Name: real-time monitoring of mitochondrial respiration in cytokine-differentiated human primary t cells
Uploaded: 2021-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells at JoVE.com

Kasper MølgaardとAnne Rahbechは、Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegatから助成金を受けました。Kasper MølgaardもBørnecancerfondenから助成金を受けました。

実験は、ヘルレフ病院とデンマークの首都圏のガイドラインの下で実施されました。
メモ: このプロトコルには、最適化実行とアッセイ実行の両方の手順が含まれています。これは、命令が最適化実行またはアッセイ実行の場合、テキストに明確に書かれています。アッセイの実行を続行する前に最適化の実行を実行します。
1. バフィーコート?...

<ol>
	<li>vander Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+capacity+is+a+critical+regulator+of+CD8++T+cell+memory+development.">Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development.</a> Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).</li><li>Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+takes+a+breath--new+quantitative+perspectives+on+bioenergetics+and+signal+transduction.">Signaling takes a breath--new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction.</a> Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).</li><li>vander Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+memory+T+cells+have+a+bioenergetic+advantage+that+underlies+their+rapid+recall+ability.">CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).</li><li>Chang, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+control+of+T+cell+effector+function+by+aerobic+glycolysis.">Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis.</a> Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).</li><li>vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bioenergetics+in+T+cells+using+a+Seahorse+extracellular+flux+analyzer.">Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer.</a> Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).</li><li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li><li>Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+T-cell+reconditioning:+Improving+metabolic+fitness+for+optimal+cancer+immunotherapy.">Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Kenwood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane.">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).</li><li>Alizadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL15+enhances+CAR-T+cell+antitumor+activity+by+reducing+mTORC1+activity+and+preserving+their+stem+cell+memory+phenotype.">IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype.</a> Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).</li></ol>

酸化的リン酸化の詳細な正確な定量化は、T細胞のエネルギー状態を記述する際に不可欠なツールである。ミトコンドリア適合度の状態は、T細胞の活性化能、生存率、分化に直接関係している可能性があります1,5。このプロトコールにより、酸化的リン酸化の様々な特性を決定することができる(詳細な説明については表4を参照された?...

正しいT細胞の発生と機能は、免疫系が抗原を認識して応答する能力に不可欠です。ミトコンドリア酸化リン酸化(OxPhos)は、T細胞の状態に応じて変化する。ナイーブT細胞は主にATPを生成するためにOxPhosを使用しますが、活性化T細胞は解糖系が優勢になる代謝遷移を経験します1。エフェクター期の後、メモリーT細胞のわずかに残ったサブセットは、OxPhos2,3によって支配される代謝状態に戻る。OxPhosの変化は、T細胞のサブセットでさえも、それらの特異的なOxPhos特性によって分化することができる程度までT細胞の分化に続く1。逆に、OxPhosはT細胞の機能にとって重要であり、OxPhosの阻害はT細胞の増殖およびサイトカイン産生をブロックすることが実証されている4。したがって、T細胞OxPhosの特性を正確かつ再現性のある方法で定量化する能力は、T細胞を扱う人にとって強力なツールです。
このプロトコールでは、T細胞OxPhosの特性は、細胞外フラックス分析装置を用いて測定される。この分析装置のコア機能は、分析対象の細胞の増殖培地中の酸素含有量を連続的に測定することである。増殖培地から除去された酸素は、細胞によって取り込まれると仮定される。細胞を様々なOxPhos阻害剤または修飾剤で処理することによって、酸素取り込みの低下が阻害または調節された機能に関連する。例えば、ATP合成酵素の阻害は、酸化的リン酸化によってATPを生成するために使用されるであろう酸素の細胞取り込みの減少をもたらすであろう。クラーク電極やオロボロス装置を含む他の装置は、同様の機能を提供し、各装置には異なる長所と短所があります。これらの装置では、幅広い細胞型を研究に使用できますが、特に困難な細胞型の1つはヒト初代Tリンパ球5です。その小さなサイズ、 生体外での生存率の悪さ、および非接着特性のために、ヒト初代T細胞は研究が困難な場合があります。
これは、細胞外分析装置によるヒト初代T細胞のミトコンドリア呼吸を研究するためのプロトコールである。プロトコルは最適化ランに分割され、ウェルあたりの細胞数の最適濃度、ならびにオリゴマイシンおよびFCCPの最適濃度が決定される。さらに、最適化された条件が使用されるアッセイラン。
血液由来のヒトPBMCおよび エキソビボ 初代T細胞培養物を用いて、このプロトコールは、最適な阻害剤濃度の重要性と、感受性細胞型を扱う際にミトコンドリア阻害剤の逐次注射の代わりに別個を使用することの関連性を実証する。最後に、このアッセイがサイトカインIL-2およびIL-15による分極時のミトコンドリア呼吸の微妙な違いを堅牢に検出できることが実証された。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD3xCD28 beads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>For coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Heat inactivated at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>O4876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco-Thermo Fisher</td>
			<td>61870036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M glucose solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100 mM pytuvate solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200 mM glutamine solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF RPMI medium, pH7.4</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103576-100</td>
			<td>XF RPMI media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyser</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 cell culture microplates</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>XF cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 sensor cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2770-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02-060F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Flux analyzer software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time monitoring of mitochondrial respiration in cytokine-differentiated human primary t cells

