Name: real-time monitoring of mitochondrial respiration in cytokine-differentiated human primary t cells
Uploaded: 2021-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells at JoVE.com

Kasper Mølgaard e Anne Rahbech receberam subsídios de Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaard também recebeu uma bolsa de Børnecancerfonden.

Os experimentos foram realizados sob as diretrizes do Hospital Herlev e da Região da Capital da Dinamarca.
NOTA: Este protocolo contém instruções tanto para uma execução de otimização quanto para uma execução de ensaios. Está claramente escrito no texto quando as instruções são para uma execução de otimização ou uma execução de ensaio. Execute uma corrida de otimização antes de continuar com as corridas de ensaio
1. Isolamento mononuclear...

<ol>
	<li>vander Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+capacity+is+a+critical+regulator+of+CD8++T+cell+memory+development.">Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development.</a> Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).</li><li>Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+takes+a+breath--new+quantitative+perspectives+on+bioenergetics+and+signal+transduction.">Signaling takes a breath--new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction.</a> Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).</li><li>vander Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+memory+T+cells+have+a+bioenergetic+advantage+that+underlies+their+rapid+recall+ability.">CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).</li><li>Chang, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+control+of+T+cell+effector+function+by+aerobic+glycolysis.">Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis.</a> Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).</li><li>vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bioenergetics+in+T+cells+using+a+Seahorse+extracellular+flux+analyzer.">Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer.</a> Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).</li><li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li><li>Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+T-cell+reconditioning:+Improving+metabolic+fitness+for+optimal+cancer+immunotherapy.">Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Kenwood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane.">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).</li><li>Alizadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL15+enhances+CAR-T+cell+antitumor+activity+by+reducing+mTORC1+activity+and+preserving+their+stem+cell+memory+phenotype.">IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype.</a> Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).</li></ol>

Quantificação detalhada e correta da fosforilação oxidativa é uma ferramenta indispensável ao descrever os estados energéticos das células T. O estado de aptidão mitocondrial pode estar diretamente relacionado ao potencial de ativação de células T, sobrevivência e diferenciação1,5. Com este protocolo, é possível determinar as várias propriedades da fosforilação oxidativa (ver Tabela 4 para uma explicação detalhada). A quanti...

O desenvolvimento e a função correta das células T são essenciais para a capacidade do sistema imunológico de reconhecer e responder a antígenos. A fosforilação oxidativa mitocondrial (OxPhos) muda de acordo com o estado da célula T. As células T ingênuas usam predominantemente OxPhos para produzir ATP, enquanto as células T ativadas passam por uma transição metabólica onde a glicólise se torna dominante1. Após a fase do efeito, o pequeno subconjunto remanescente de células T de memória reverte para um estado metabólico dominado por OxPhos2,3. As mudanças de OxPhos seguem a diferenciação das células T a tal ponto que até mesmo subconjuntos de células T podem ser diferenciados por suas propriedades específicas é as propriedades OxPhos1. Por outro lado, o OxPhos é importante para a função das células T, e a inibição do OxPhos tem sido demonstrada para bloquear a proliferação e a citocina das células T4. Portanto, a capacidade de quantificar as propriedades do OxPhos da célula T de forma precisa e reprodutível é uma ferramenta poderosa para quem trabalha com células T.
Neste protocolo, as propriedades dos OxPhos da célula T são medidas usando um analisador de fluxo extracelular. A função central deste analisador é medir continuamente o teor de oxigênio das mídias de crescimento das células a serem analisadas. Acredita-se que o oxigênio removido da mídia de crescimento seja tomado pelas células. Ao tratar as células com uma variedade de inibidores ou modificadores oxphos, uma queda na captação de oxigênio está associada à função inibida ou modulada. Por exemplo, a inibição da synthase ATP levará a uma absorção celular reduzida de oxigênio que de outra forma seria usado para produzir ATP por fosforilação oxidativa. Outros equipamentos, incluindo o eletrodo Clark e o instrumento Oroboros, oferecem funcionalidade semelhante, e cada instrumento tem diferentes vantagens e deficiências. Uma ampla gama de tipos de células pode ser usada para estudos nesses dispositivos, mas um tipo particularmente desafiador de células é o linfócitos T primários humanos5. Devido ao seu pequeno tamanho, má sobrevivência ex vivo e propriedades não aderentes, as células T primárias humanas podem ser desafiadoras para estudar.
Este é um protocolo para estudar a respiração mitocondrial das células T primárias humanas por um analisador extracelular. O protocolo é dividido em uma corrida de otimização, onde são determinadas concentrações ideais de número celular por bem, bem como a concentração ideal de oligomicina e FCCP. Além disso, uma corrida de ensaio, onde as condições otimizadas são usadas.
Usando PBMCs humanos derivados do sangue e culturas primárias de células T ex vivo , este protocolo demonstra a importância da concentração inibidora ideal e a relevância do uso separado em vez de uma injeção sequencial de inibidores mitocondriais ao trabalhar com tipos celulares sensíveis. Finalmente, demonstra-se que este ensaio pode detectar robustamente diferenças sutis na respiração mitocondrial após a polarização com citocinas IL-2 e IL-15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD3xCD28 beads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>For coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Heat inactivated at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>O4876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco-Thermo Fisher</td>
			<td>61870036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M glucose solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100 mM pytuvate solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200 mM glutamine solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF RPMI medium, pH7.4</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103576-100</td>
			<td>XF RPMI media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyser</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 cell culture microplates</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>XF cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 sensor cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2770-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02-060F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Flux analyzer software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time monitoring of mitochondrial respiration in cytokine-differentiated human primary t cells

