Name: flow cytometric analysis for identification of the innate and adaptive immune cells of murine lung
Uploaded: 2021-11-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01CA238263 ו R01CA229784 (VAB).

כל המחקרים והניסויים המתוארים בפרוטוקול זה נערכו תחת הנחיות על פי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של המרכז הרפואי בית ישראל דיקונס. עכברי C57BL/6 בני שישה עד עשרה שבועות משני המינים שימשו לפיתוח פרוטוקול זה.
1. כריתה כירורגית והכנת רקמות
<ol><li>המתת חסד לעכבר על ידי ?...

<ol>
	<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF.">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li><li>Tan, S. Y., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+of+lung+macrophage+diversity.">Developmental origin of lung macrophage diversity.</a> Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).</li><li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung.">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).</li><li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state.">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li><li>Ural, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nerve-associated,+lung-resident+interstitial+macrophage+subset+with+distinct+localization+and+immunoregulatory+properties.">Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties.</a> Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).</li><li>Chakarov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+interstitial+macrophage+populations+coexist+across+tissues+in+specific+subtissular+niches.">Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches.</a> Science. 363 (6432), (2019).</li><li>Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interstitial+macrophage:+A+long-neglected+piece+in+the+puzzle+of+lung+immunity.">The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity.</a> Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).</li><li>Stouch, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaB+kinase+activity+drives+fetal+lung+macrophage+maturation+along+a+non-M1/M2+paradigm.">IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm.</a> Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).</li><li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells.">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).</li><li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+and+monocyte-derived+CD11b(+)+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen.">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+trafficking+and+function+in+rare+lung+diseases.">Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).</li><li>Cook, P. C., MacDonald, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+lung+immunopathology.">Dendritic cells in lung immunopathology.</a> Seminars in Immunopathology. 38, 449-460 (2016).</li><li>Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+between+lung+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+defense+against+pulmonary+infections.">Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections.</a> Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).</li><li>Nobs, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR&#947;+in+dendritic+cells+and+T+cells+drives+pathogenic+type-2+effector+responses+in+lung+inflammation.">PPAR&#947; in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).</li><li>Aegerter, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza-induced+monocyte-derived+alveolar+macrophages+confer+prolonged+antibacterial+protection.">Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection.</a> Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).</li><li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung.">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).</li><li>Hoffmann, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+interaction+of+murine+pulmonary+phagocytes+in+the+naive+and+allergic+lung.">Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Mesnil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-resident+eosinophils+represent+a+distinct+regulatory+eosinophil+subset.">Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).</li><li>Zaynagetdinov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+myeloid+cell+subsets+in+murine+lungs+using+flow+cytometry.">Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).</li><li>Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+self-limited+acute+lung+injury+by+unilateral+intra-bronchial+acid+instillation.">A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Krishnamoorthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+cytoplasts+induce+TH17+differentiation+and+skew+inflammation+toward+neutrophilia+in+severe+asthma.">Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma.</a> Science Immunology. 3 (26), (2018).</li><li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3+CD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire.">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+natural+killer+cells+in+mice:+phenotype+and+response+to+respiratory+infection.">Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection.</a> Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).</li><li>Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+CD4-CD8-+double-negative+T+cells+are+prominent+producers+of+IL-17A+and+IFN-gamma+during+primary+respiratory+murine+infection+with+Francisella+tularensis+live+vaccine+strain.">Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain.</a> Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).</li><li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V., Alper, S., Janssen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mononuclear+phagocytes+in+the+mouse+lung+and+lymph+nodes.+In+Lung+innate+immunity+and+inflammation.">Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation.</a> Methods in Molecular Biology. 1809, (2018).</li><li>Singer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+method+for+simultaneous+analysis+of+mouse+lung+epithelial,+endothelial,+and+hematopoietic+lineage+cells.">Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).</li><li>Matsushima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD248+and+integrin+alpha-8+are+candidate+markers+for+differentiating+lung+fibroblast+subtypes.">CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes.</a> BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).</li><li>Cong, J., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+in+the+lungs.">Natural killer cells in the lungs.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1416 (2019).</li><li>Daubeuf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast,+easy,+and+customizable+eight-color+flow+cytometric+method+for+analysis+of+the+cellular+content+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+the+mouse.">A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).</li><li>Yi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+recruitment+is+dynamically+regulated+by+interplay+among+lung+dendritic+cell+subsets+after+allergen+challenge.">Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge.</a> Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).</li><li>Langlet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD64+expression+distinguishes+monocyte-derived+and+conventional+dendritic+cells+and+reveals+their+distinct+role+during+intramuscular+immunization.">CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization.</a> Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).</li><li>Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+Ccr7+expression+in+distinct+lineages+of+lung+dendritic+cells.">Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).</li><li>Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+interstitial+macrophages:+past,+present,+and+future.">Lung interstitial macrophages: past, present, and future.</a> Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).</li><li>Krljanac, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELMalpha-expressing+macrophages+protect+against+fatal+lung+damage+and+reduce+parasite+burden+during+helminth+infection.">RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection.</a> Science Immunology. 4 (35), (2019).</li><li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis.">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li><li>Svedberg, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+environment+controls+alveolar+macrophage+metabolism+and+responsiveness+in+type+2+inflammation.">The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation.</a> Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).</li><li>Yona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+origins+and+dynamics+of+monocytes+and+tissue+macrophages+under+homeostasis.">Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis.</a> Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).</li><li>Misharin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span.">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).</li><li>Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Interstitial+Macrophages:+Establishing+Identity+and+Uncovering+Heterogeneity.">Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).</li></ol>