活性化の間、T細胞の代謝は、その運命に影響を与える変化に適応する。ミトコンドリア酸化的リン酸化の増加はT細胞活性化に不可欠であり、メモリーT細胞の生存はミトコンドリアのリモデリングに依存している。その結果、これは癌免疫療法の長期的な臨床転帰に影響を及ぼす。T細胞品質の変化は、多くの場合、よく知られている表面マーカーを用いたフローサイトメトリーによって研究され、代謝状態によって直接研究されるわけではない。これは、細胞外フラックスアナライザーと、T細胞代謝に異なる影響を与えるサイトカインIL-2およびIL-15を使用して、初代ヒトT細胞のリアルタイムミトコンドリア呼吸を測定するための最適化されたプロトコルです。T細胞の代謝状態は、代謝経路における重要な複合体を阻害する際の酸素消費量を測定することによって明確に区別することができ、これらの測定の精度は最適な阻害剤濃度および阻害剤注入戦略に大きく依存することが示されている。この標準化されたプロトコルは、がん免疫療法のモニタリングおよび研究におけるT細胞適合性の標準としてミトコンドリア呼吸を実装するのに役立ちます。

OxPhosの特性を正しく決定することは、T細胞を研究する際に不可欠なツールです。しかしながら、アッセイ条件が最適化されていない場合、誤解を招くまたは誤った結果が生じる実質的なリスクがある。このプロトコルでは、使用するオリゴマイシンおよびFCCPのウェルおよび濃度当たりの細胞数の最適化に強い焦点がある。記載されたセットアップでは、オリゴマイシンおよびFCCPが同じウェ?...

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Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells

代謝適応は、分化、持続性、および細胞毒性を決定するため、T細胞にとって基本的である。ここでは、サイトカイン分化型ヒト初代T細胞の エクスビボ でミトコンドリア呼吸をモニタリングするための最適化されたプロトコールが提示される。

サイトカイン分化型ヒト初代T細胞におけるミトコンドリア呼吸のリアルタイムモニタリング

During activation, the metabolism of T cells adapts to changes that impact their fate. An increase in mitochondrial oxidative phosphorylation is ...

