Name: real-time monitoring of mitochondrial respiration in cytokine-differentiated human primary t cells
Uploaded: 2021-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells at JoVE.com

Каспер Мёльгаард и Анне Рахбех получили гранты от Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Каспер Мёльгаард также получил грант от Børnecancerfonden.

Эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами больницы Херлев и столичного региона Дании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол содержит инструкции как для запуска оптимизации, так и для запуска анализа. Это четко написано в тексте, когда инструкции предназнач?...

<ol>
	<li>vander Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+capacity+is+a+critical+regulator+of+CD8++T+cell+memory+development.">Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development.</a> Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).</li><li>Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+takes+a+breath--new+quantitative+perspectives+on+bioenergetics+and+signal+transduction.">Signaling takes a breath--new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction.</a> Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).</li><li>vander Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+memory+T+cells+have+a+bioenergetic+advantage+that+underlies+their+rapid+recall+ability.">CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).</li><li>Chang, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+control+of+T+cell+effector+function+by+aerobic+glycolysis.">Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis.</a> Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).</li><li>vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+bioenergetics+in+T+cells+using+a+Seahorse+extracellular+flux+analyzer.">Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer.</a> Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).</li><li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li><li>Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+T-cell+reconditioning:+Improving+metabolic+fitness+for+optimal+cancer+immunotherapy.">Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Kenwood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane.">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).</li><li>Alizadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL15+enhances+CAR-T+cell+antitumor+activity+by+reducing+mTORC1+activity+and+preserving+their+stem+cell+memory+phenotype.">IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype.</a> Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).</li></ol>

Детальная и правильная количественная оценка окислительного фосфорилирования является незаменимым инструментом при описании энергетических состояний Т-клеток. Состояние митохондриальной приспособленности может быть напрямую связано с потенциалом активации Т-клеток, выживаемость...

Правильное развитие и функционирование Т-клеток необходимы для способности иммунной системы распознавать и реагировать на антигены. Митохондриальное окислительное фосфорилирование (OxPhos) изменяется в зависимости от состояния Т-клетки. Наивные Т-клетки преимущественно используют OxPhos для производства АТФ, тогда как активированные Т-клетки подвергаются метаболическому переходу, когда гликолиз становится доминирующим1. После эффекторной фазы небольшое оставшееся подмножество Т-клеток памяти возвращается к метаболическому состоянию, в котором доминирует OxPhos2,3. Изменения OxPhos следуют за дифференцировкой Т-клеток до такой степени, что даже подмножества Т-клеток могут быть дифференцированы по их специфическим свойствам OxPhos1. И наоборот, OxPhos важен для функции Т-клеток, и было продемонстрировано, что ингибирование OxPhos блокирует пролиферацию и выработку цитокинов Т-клеток4. Таким образом, способность количественно оценивать свойства Т-клеток OxPhos точным и воспроизводимым образом является мощным инструментом для всех, кто работает с Т-клетками.
В этом протоколе свойства Т-клеток OxPhos измеряются с помощью внеклеточного анализатора потока. Основная функция этого анализатора заключается в непрерывном измерении содержания кислорода в питательных средах анализируемых клеток. Предполагается, что кислород, удаленный из среды роста, поглощается клетками. При обработке клеток различными ингибиторами или модификаторами OxPhos падение поглощения кислорода связано с ингибированной или модулированной функцией. Например, ингибирование АТФ-синтазы приведет к снижению клеточного поглощения кислорода, который в противном случае использовался бы для производства АТФ путем окислительного фосфорилирования. Другое оборудование, включая электрод Кларка и инструмент Oroboros, предлагает аналогичную функциональность, и каждый инструмент имеет разные преимущества и недостатки. Широкий спектр типов клеток может быть использован для исследований в этих устройствах, но одним из особенно сложных типов клеток являются первичные Т-лимфоциты человека5. Из-за их небольшого размера, плохой выживаемости ex vivo и неадгезивных свойств первичные Т-клетки человека могут быть сложными для изучения.
Это протокол для изучения митохондриального дыхания первичных Т-клеток человека с помощью внеклеточного анализатора. Протокол разделен на оптимизационный прогон, где определяются оптимальные концентрации клеточного числа на лунку, а также оптимальная концентрация олигомицина и FCCP. Кроме того, проводится анализ, в котором используются оптимизированные условия.
Используя полученные из крови человеческие PBMCs и ex vivo первичные Т-клеточные культуры, этот протокол демонстрирует важность оптимальной концентрации ингибиторов и актуальность использования отдельных вместо последовательной инъекции митохондриальных ингибиторов при работе с чувствительными типами клеток. Наконец, показано, что этот анализ может надежно обнаруживать тонкие различия в митохондриальном дыхании при поляризации цитокинами IL-2 и IL-15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD3xCD28 beads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11161D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>For coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Heat inactivated at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-15</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>O4876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco-Thermo Fisher</td>
			<td>61870036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M glucose solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100 mM pytuvate solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200 mM glutamine solution</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF RPMI medium, pH7.4</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103576-100</td>
			<td>XF RPMI media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyser</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Flux analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 cell culture microplates</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>XF cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 sensor cartridge</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>36486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2770-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02-060F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse wave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Flux analyzer software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time monitoring of mitochondrial respiration in cytokine-differentiated human primary t cells