זיהוי של תאי מערכת החיסון הריאתית יכול להיות מאתגר בגלל סוגי תאי החיסון המרובים המתגוררים בריאה ומאפייניהם החיסוניים הייחודיים בהשוואה למקביליהם המתגוררים ברקמות אחרות. במספר מצבים פתולוגיים, תאים עם תכונות פנוטיפיות ברורות מופיעים בריאות. לדוגמה, פגיעה ריאות הנגרמת על ידי בלומיצין גו?...

דרכי הנשימה של מורין מכילות מערכת חיסונית ייחודית האחראית למלחמה בפתוגנים ולשמירה על הומאוסטזיס חיסוני. מערכת החיסון הריאתית מורכבת מאוכלוסיות תאיות עם הטרוגניות משמעותית בפנוטיפ, בתפקוד, במקור ובמיקום שלהן. מקרופאגים מכתשיים מקומיים (AMs), שמקורם בעיקר במונוציטים עובריים, שוכנים בלומן מכתשי1, בעוד שמקרופגים ביניים (IMs) שמקורם במח העצם שוכנים בפרנצ'ימה הריאה2. הודעות מיידיות יכולות להיות מסווגות עוד יותר על-ידי הביטוי של CD206. CD206+ IMs מאכלסים את אזור הפריברונכיאל והפריקולרי, בעוד ש- CD206- IMs ממוקמים באינטרסטיטיום מכתשי3. כמה מחלקות משנה של הודעות מיידיות הוצעו לאחרונה3,4,5,6. למרות IMs נחקרים פחות מאשר AMs, ראיות אחרונות תומכות בתפקיד המכריע שלהם בוויסות המערכת החיסונית של הריאה7. בנוסף, CD206 מתבטא גם ב- AMs8 המופעלים באופן חלופי.
תאי דנדריטי ריאתי (DCs) הם קבוצה הטרוגנית נוספת של תאי מערכת החיסון של הריאות ביחס למאפיינים התפקודיים שלהם, מיקומם ומוצאם. ארבע קטגוריות משנה של DCs תוארו בריאה: CD103 + DCs קונבנציונליים (הידועים גם בשם cDC1), CD11b + DCs קונבנציונליים (הידועים גם בשם cDC2), בקרי DC (MoDCs) שמקורם במונוציטים ו- DC של פלסמציטויד9,10,11,12,13. ניתן להגדיר את שלוש מחלקות המשנה הראשונות כתרכובת היסטו-תאימות מרכזית (MHC) II +CD11c+9,10,14,15. מחשבי DCs פלזמה מבטאים MHC II והם חיוביים באופן ביניים עבור CD11c אך מבטאים רמות גבוהות של B220 ו- PDCA-19,13,16. בריאות מורין נאיביות, CD103 DCs ו- CD11b DCs ממוקמים interstitium דרכי הנשימה, בעוד DCs plasmacytoid ממוקמים interstitium מכתשי17.
שתי אוכלוסיות עיקריות של מונוציטים שוכנות בריאה במצב יציב: מונוציטים קלאסיים ומונוציטים לא קלאסיים. מונוציטים קלאסיים הם Ly6C+ והם קריטיים לתגובה הדלקתית הראשונית. לעומת זאת, מונוציטים לא קלאסיים הם Ly6C- והם נתפסו באופן נרחב כתאים אנטי דלקתיים3,16,18. לאחרונה תוארה אוכלוסייה נוספת של מונוציטים CD64+CD16.2+CD16.2+, שמקורם ב- Ly6C- מונוציטים ומעוררים CD206 + IMs3.
אאוזינופילים מופיעים בעיקר בריאות במהלך זיהום הלמינת או תנאים אלרגיים. עם זאת, יש מספר קטן של אאוזינופילים בפרנצ'ימה ריאתית במהלך מצב יציב, המכונה אאוזינופילים תושב. בניגוד לאאוזינופילים המקומיים, אאוזינופילים דלקתיים נמצאים באינטרסטיטיום הריאות ובשטיפה סימפונלבולרית (BAL). במודלים של עכבר של קרדית אבק הבית (HDM), אאוזינופילים דלקתיים מגויסים לריאה לאחר גירוי בתיווך אנטיגן. הוצע כי אאוזינופילים תושב עשוי להיות תפקיד רגולטורי באלרגיה על ידי עיכוב T helper 2 (Th2) רגישות HDM19.
בניגוד לשאר תאי המיאלואידים הריאתיים, נויטרופילים מבטאים Ly6G אך לא CD68 ומאופיינים בחתימה של ה- CD68-Ly6G + אימונופנוטיפ16,20,21. מחקרי הדמיה הראו כי במהלך מצב יציב, הריאה שומרת מאגר של נויטרופילים בתא התוך וסקולרי ומארחת מספר ניכר של נויטרופילים חוץ וסקולריים22. בדומה לאאוזינופילים, נויטרופילים אינם נמצאים ב- BAL במצב יציב; עם זאת, מספר צורות של גירוי חיסוני, כגון אתגר LPS, אסטמה, או דלקת ריאות, לנהוג נויטרופילים לתוך לומן מכתשי, וכתוצאה מכך נוכחותם BAL21,22,23.
