmäßige Verteilung der Beschichtungslösung am Boden aller Vertiefungen zu gewährleisten. Bebrüten Sie die Platte bei Raumtemperatur mit aufgesetztem Deckel für 30 Minuten.Entsorgen Sie dann die verbleibende flüssige Lösung aus allen Vertiefungen. Waschen Sie die Platte mit 200 Mikrolitern sterilem Wasser und entsorgen Sie die Flüssigkeit. Als nächstes waschen Sie die Platte mit 200 Mikrolitern sterilem PBS in Zellkulturqualität.Nachdem Sie die Flüssigkeit entsorgt haben, lassen Sie die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Um T-Zellen in der XF-Zellkulturplatte zu platten, bereiten Sie 50 Milliliter Assay-Medien vor, indem Sie geeignete XF-RPMI-Medien mit Glukose, Pyruvat und Glutamin gemäß dem Versuchsaufbau mischen. Erhitzen Sie die vorbereiteten Medien in einem nicht kohlendioxidregulierten Inkubator auf 37 Grad Celsius und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein.Stellen Sie sicher, dass genügend Medien zum Pflanzen von Zellen und zur Vorbereitung der Oligomycin- und FCCP-Lösungen vorhanden sind. Als nächstes entwerfen Sie ein Plattenlayout mit einer zunehmenden Anzahl von Zellen pro Vertiefung für die Optimierung oder den Assay-Lauf. Verwenden Sie vier Vertiefungen, die mit Medien gefüllt und mit Medien für Hintergrundmessungen injiziert werden.Nachdem Sie die zuvor vorbereiteten T-Zellen gezählt haben, pipettieren Sie eine entsprechende Anzahl von Zellen zu jeder Vertiefung der zuvor beschichteten XF-Zellkulturplatte gemäß dem Plattenlayout. Um die T-Zellen auf der beschichteten Oberfläche zu verkleben, zentrifugieren Sie die XF-Zellkulturplatte. Waschen Sie dann die Zellen mit 200 Mikrolitern Assay-Medien.Entsorgen Sie die Medien und fügen Sie 180 Mikroliter frische Assay-Medien hinzu. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Zellen befestigt und gleichmäßig über die Brunnenoberfläche verteilt sind, inkubieren Sie die XF-Zellkulturplatte bei 37 Grad Celsius im nicht kohlendioxidregulierten Heizraum für 30 Minuten. Bereiten Sie für den Optimierungslauf Arbeitslösungen von Oligomycin und FCCP in Assay-Medien vor.Laden Sie dann die Arbeitslösungen von Oligomycin oder FCCP in die Einspritzanschlüsse der Sensorpatrone. Stellen Sie sicher, dass keine Einspritzöffnungen nur Luft enthalten. Füllen Sie alle leeren Ports mit Assay-Medien.Entfernen Sie dann potenzielle Blasen in den Injektionsanschlüssen, indem Sie vorsichtig die Kanten der Platte auf dem Tisch klopfen. Bereiten Sie für den Assay-Durchlauf eine 20-Mikromol-Antimycin-A-Lösung vor. Laden Sie dann gemäß dem Plattenlayout 20 Mikroliter entweder Oligomycin oder FCCP in den Injektionsanschluss A der Sensorkassette und fügen Sie 22 Mikroliter Antimycin A zu Injektionsanschluss B aller Vertiefungen hinzu.In einem repräsentativen Oligomycin-Optimierungslauf wird ein Plateau der Sauerstoffverbrauchsrate oder OCR erreicht, wenn die akkumulative Konzentration ein Mikromol erreicht. Ab dieser Konzentration wurde die OCR nicht weiter reduziert. Für Zellen, die mit steigenden Konzentrationen des Entkopplers FCCP behandelt wurden, stiegen die OCR-Spiegel auf bis zu 0,2 Mikromolar FCCP und erreichten dann ein Plateau, was darauf hindeutet, dass eine vollständige Entkopplung erreicht wurde.In einem repräsentativen Zellkonzentrationsoptimierungslauf beträgt die anfängliche OCR für einen Durchlauf mit 200.000 Zellen etwa die Hälfte davon mit 400.000 Zellen. Nach der FCCP-Behandlung beträgt die maximale OCR 61,6 Picomolen pro Minute für 200.000 Zellen und 190,4 Picomol pro Minute für 400.000 Zellen. Nach der Behandlung mit Oligomycin kollabiert die OCR im Durchlauf mit 200.000 Zellen in einen einstelligen Bereich und ist niedriger als im Durchlauf mit 400.000 Zellen.Die Untersuchung der Wirkung der Zytokine Interleukin-2 und Interleukin-15 auf den Stoffwechsel von T-Zellen ergab, dass interleukin-15-kultivierte Zellen eine höhere maximale Atmung und freie Atemkapazität besaßen. Die Basalatmung und die ATP-Produktion waren jedoch nicht betroffen. Die Untersuchung des mitochondrialen Stoffwechsels in menschlichen T-Zellen liefert wichtige Hinweise auf ihre Haltbarkeit und ihr Überlebenspotenzial.Dies führt zu einem erhöhten Wissen über die T-Zell-Fitness und kann letztendlich die Ansprechraten auf die Krebsimmuntherapie verbessern.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Ein optimiertes Protokoll Glykolyse und die mitochondriale Atmung in Lymphozyten zu analysieren

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Bewertung der synaptischen Schnittstelle der primären menschlichen T-Zellen aus peripherem Blut und Lymphgewebe

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

In Vitro Differenzierung Modell der normalen Gedächtnis B Zellen zu langlebigen Plasmazellen

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Ein Echtzeit-Potenz-Assay für chimerantigene Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf feste und hämatologische Krebszellen abzielen

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Pneumokokken-Infektion von primären humanen Endothelzellen im konstanten Fluss

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...