Во время активации метаболизм Т-клеток приспосабливается к изменениям, которые влияют на их судьбу. Увеличение митохондриального окислительного фосфорилирования необходимо для активации Т-клеток, а выживание Т-клеток памяти зависит от ремоделирования митохондрий. Следовательно, это влияет на долгосрочный клинический исход иммунотерапии рака. Изменения качества Т-клеток часто изучаются с помощью проточной цитометрии с использованием хорошо известных поверхностных маркеров, а не непосредственно их метаболического состояния. Это оптимизированный протокол для измерения митохондриального дыхания первичных Т-клеток человека в режиме реального времени с использованием анализатора внеклеточного потока и цитокинов IL-2 и IL-15, которые по-разному влияют на метаболизм Т-клеток. Показано, что метаболическое состояние Т-клеток можно четко различить путем измерения потребления кислорода при ингибировании ключевых комплексов в метаболическом пути и что точность этих измерений сильно зависит от оптимальной концентрации ингибитора и стратегии инъекции ингибитора. Этот стандартизированный протокол поможет внедрить митохондриальное дыхание в качестве стандарта для пригодности Т-клеток при мониторинге и изучении иммунотерапии рака.

Правильное определение свойств OxPhos является незаменимым инструментом при изучении Т-клеток. Однако, если условия анализа не были оптимизированы, существует значительный риск введения в заблуждение или ошибочных результатов. В этом протоколе основное внимание уделяется оптимизации к...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells at JoVE.com

Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells

Метаболическая адаптация имеет основополагающее значение для Т-клеток, поскольку она диктует дифференцировку, персистенцию и цитотоксичность. Здесь представлен оптимизированный протокол мониторинга митохондриального дыхания в ex vivo цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека.

Мониторинг митохондриального дыхания в цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека в режиме реального времени

During activation, the metabolism of T cells adapts to changes that impact their fate. An increase in mitochondrial oxidative phosphorylation is ...