מספר משמעותי של תאי CD45+ של הריאה מייצגים רוצח טבעי (NK), תאי T ותאי B והם שליליים עבור רוב סמני המיאלואידים24. בריאות של עכברים נאיביים, ניתן לזהות את שלושת סוגי התאים האלה בהתבסס על הביטוי של CD11b ו- MHC II18. כ-25% מתאי CD45+ הריאתיים הם תאי B, בעוד שאחוז תאי ה-NK גבוה יותר בריאה מאשר רקמות לימפואידיות ולא לימפואידיות אחרות24,25,26. בקרב תאי T ריאתיים, שבר ניכר הוא CD4-CD8- וממלא תפקיד חשוב בזיהומים בדרכי הנשימה26.
מכיוון שהריאה מארחת מערכת חיסונית מורכבת וייחודית מאוד, פותחו מספר אסטרטגיות gating לזיהוי תאי מערכת החיסון של הריאות ודווחו על 16,18,20,27. אסטרטגיית ההמצאה המתוארת במסמך זה מספקת דרך מקיפה וניתנת לשחזור לזהות עד 12 אוכלוסיות מיאלואידיות ריאתיות שונות ומערכת חיסונית לא מיאלואידית באמצעות 9 סמנים. סמנים נוספים שימשו לאימות התוצאות. יתר על כן, שיטה מפורטת מסופקת להכנת השעיה של תא יחיד הממזערת את מוות התאים ומאפשרת זיהוי של הפרופיל השלם ביותר של תא התא החיסוני של הריאה. יש לציין כי זיהוי של תאים שאינם חיסוניים של הריאה, כגון תאי אפיתל (CD45-CD326 +CD31-), תאי אנדותל (CD45-CD326-CD31+), ופיברובלסטים דורש גישה שונה 28,29. זיהוי אוכלוסיות כאלה אינו כלול בפרוטוקול ובשיטה המתוארים כאן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringe plunger</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon/corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101215</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117339 / 117337</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103115</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD64</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139319</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD68</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>137009</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse GR-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108433</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Siglec F</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>155503</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVERTIN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103228</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121405 / 121419</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>138503</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100205</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 1</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>149005</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123133</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcBlock (CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101301</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Serrated Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Futura Safety Scalpel</td>
			<td>Merit Medical Systems</td>
			<td>SMS210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L34973</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERTK</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>151505</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC-II</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107621</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108705</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>SORVAL ST 16R</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small curved scissor</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis for identification of the innate and adaptive immune cells of murine lung

