Name: flow cytometric analysis for identification of the innate and adaptive immune cells of murine lung
Uploaded: 2021-11-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud R01CA238263 og R01CA229784 (VAB).

Alle undersøgelser og eksperimenter beskrevet i denne protokol blev udført under retningslinjer i henhold til Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Beth Israel Deaconess Medical Center. Seks til ti uger gamle C57BL/6 mus af begge køn blev brugt til at udvikle denne protokol.
1. Kirurgisk udskæring og vævsforberedelse
<ol><li>Aflive musen ved intraperitonealt at injicere 1 ml tribromethanol (fremstillet i henhold til standardprotokollen; Tabel over materialer</s...

<ol>
	<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF.">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li><li>Tan, S. Y., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+of+lung+macrophage+diversity.">Developmental origin of lung macrophage diversity.</a> Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).</li><li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung.">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).</li><li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state.">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li><li>Ural, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nerve-associated,+lung-resident+interstitial+macrophage+subset+with+distinct+localization+and+immunoregulatory+properties.">Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties.</a> Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).</li><li>Chakarov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+interstitial+macrophage+populations+coexist+across+tissues+in+specific+subtissular+niches.">Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches.</a> Science. 363 (6432), (2019).</li><li>Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interstitial+macrophage:+A+long-neglected+piece+in+the+puzzle+of+lung+immunity.">The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity.</a> Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).</li><li>Stouch, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaB+kinase+activity+drives+fetal+lung+macrophage+maturation+along+a+non-M1/M2+paradigm.">IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm.</a> Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).</li><li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells.">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).</li><li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+and+monocyte-derived+CD11b(+)+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen.">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+trafficking+and+function+in+rare+lung+diseases.">Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).</li><li>Cook, P. C., MacDonald, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+lung+immunopathology.">Dendritic cells in lung immunopathology.</a> Seminars in Immunopathology. 38, 449-460 (2016).</li><li>Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+between+lung+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+defense+against+pulmonary+infections.">Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections.</a> Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).</li><li>Nobs, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR&#947;+in+dendritic+cells+and+T+cells+drives+pathogenic+type-2+effector+responses+in+lung+inflammation.">PPAR&#947; in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).</li><li>Aegerter, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza-induced+monocyte-derived+alveolar+macrophages+confer+prolonged+antibacterial+protection.">Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection.</a> Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).</li><li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung.">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).</li><li>Hoffmann, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+interaction+of+murine+pulmonary+phagocytes+in+the+naive+and+allergic+lung.">Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Mesnil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-resident+eosinophils+represent+a+distinct+regulatory+eosinophil+subset.">Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).</li><li>Zaynagetdinov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+myeloid+cell+subsets+in+murine+lungs+using+flow+cytometry.">Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).</li><li>Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+self-limited+acute+lung+injury+by+unilateral+intra-bronchial+acid+instillation.">A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Krishnamoorthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+cytoplasts+induce+TH17+differentiation+and+skew+inflammation+toward+neutrophilia+in+severe+asthma.">Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma.</a> Science Immunology. 3 (26), (2018).</li><li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3+CD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire.">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+natural+killer+cells+in+mice:+phenotype+and+response+to+respiratory+infection.">Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection.</a> Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).</li><li>Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+CD4-CD8-+double-negative+T+cells+are+prominent+producers+of+IL-17A+and+IFN-gamma+during+primary+respiratory+murine+infection+with+Francisella+tularensis+live+vaccine+strain.">Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain.</a> Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).</li><li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V., Alper, S., Janssen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mononuclear+phagocytes+in+the+mouse+lung+and+lymph+nodes.+In+Lung+innate+immunity+and+inflammation.">Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation.</a> Methods in Molecular Biology. 1809, (2018).</li><li>Singer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+method+for+simultaneous+analysis+of+mouse+lung+epithelial,+endothelial,+and+hematopoietic+lineage+cells.">Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).</li><li>Matsushima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD248+and+integrin+alpha-8+are+candidate+markers+for+differentiating+lung+fibroblast+subtypes.">CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes.</a> BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).</li><li>Cong, J., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+in+the+lungs.">Natural killer cells in the lungs.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1416 (2019).</li><li>Daubeuf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast,+easy,+and+customizable+eight-color+flow+cytometric+method+for+analysis+of+the+cellular+content+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+the+mouse.">A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).</li><li>Yi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+recruitment+is+dynamically+regulated+by+interplay+among+lung+dendritic+cell+subsets+after+allergen+challenge.">Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge.</a> Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).</li><li>Langlet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD64+expression+distinguishes+monocyte-derived+and+conventional+dendritic+cells+and+reveals+their+distinct+role+during+intramuscular+immunization.">CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization.</a> Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).</li><li>Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+Ccr7+expression+in+distinct+lineages+of+lung+dendritic+cells.">Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).</li><li>Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+interstitial+macrophages:+past,+present,+and+future.">Lung interstitial macrophages: past, present, and future.</a> Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).</li><li>Krljanac, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELMalpha-expressing+macrophages+protect+against+fatal+lung+damage+and+reduce+parasite+burden+during+helminth+infection.">RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection.</a> Science Immunology. 4 (35), (2019).</li><li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis.">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li><li>Svedberg, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+environment+controls+alveolar+macrophage+metabolism+and+responsiveness+in+type+2+inflammation.">The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation.</a> Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).</li><li>Yona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+origins+and+dynamics+of+monocytes+and+tissue+macrophages+under+homeostasis.">Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis.</a> Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).</li><li>Misharin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span.">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).</li><li>Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Interstitial+Macrophages:+Establishing+Identity+and+Uncovering+Heterogeneity.">Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).</li></ol>