ミトコンドリア代謝は、T細胞の耐久性および記憶の必須調節因子である。したがって、ミトコンドリア呼吸を測定することは、T細胞の性質に関する重要な洞察を与える。タツノオトシゴマシンは、標識を必要とせずに、生きたヒト初代Tリンパ球のミトコンドリア呼吸のさまざまな要素をリアルタイムで測定できます。この方法は、がん免疫療法の成功の重要な予測因子であるT細胞の適応度と記憶能のモニタリングに非常に適しています。まず、100万細胞あたり12.5マイクロリットルのビーズを微量遠心チューブに移し、チューブ内のビーズ12.5マイクロリットルあたり12.5マイクロリットルのPBSを添加することによって、CD3/CD28ビーズを洗浄する。次いで、微量遠心管を適切な磁石上に1分間置き、緩衝液を廃棄し、ビーズを元の体積のT細胞培地に再懸濁する。次に、100万個の細胞あたり12.5マイクロリットルのビーズを1~2個のビーズ対細胞比で加え、それぞれ約500万個の細胞を含む2つの条件に細胞を分割します。次いで、各条件に正しい量のサイトカインを添加し、細胞をマルチウェルプレートに移す。細胞を摂氏37度および二酸化炭素5%で3日間インキュベートする。3日間のインキュベーション後、サイトカインの濃度を2倍にした新鮮なT細胞培地を調製する。各ウェルから新しいウェルに体積の半分を移すことによって、細胞を再懸濁および分割する。次いで、新たに調製したT細胞培地を各ウェルに同量加える。細胞外フラックスアッセイのために、炭酸水素ナトリウム、Cell-Tak、および水酸化ナトリウムを含むコーティング溶液を調製する。次いで、新鮮なXF細胞培養プレートを開き、新たに調製したコーティング溶液を各ウェルに12マイクロリットル加え、すべてのウェルの底部にコーティング溶液の均一な分布を保証する。蓋をした状態でプレートを室温で30分間インキュベートする。その後、残りの液体溶液を全てのウェルから廃棄する。プレートを200マイクロリットルの滅菌水で洗浄し、液体を捨てる。次に、プレートを200マイクロリットルの細胞培養グレードの滅菌PBSで洗浄する。液体を捨てた後、プレートを室温で30分間乾燥させる。T細胞をXF細胞培養プレートにプレートするには、実験セットアップに従って、適切なXF RPMI培地をグルコース、ピルビン酸、およびグルタミンと混合することによって50ミリリットルのアッセイ培地を調製する。調製した培地を非二酸化炭素調節インキュベーターで摂氏37度に加熱し、pHを7.4に設定します。細胞を植え付け、オリゴマイシンおよびFCCP溶液を調製するための十分な培地を確保する。次に、最適化またはアッセイ実行のために、ウェルあたりの細胞数を増やすプレートレイアウトを設計します。バックグラウンド測定のために、培地で満たされ、培地を注入した4つのウェルを使用する。先に調製したT細胞を計数した後、プレートレイアウトに従って予めコーティングしたXF細胞培養プレートの各ウェルに適当な細胞数をピペットで移す。コーティングされた表面にT細胞を接着させるために、XF細胞培養プレートを遠心分離する。次いで、細胞を200マイクロリットルのアッセイ培地で洗浄する。培地を廃棄し、180マイクロリットルの新鮮なアッセイ培地を加える。細胞が付着し、ウェル表面全体に均等に分布していることを確認した後、XF細胞培養プレートを非二酸化炭素調節加熱キャビネット内で摂氏37度で30分間インキュベートする。最適化実行のために、アッセイ培地中のオリゴマイシンおよびFCCPの作業溶液を調製する。次に、オリゴマイシンまたはFCCPのいずれかの作動溶液をセンサーカートリッジの注入口にロードする。噴射ポートに空気だけが含まれていないことを確認します。すべての空のポートをアッセイ媒体で満たします。次に、テーブル上のプレートの端を静かにノックすることによって、注入口内の潜在的な気泡を除去する。アッセイランのために、20マイクロモルのアンチマイシンA溶液を調製する。次に、プレートレイアウトに従って、オリゴマイシンまたはFCCPのいずれか20マイクロリットルをセンサカートリッジの注入口Aにロードし、22マイクロリットルのアンチマイシンAをすべてのウェルの注入口Bに加える。代表的なオリゴマイシン最適化実行では、累積濃度が1マイクロモルに達すると、酸素消費速度(OCR)のプラトーに達する。この濃度以降、OCRはそれ以上低下しなかった。アンカプラFCCPの濃度の増加で処理された細胞について、OCRレベルは0.2マイクロモルFCCPまで増加し、その後プラトーに達し、完全なアンカップリングが得られたことを示している。代表的な細胞濃度最適化実行では、200,000 個の細胞を含む実行の初期 OCR は、その約半分 (400,000 個の細胞) です。FCCP処理後、最大OCRは、200,000細胞に対して毎分61.6ピコモールであり、400,000細胞について毎分190.4ピコモールである。オリゴマイシン処理後、200,000細胞のランのOCRは1桁に崩壊し、400,000個のセルのランのOCRよりも低くなります。サイトカインインターロイキン-2およびインターロイキン-15がT細胞の代謝に及ぼす影響を調べると、インターロイキン-15培養細胞はより高い最大呼吸能力および予備呼吸能力を有することが明らかになった。しかし、基礎呼吸およびATP産生は影響を受けなかった。ヒトT細胞におけるミトコンドリア代謝を研究することは、その耐久性と生存可能性に関する重要な手がかりを与える。これにより、T細胞適応度に関する知識が増加し、最終的にがん免疫療法の奏効率を向上させることができます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

リンパ球における解糖およびミトコンドリア呼吸を分析するために最適化されたプロトコル

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

末梢血およびリンパ組織から主な人間の T 細胞のシナプスのインタ フェースの評価

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

通常記憶 B 細胞の長命の形質細胞への分化モデル

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

固体および造形癌細胞を標的とするキメラ抗原受容体T細胞のリアルタイム効力アッセイ

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

一定の流れの原発性ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...