Митохондриальный метаболизм является важным регулятором прочности и памяти Т-клеток. Таким образом, измерение митохондриального дыхания дает важное представление о свойствах Т-клеток. Машина Seahorse может измерять различные элементы митохондриального дыхания в режиме реального времени в живых первичных Т-лимфоцитах человека без необходимости какой-либо маркировки.Этот метод очень подходит для мониторинга пригодности Т-клеток и потенциала памяти, которые являются важными предикторами успеха иммунотерапии рака. Для начала промыть шарики CD3/CD28, перенеся 12,5 микролитра бусин на миллион клеток в микроцентрифужную трубку и добавив 12,5 микролитра PBS на 12,5 микролитра шариков в трубке. Затем поместите трубку микроцентрифуги на подходящий магнит на одну минуту, отбросьте буфер и повторно суспендируйте шарики в исходном объеме Т-клеточной среды.Затем добавьте 12,5 микролитров бусин на миллион клеток в соотношении от одного до двух бусин к клеткам и разделите ячейки на два состояния с примерно пятью миллионами клеток в каждой. Затем добавьте правильный объем цитокинов к каждому состоянию и перенесите клетки в многолуночные пластины. Инкубируйте клетки в течение трех дней при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.После трех дней инкубации готовят свежую Т-клеточную среду с удвоенной концентрацией цитокинов. Повторное суспендирование и расщепление клеток путем переноса половины объема из каждой скважины в новую лунку. Затем добавьте в каждую лунку одинаковый объем свежеприготовленной Т-клеточной среды.Для внеклеточного флюса готовят раствор покрытия, содержащий бикарбонат натрия, Cell-Tak и гидроксид натрия. Затем откройте свежую пластину для культивирования клеток XF и добавьте 12 микролитров свежеприготовленного раствора покрытия в каждую лунку, обеспечив равномерное распределение раствора покрытия на дне всех скважин. Инкубировать пластину при комнатной температуре с крышкой в течение 30 минут.Затем выбросьте оставшийся жидкий раствор из всех колодцев. Вымойте пластину 200 микролитрами стерильной воды и выбросьте жидкость. Затем промыть пластину 200 микролитрами стерильного PBS клеточного культурального класса.После выбрасывания жидкости дайте тарелке высохнуть в течение 30 минут при комнатной температуре. Чтобы наложить Т-клетки на пластину культивирования клеток XF, подготовьте 50 миллилитров среды для анализа, смешивая подходящую среду XF RPMI с глюкозой, пируватом и глютамином в соответствии с экспериментальной установкой. Нагрейте подготовленную среду до 37 градусов Цельсия в инкубаторе, не регулируемом углекислым газом, и установите рН на 7,4.Обеспечьте достаточное количество сред для посадки клеток и приготовления растворов олигомицина и FCCP. Затем разработайте макет пластины с увеличением количества ячеек на скважину для оптимизации или прогона анализа. Используйте четыре скважины, заполненные средой и закачанные средой для фоновых измерений.После подсчета Т-клеток, приготовленных ранее, пипеткой распределяют соответствующее количество клеток к каждой лунке ранее покрытой пластины для культивирования клеток XF в соответствии с расположением пластины. Чтобы приклеить Т-клетки к покрытой поверхности, центрифугируйте пластину культуры клеток XF. Затем промыть клетки 200 микролитрами пробирной среды.Отбросьте носитель и добавьте 180 микролитров свежей пробирной среды. Убедившись, что клетки прикреплены и равномерно распределены по поверхности скважины, инкубируйте пластину культуры клеток XF при 37 градусах Цельсия в нагревательном шкафу без углекислого газа в течение 30 минут. Для оптимизации запуска подготовьте рабочие растворы олигомицина и FCCP в пробирных средах.Затем загрузите рабочие растворы олигомицина или FCCP в отверстия для инъекций картриджа датчика. Убедитесь, что ни одно отверстие для впрыска не содержит только воздух. Заполните все пустые порты пробирными носителями.Затем удалите потенциальные пузырьки в отверстиях для инъекций, осторожно выбив края пластины на столе. Для проведения анализа приготовьте 20-микромолярный раствор антимицина А. Затем, в соответствии с компоновкой пластины, загрузите 20 микролитров олигомицина или FCCP в инъекционный порт A картриджа датчика и добавьте 22 микролитра антимицина A в инъекционный порт B всех скважин.В репрезентативном запуске оптимизации олигомицина плато в скорости потребления кислорода, или OCR, достигается, когда аккумулятивная концентрация достигает одного микромоля. Начиная с этой концентрации, OCR не уменьшался дальше. Для клеток, получавших повышенные концентрации разъединителя FCCP, уровни OCR увеличивались до 0,2 микромолярного FCCP, а затем достигали плато, что указывает на получение полного разъединения.В репрезентативном запуске оптимизации концентрации клеток начальный OCR для прогона с 200 000 клеток составляет примерно половину от этого, с 400 000 клеток. После лечения FCCP максимальный OCR составляет 61,6 пикомолей в минуту для 200 000 клеток и 190,4 пикомолей в минуту для 400 000 клеток. После лечения олигомицином OCR в беге с 200 000 клеток сворачивается в однозначные цифры и ниже, чем в беге с 400 000 клеток.Исследование влияния цитокинов интерлейкина-2 и интерлейкина-15 на метаболизм Т-клеток выявило, что культивируемые интерлейкин-15 клетки обладали более высоким максимальным дыханием и запасной дыхательной способностью. Однако базальное дыхание и выработка АТФ не пострадали. Изучение митохондриального метаболизма в Т-клетках человека дает важные подсказки об их долговечности и потенциале выживания.Это приводит к расширению знаний о пригодности Т-клеток и может в конечном итоге улучшить показатели ответа на иммунотерапию рака.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Генерация индуцированного регуляторных Т клеток из первичной человека наивного и Т-клеток памяти

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

PiggyBac транспозонов модификации системы первичной Т-клетках человека

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

В режиме реального времени Живая съемка Т-клеточного сигнального комплекса Формирование

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Количественный<em&gt; В пробирке</em&gt; Анализе на определение адгезию нейтрофилов к активированным Первичные человеческие эндотелиальные клетки микрососудов в статических условиях

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Оптимизированный протокол для анализа гликолиза и митохондриального дыхания в лимфоцитах

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Оценка синаптических интерфейса первичного человека Т-клеток в периферической крови и лимфоидной ткани

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

В модели дифференциации in Vitro клеток человека обычной памяти B для долгоживущих клеток плазмы

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

В режиме реального времени потенции Асса для химерных антигенов рецепторов T клеток ориентации твердых и гематологических раковых клеток

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Пневмококк инфекция первичных эндотелиальных клеток человека в постоянном потоке

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...