Identifikation af lungeimmunceller kan være udfordrende på grund af de mange immuncelletyper, der bor i lungen og deres unikke immunophenotypiske egenskaber sammenlignet med deres modparter, der bor i andre væv. Under flere patologiske tilstande forekommer celler med forskellige fænotypiske træk i lungerne. For eksempel resulterer bleomycin-induceret lungeskade i rekruttering af cirkulerende monocytafledte makrofager i det alveolære rum, hvor de kan forblive i så længe som et år og endda fortsætte efter bleomyc...

Murine luftvejene indeholder et unikt immunsystem, der er ansvarligt for at bekæmpe patogener og opretholde immunhomeostase. Lungeimmunsystemet består af cellulære populationer med signifikant heterogenitet i deres fænotype, funktion, oprindelse og placering. Residente alveolære makrofager (AMs), der hovedsagelig stammer fra føtale monocytter, befinder sig i det alveolære lumen1, mens knoglemarvsafledte interstitielle makrofager (IM'er) befinder sig i lungeparenchyma2. IM'er kan yderligere underklassificeres ved hjælp af udtrykket CD206. CD206+ IM'er befolker det peribronchiale og perivaskulære område, mens CD206- IM'er er placeret ved det alveolære interstitium3. Et par underklassifikationer af IM'er er blevet foreslået for nylig3,4,5,6. Selvom IM'er er mindre undersøgt end AMs, understøtter de seneste beviser deres afgørende rolle i reguleringen af immunsystemet i lungen7. Derudover udtrykkes CD206 også i alternativt aktiverede AMs8.
Pulmonale dendritiske celler (LLC'er) er en anden heterogen gruppe af lungeimmunceller med hensyn til deres funktionelle egenskaber, placering og oprindelse. Fire underkategorier af DC'er er blevet beskrevet i lungen: konventionelle CD103 + DC'er (også kendt som cDC1), konventionelle CD11b + DC'er (også kendt som cDC2), monocytafledte DC'er (MoDC'er) og plasmacytoid DC'er9,10,11,12,13. De første tre underklasser kan defineres som major histocompatibility complex (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Plasmacytoid-DCs udtrykker MHC II og er mellemliggende positive for CD11c, men udtrykker høje niveauer af B220 og PDCA-19,13,16. I naive murinlunger er CD103DC'er og CD11bDC'er placeret i luftvejsinterstitiumet, mens plasmacytoid-LLC'er er placeret i det alveolære interstitium17.
To store populationer af monocytter befinder sig i lungen under steady state: klassiske monocytter og ikke-klassiske monocytter. Klassiske monocytter er Ly6C + og er kritiske for det indledende inflammatoriske respons. I modsætning hertil er ikke-klassiske monocytter Ly6C- og er blevet bredt betragtet som antiinflammatoriske celler3,16,18. For nylig blev en yderligere population af CD64 + CD16.2+ monocytter beskrevet, som stammer fra Ly6C-monocytter og giver anledning til CD206+ IMs3.
Eosinofiler forekommer hovedsageligt i lungerne under helminthinfektion eller allergiske tilstande. Der er dog et lille antal eosinofiler i lungeparenchymen under steady state, kendt som bosiddende eosinofiler. I modsætning til de bosiddende eosinofiler findes inflammatoriske eosinofiler i lungeinterstitium og bronchoalveolær skylning (BAL). I musemodeller af husstøvmide (HDM) rekrutteres inflammatoriske eosinofiler i lungen efter antigenmedieret stimulering. Det er blevet foreslået, at hjemmehørende eosinofiler kan have en regulerende rolle i allergi ved at hæmme T-hjælper 2 (Th2) sensibilisering over for HDM19.
I modsætning til resten af lunge myeloide celler udtrykker neutrofiler Ly6G, men ikke CD68 og er kendetegnet ved en signatur af CD68-Ly6G + immunophenotype16,20,21. Visualiseringsundersøgelser har vist, at lungen under steady state reserverer en pulje neutrofiler i det intravaskulære rum og er vært for et betydeligt antal ekstravaskulære neutrofiler22. I lighed med eosinofiler findes neutrofiler ikke i BAL ved steady state; Imidlertid driver flere former for immunstimulering, såsom LPS-udfordring, astma eller lungebetændelse, neutrofiler ind i det alveolære lumen, hvilket resulterer i deres tilstedeværelse i BAL21,22,23.
Et betydeligt antal CD45+-celler i lungen repræsenterer naturlige dræberceller (NK), T-celler og B-celler og er negative for de fleste myeloide markører24. I lungerne hos naive mus kan disse tre celletyper identificeres ud fra ekspressionen af CD11b og MHC II18. Omkring 25% af lunge-CD45+ cellerne er B-celler, mens procentdelen af NK-celler er højere i lungen end andre lymfoide og ikke-lymfoide væv24,25,26. Blandt lunge-T-celler er en betydelig brøkdel CD4-CD8- og spiller en vigtig rolle i luftvejsinfektioner26.