Durante a ativação, o metabolismo das células T se adapta a mudanças que impactam seu destino. Um aumento da fosforilação oxidativa mitocondrial é indispensável para a ativação celular T, e a sobrevivência das células T da memória depende da remodelagem mitocondrial. Consequentemente, isso afeta o resultado clínico a longo prazo das imunoterapias contra o câncer. Mudanças na qualidade das células T são frequentemente estudadas pela citometria de fluxo usando marcadores superficiais bem conhecidos e não diretamente pelo seu estado metabólico. Este é um protocolo otimizado para medir a respiração mitocondrial em tempo real de células T humanas primárias usando um Analisador de Fluxo Extracelular e as citocinas IL-2 e IL-15, que afetam de forma diferente o metabolismo das células T. Mostra-se que o estado metabólico das células T pode ser claramente distinguido medindo o consumo de oxigênio ao inibir os principais complexos na via metabólica e que a precisão dessas medidas é altamente dependente da ótima concentração inibidora e estratégia de injeção inibidora. Este protocolo padronizado ajudará a implementar a respiração mitocondrial como um padrão para o condicionamento celular T no monitoramento e estudo de imunoterápicos cancerígenos.

Uma determinação correta das propriedades OxPhos é uma ferramenta indispensável ao estudar células T. No entanto, se as condições de ensaio não foram otimizadas, há um risco substancial de resultados enganosos ou errôneos. Neste protocolo, há um forte foco na otimização do número celular por poço e concentrações de oligomicina e FCCP a serem utilizadas. Na configuração descrita, a oligomicina e a FCCP são adicionadas incrementalmente ao mesmo poço, aumentando a concentração dos moduladores mitocond...

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Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells

A adaptação metabólica é fundamental para as células T, pois dita diferenciação, persistência e citotoxicidade. Aqui, é apresentado um protocolo otimizado para monitorar a respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas ex vivo .

Monitoramento em tempo real da respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas

During activation, the metabolism of T cells adapts to changes that impact their fate. An increase in mitochondrial oxidative phosphorylation is ...