מערכת הנשימה נמצאת במגע ישיר עם הסביבה החיצונית ודורשת מערכת חיסונית מוסדרת במדויק כדי לספק הגנה תוך דיכוי תגובות לא רצויות לאנטיגנים סביבתיים. הריאות מארחות מספר אוכלוסיות של תאי חיסון מולדים ומסתגלים המספקים מעקב חיסוני אך גם מתווכים בתגובות חיסוניות מגנות. תאים אלה, השומרים על איזון מערכת החיסון הריאתית הבריאה, משתתפים גם במספר מצבים פתולוגיים כגון אסתמה, זיהומים, מחלות אוטואימוניות וסרטן. ביטוי סלקטיבי של חלבונים פנימיים ותאיים מספק תכונות חיסוניות ייחודיות לתאי החיסון של הריאה. כתוצאה מכך, לציטומטריית זרימה יש תפקיד אינסטרומנטלי בזיהוי אוכלוסיות תאים כאלה במהלך מצב יציב ותנאים פתולוגיים. מאמר זה מציג פרוטוקול המתאר שיטה עקבית וניתנת לשחזור לזיהוי תאי החיסון השוכנים בריאות של עכברים בריאים בתנאים יציבים. עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לזהות שינויים באוכלוסיות תאים אלה במודלים שונים של מחלות כדי לסייע בזיהוי שינויים ספציפיים למחלות בנוף מערכת החיסון של הריאות.

אסטרטגיית גינג הצעד הראשון באסטרטגיית ההזדווגות שלנו הוא הדרת הפסולת והכפילויות (איור 1A). הדרה זהירה של כפילויות היא קריטית כדי למנוע אוכלוסיות חיוביות כוזבות (איור S2 משלים). לאחר מכן, תאי מערכת החיסון מזוהים באמצעות CD45+, סמן לתאי המטופויטיקה (<strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול יעיל וניתן לשחזור כדי לבודד את האוכלוסיות החיסוניות של מערכת הנשימה murine. אנו מספקים גם שיטה לזיהוי של כל תאי החיסון המולדים והמסתגלים השוכנים בריאות של עכברים בריאים, באמצעות לוח ציטומטריית זרימה מבוסס 9 צבעים.