Fordi lungen er vært for et meget komplekst og unikt immunsystem, er der udviklet og rapporteret flere gating strategier til identifikation af lungeimmunceller16,18,20,27. Gating-strategien beskrevet heri giver en omfattende og reproducerbar måde at identificere op til 12 forskellige lunge myeloide og ikke-myeloide immunpopulationer ved hjælp af 9 markører. Yderligere markører er blevet brugt til at validere resultaterne. Desuden er der tilvejebragt en detaljeret metode til fremstilling af en enkeltcellesuspension, der minimerer celledød og muliggør identifikation af den mest komplette profil af lungens immuncellerum. Det skal bemærkes, at identifikationen af ikke-immune celler i lungen, såsom epitelceller (CD45-CD326 + CD31-), endotelceller (CD45-CD326-CD31+) og fibroblaster kræver en anden tilgang28,29. Identifikation af sådanne populationer er ikke inkluderet i protokollen og metoden beskrevet her.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringe plunger</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon/corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101215</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117339 / 117337</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103115</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD64</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139319</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD68</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>137009</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse GR-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108433</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Siglec F</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>155503</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVERTIN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103228</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121405 / 121419</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>138503</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100205</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 1</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>149005</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123133</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcBlock (CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101301</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Serrated Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Futura Safety Scalpel</td>
			<td>Merit Medical Systems</td>
			<td>SMS210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L34973</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERTK</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>151505</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC-II</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107621</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108705</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>SORVAL ST 16R</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small curved scissor</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis for identification of the innate and adaptive immune cells of murine lung

Luftvejene er i direkte kontakt med det ydre miljø og kræver et præcist reguleret immunsystem for at yde beskyttelse, samtidig med at uønskede reaktioner på miljøantigener undertrykkes. Lunger er vært for flere populationer af medfødte og adaptive immunceller, der giver immunovervågning, men også formidler beskyttende immunresponser. Disse celler, som holder det sunde lungeimmunsystem i balance, deltager også i flere patologiske tilstande som astma, infektioner, autoimmune sygdomme og kræft. Selektiv ekspression af overflade- og intracellulære proteiner giver unikke immunofænotypiske egenskaber til lungens immunceller. Følgelig har flowcytometri en instrumentel rolle i identifikationen af sådanne cellepopulationer under steady-state og patologiske tilstande. Dette papir præsenterer en protokol, der beskriver en konsekvent og reproducerbar metode til at identificere de immunceller, der befinder sig i lungerne hos raske mus under steady-state betingelser. Denne protokol kan dog også bruges til at identificere ændringer i disse cellepopulationer i forskellige sygdomsmodeller for at hjælpe med at identificere sygdomsspecifikke ændringer i lungeimmunlandskabet.