O metabolismo mitocondrial é um regulador essencial da durabilidade e memória das células T. Medir a respiração mitocondrial, portanto, dá insights importantes sobre as propriedades das células T. A máquina de cavalos-marinhos pode medir vários elementos da respiração mitocondrial, em tempo real, em linfócitos T primários humanos vivos, sem a necessidade de qualquer rotulagem.Este método é muito adequado para monitorar o condicionamento físico e o potencial de memória das células T, que são importantes preditores do sucesso da imunoterapia contra o câncer. Para começar, lave as contas CD3/CD28 transferindo 12,5 microliters de contas por milhão de células para um tubo de microcentrída e adicionando 12,5 microliters de PBS por 12,5 microliters das contas no tubo. Em seguida, coloque o tubo de microcentrifuge em um ímã adequado por um minuto, descarte o buffer e resuspenja as contas no volume original do meio da célula T.Em seguida, adicione 12,5 microliters de contas por milhão de células em uma proporção de uma a duas contas por células, e divida as células em duas condições com cerca de cinco milhões de células em cada. Em seguida, adicione o volume correto de citocinas a cada condição e transfira as células para placas multi-poços. Incubar as células por três dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Após três dias de incubação, prepare o meio celular T fresco com o dobro da concentração de citocinas. Resuspend e divida as células transferindo metade do volume de cada poço para um novo poço. Em seguida, adicione o mesmo volume de meio de célula T recém-preparado para cada poço.Para o ensaio de fluxo extracelular, prepare a solução de revestimento contendo bicarbonato de sódio, Cell-Tak e hidróxido de sódio. Em seguida, abra uma placa de cultura celular XF fresca, e adicione 12 microliters da solução de revestimento recém-preparada para cada poço, garantindo até mesmo a distribuição da solução de revestimento na parte inferior de todos os poços. Incubar a placa em temperatura ambiente com a tampa ligada por 30 minutos.Em seguida, descarte a solução líquida restante de todos os poços. Lave a placa com 200 microliters de água estéril e descarte o líquido. Em seguida, lave a placa com 200 microliters de PBS estéreis de cultura celular.Depois de descartar o líquido, deixe a placa secar por 30 minutos em temperatura ambiente. Para aplacar células T na placa de cultura celular XF, prepare 50 mililitros de mídia de ensaio misturando mídia XF RPMI adequada com glicose, piruvato e glutamina de acordo com a configuração experimental. Aqueça a mídia preparada a 37 graus Celsius em uma incubadora não regulamentada com dióxido de carbono e coloque o pH em 7,4.Garanta mídia suficiente para o plantio de células e a preparação das soluções de oligomicina e FCCP. Em seguida, projete um layout de placa com um número crescente de células por poço para a otimização ou ensaio executado. Use quatro poços cheios de mídia e injetados com mídia para medições de fundo.Depois de contar as células T preparadas anteriormente, pipeta um número apropriado de células para cada poço da placa de cultura celular XF previamente revestida de acordo com o layout da placa. Para aderir as células T à superfície revestida, centrifugar a placa de cultura celular XF. Em seguida, lave as células com 200 microliters de mídia de ensaio.Descarte a mídia e adicione 180 microliters de mídia de ensaio fresco. Depois de garantir que as células estejam conectadas e distribuídas uniformemente pela superfície do poço, incubar a placa de cultura celular XF a 37 graus Celsius no armário de aquecimento não-dióxido de carbono regulado por 30 minutos. Para a corrida de otimização, prepare soluções de trabalho de oligomicina e FCCP em mídia de ensaio.Em seguida, carregue as soluções de trabalho de oligomicina ou FCCP nas portas de injeção do cartucho do sensor. Certifique-se de que nenhuma porta de injeção contenha apenas ar. Encha todas as portas vazias com mídia de ensaio.Em seguida, remova bolhas potenciais nas portas de injeção batendo suavemente as bordas da placa sobre a mesa. Para a execução do ensaio, prepare uma solução de antimicina A de 20 micromolar. Em seguida, de acordo com o layout da placa, carregue 20 microliters de oligomicina ou FCCP na porta de injeção A do cartucho do sensor, e adicione 22 microliters de antimicina A à porta de injeção B de todos os poços.Em uma corrida representativa de otimização de oligomicina, um patamar na taxa de consumo de oxigênio, ou OCR, é atingido quando a concentração acumulada atinge um micromole. A partir dessa concentração, o OCR não foi mais reduzido. Para as células tratadas com concentrações crescentes do desacoplador FCCP, os níveis de OCR aumentaram até 0,2 micromolar FCCP e, em seguida, atingiram um platô, indicando que o desacoplamento total foi obtido.Em uma corrida representativa de otimização de concentração celular, o OCR inicial para uma corrida com 200.000 células é aproximadamente metade disso, com 400.000 células. Após o tratamento fccp, o OCR máximo é de 61,6 picomoles por minuto para 200.000 células e 190,4 picomoles por minuto para 400.000 células. Após o tratamento da oligomicina, o OCR em execução com 200.000 células entra em colapso em dígitos únicos e é menor do que o da corrida com 400.000 células.Investigar o efeito das citocinas interleucina-2 e interleucina-15 no metabolismo das células T revelou que as células cultivadas interleucina-15 possuíam maior respiração máxima e capacidade respiratória sobressalente. No entanto, a respiração basal e a produção de ATP não foram afetadas. Estudar o metabolismo mitocondrial em células T humanas dá pistas importantes sobre sua durabilidade e potencial de sobrevivência.Isso resulta em maior conhecimento do condicionamento físico das células T e pode, em última análise, melhorar as taxas de resposta à imunoterapia do câncer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Imunologia e Infecção

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Um protocolo otimizado para analisar glicólise e respiração mitocondrial nos linfócitos

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Avaliação da Interface sináptica de células T humano primário do sangue periférico e tecido linfoide

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

No modelo de diferenciação Vitro de células de memória humana Normal B de plasmócitos de vida longa

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Um ensaio de potência em tempo real para células T do receptor de antígeno quimérico visando células cancerosas sólidas e hematológicas

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Infecção pneumocócica de células endotélias humanas primárias em fluxo constante

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...