Gating strategi Det første skridt i vores gating-strategi er udelukkelsen af snavs og doublets (figur 1A). Omhyggelig udelukkelse af doublets er afgørende for at undgå falsk-positive populationer (supplerende figur S2). Derefter identificeres immunceller ved hjælp af CD45 +, en markør for hæmatopoietiske celler (figur 1B). Den levende-døde plet kan tilføjes for at udelukke døde celler. Denne protokol resul...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

I denne undersøgelse præsenterer vi en effektiv og reproducerbar protokol til at isolere immunpopulationerne i murine åndedrætssystemet. Vi leverer også en metode til identifikation af alle medfødte og adaptive immunceller, der befinder sig i lungerne hos raske mus, ved hjælp af et 9-farvebaseret flowcytometripanel.

Flowcytometrisk analyse til identifikation af de medfødte og adaptive immunceller i Murine Lung

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

Fordi lungen er vært for et meget komplekst og unikt immunsystem, er der udviklet og rapporteret flere gating strategier til identifikation af lungeimmunceller. Eksistensen af flere forskellige tilgange gør det vanskeligt at sammenligne resultater genereret af forskellige laboratorier. Vores gating-strategi giver en omfattende og reproducerbar måde at identificere op til 12 forskellige lunge myeloide og ikke-myeloide immunpopulationer ved hjælp af ni markører.Den nuværende protokol beskriver karakterisering og identifikation af lungeimmunpopulationer under steady-state betingelser. Denne protokol kan dog anvendes til at identificere ændringer af disse cellepopulationer i forskellige sygdomsmodeller, hvor den kan hjælpe med at identificere sygdomsspecifikke ændringer i lungeimmunlandskabet. Efterforskere, der udfører denne teknik for første gang, bør være opmærksomme på fordøjelsesbetingelserne og reagenserne, da de gør en stor forskel i frigivelsen af immunceller fra lungevævet.Begynd med at forberede det aflivede dyr til operation. Stabiliser musen dorsalt ved hjælp af nåle eller tape på de fire ekstremiteter, og brug derefter 70% ethanol til at rense huden i det ventrale område. Lav et snit fra nakken til maven.Fjern huden fra brystområdet sammen med ribbenene og brystbenet. Skyl lungerne ved at injicere 10 ml kold PBS i højre ventrikel ved hjælp af en 18 til 21-gauge nål, indtil de bliver helt hvide. Fjern derefter thymus og hjerte uden at røre lungerne.Fjern lungerne fra det omgivende væv og overfør dem til et rør, der indeholder kold BSA-buffer. Overfør lungen til en petriskål, hak den ved hjælp af to fine skalpeller, og læg den derefter i et 50 ml konisk rør. Tilsæt fem milliliter fordøjelsesbuffer for at vaske pladen.Fastgør låget på røret og fordøje lungen i 30 minutter på en orbital shaker med en hastighed på 150 rotationer i minuttet ved 37 grader Celsius. Stop reaktionen ved at tilsætte 10 ml kold BSA-buffer. Efter fordøjelsen blandes og opløses lungestykkerne ved hjælp af en 18-gauge nål.Placer en 70 mikrometer filtersil oven på et nyt 50 ml konisk rør og overfør den fordøjede lungeblanding til silen. Brug gummisiden af et 10 ml sprøjtestempel til at smadre de resterende lungestykker på filteret og vask det med BSA-buffer. Centrifugering af enkeltcellesuspensionen ved 350 G i otte minutter ved syv grader Celsius.Kassér supernatanten og resuspend cellerne i en milliliter ACK lysis buffer. Bland suspensionen ved hjælp af en pipette på 1 milliliter og inkuber den i 90 sekunder ved stuetemperatur. Tilsæt 10 ml kold BSA-buffer til reaktionsblandingen og centrifuger den ved 350 G i syv minutter ved fire grader Celsius.Kassér supernatanten, brug pillen igen i farvningsbuffer, og tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Resuspend cellerne i en koncentration på 5 millioner celler pr. Milliliter til overfladefarvning. Overfør 1 million celler i 200 mikroliter pr. brønd til en plade med 96 brønde og centrifuger pladen ved 350 G i syv minutter ved fire grader Celsius.Forbered en flowcytometriblokopløsning ved at fortynde anti-1632-antistof i farvningsbuffer. Resuspend cellerne i 50 mikroliter af flowcytometriblokopløsningen. Inkuber suspensionen i 15 til 20 minutter ved fire grader for Celsius eller på is.Derefter tilsættes 150 mikroliter farvningsbuffer til pladen og centrifugeres 350 G i fem minutter ved fire grader Celsius. Forbered overfladeantistofopløsning ved at fortynde overfladeantistofferne i farvningsbuffer. Resuspend cellerne i 50 mikroliter af overfladeantistofopløsningen og inkubere pladen ved fire grader Celsius i mørket.Vask derefter cellerne to gange med farvningsbuffer. Forbered fikserings- og permeabiliseringsbufferen ved at blande tre dele fikserings- og permeabilisationsfortyndingsfortyndende og en del farvningsbuffer. Resuspend cellerne i 50 mikroliter af den præparerede buffer pr. Brønd af 96-brøndspladen og inkuber dem i 20 til 25 minutter ved fire grader Celsius i mørket.Fortynd permeabiliseringsbufferen med renset deioniseret vand for at forberede en gange permeabiliseringsbuffer og brug den til at vaske cellerne. Forbered en intracellulær antistofopløsning ved fortynding med en milliliter permeabiliseringsbuffer. Resuspend cellerne i 50 mikroliter af den fortyndede intracellulære antistofopløsning pr. Brønd af 96-brøndspladen og inkuber i 40 minutter ved fire grader Celsius i mørket.Vask cellerne med permeabiliseringsbuffer og derefter med farvningsbuffer. Efter den endelige vask skal cellerne suspenderes igen i 200 mikroliter farvningsbuffer. Anskaf mindst 1,5 millioner celler pr. prøve på flowcytometeret.Efter en vellykket operation og passende postoperativ procedure blev snavs og doublets udelukket gennem en gating-strategi. Immunceller blev identificeret ved hjælp af CD45 + hæmatopoietisk markør via flowcytometri. Cellerne blev skelnet som levende eller døde.Immunlungecellerne blev kategoriseret i tre grupper ved hjælp af anti-GR-1 og anti-CD68 antistoffer. Neutrofiler blev identificeret og verificeret ved hjælp af Ly6G som en unik markør. CD45 + populationen indeholder også naturlige dræberceller, T-celler og B-celler.Disse celler blev farvet og verificeret af naturlige dræber 1.1, CD3 og B220 antistoffer. Den bronchoalveolære skylning identificerede eosinofiler, som var positive for CD11b-markøren, og alveolære makrofager, der ikke udtrykte høje niveauer af CD11b. CD45 + dendritiske celler blev fundet og bekræftet ved CD24-ekspression.Disse celler viste enten et positivt eller negativt respons mod CD103- og CD11b-markører. CD103-negative celler blev klassificeret som konventionelle og monocytafledte dendritiske celler baseret på CD64-ekspression. de monocytafledte dendritiske celler var lavt positive for CD24 dendritiske markør og positive for CD64 pan-makrofagmarkøren.Interstitielle makrofager med klassiske og ikke-klassiske monocytter blev skelnet baseret på CD64 og GR-1 udtryk. Disse celler viste positiv ekspression for CX3C kemokinreceptor en. De vigtigste trin i denne procedure er korrekt vævshøstning, fordøjelse og forberedelse af enkeltcellesuspension og gating på levende celler og singlets.Ud over at karakterisere immunceller i lungen ved flowcytometri kan cellekultur og funktionelle assays udføres i isolerede cellepopulationer. Denne teknik kan bane vejen for forskere til at udforske nye spørgsmål i lungesygdomme, såsom infektioner, autoimmune sygdomme og kræft.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrisk Isolering af primære murine type II alveolære epitelceller for Funktionelle og molekylære studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Brug af RNA-interferens Undersøge Innate immunresponset i musemakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolering og flowcytometrisk analyse af immunceller fra iskæmisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering og flowcytometrianalyse gliom-infiltrerende perifere mononukleære blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolering og Flowcytometrisk karakterisering af murine Lille Intestinal Lymfocytter

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse of Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant fuldblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolering og flowcytometrisk analyse for Human endocervikale Gamma Delta T-celler

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolering og identifikation af ekstravaskulære immunceller af hjertet

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Fordøjelsen af Murine leveren en Flow Cytometric analyse af lymfatisk Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...