ניתוח ציטומטרי זרימה לזיהוי תאי החיסון המולדים והמסתגלים של ריאות מורין

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

מכיוון שהריאה מארחת מערכת חיסונית מורכבת וייחודית מאוד, פותחו ודווחו מספר אסטרטגיות gating לזיהוי תאי מערכת החיסון של הריאות. קיומן של מספר גישות שונות מקשה על השוואת תוצאות שנוצרו על ידי מעבדות שונות. אסטרטגיית הגיטינג שלנו מספקת דרך מקיפה וניתנת לשחזור לזהות עד 12 אוכלוסיות מיאלואידיות ריאתיות שונות ואוכלוסיות חיסוניות שאינן מיאלואידיות באמצעות תשעה סמנים.הפרוטוקול הנוכחי מתאר אפיון וזיהוי של אוכלוסיות חיסוניות ריאות בתנאים יציבים. עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות שינויים של אוכלוסיות תאים אלה במודלים שונים של מחלות, שם זה יכול לעזור לזהות שינויים ספציפיים למחלה של הנוף החיסוני של הריאות. חוקרים המבצעים טכניקה זו בפעם הראשונה צריך לשים לב לתנאי העיכול ריאגנטים, כפי שהם עושים הבדל גדול בשחרור של תאי החיסון מרקמת הריאה.התחל על ידי הכנת החיה המתת חסד לניתוח. לייצב את העכבר הגב באמצעות מחטים או סרט על ארבע הגפיים, ולאחר מכן להשתמש 70% אתנול כדי לחטא את העור של אזור הגחון. לעשות חתך מהצוואר לבטן.הסר את העור מאזור בית החזה, יחד עם הצלעות ועצם החזה. לשטוף את הריאות על ידי הזרקת 10 מיליליטר של PBS קר לחדר הימני באמצעות מחט 18 עד 21 מד עד שהם הופכים לבנים לחלוטין. לאחר מכן, להסיר את התימוס והלב מבלי לגעת בריאות.לנתק את הריאות מן הרקמות שמסביב ולהעביר אותם לתוך צינור המכיל חיץ BSA קר. מעבירים את הריאה לצלחת פטרי, טחנים אותה באמצעות שני אזמלים עדינים, ולאחר מכן מניחים אותה לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. הוסף חמישה מיליליטר של חוצץ עיכול לשטוף את הצלחת.מאבטחים את מכסה הצינור ומעכלים את הריאה במשך 30 דקות על שייקר מסלולית במהירות של 150 סיבובים לדקה ב 37 מעלות צלזיוס. עצור את התגובה על ידי הוספת 10 מיליליטר של מאגר BSA קר. לאחר העיכול, מערבבים וממיסים את חתיכות הריאה באמצעות מחט 18-מד.מניחים מסננת מסננת של 70 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר ומעבירים את תערובת הריאות המעוכלת למסננת. השתמש בצד הגומי של בוכנה מזרק 10 מיליליטר כדי לרסק את חתיכות הריאה הנותרות על המסנן ולשטוף אותו עם חיץ BSA. צנטריפוגה השעיה תא יחיד ב 350 G במשך שמונה דקות בשבע מעלות צלזיוס.השלך את supernatant ו resuspened התאים במיליליטר אחד של מאגר תמוגה ACK. מערבבים את ההשעיה באמצעות פיפטה של מיליליטר ודוללים אותה במשך 90 שניות בטמפרטורת החדר. מוסיפים 10 מיליליטר של חיץ BSA קר לתערובת התגובה וצנטריפוגה זה ב 350 גרם במשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס.להשליך את supernatant, resuspend את הכדור במאגר כתמים, ולספור את התאים באמצעות hemocytometer. לפנק מחדש את התאים בריכוז של 5 מיליון תאים למיליליטר לכתמת פני השטח. העבר 1 מיליון תאים ב 200 מיקרוליטרים לבאר לתוך צלחת 96 באר וצנטריפוגה הצלחת ב 350 G במשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס.הכן פתרון בלוק cytometry זרימה על ידי דילול נוגדן נגד 1632 חוצץ כתמים. הגדילו מחדש את התאים ב-50 מיקרוליטרים של תמיסת בלוק ציטומטריית הזרימה. לדגור על ההשעיה במשך 15 עד 20 דקות בארבע מעלות עבור צלזיוס או על קרח.לאחר מכן, להוסיף 150 microliters של חיץ כתמים לצלחת צנטריפוגה זה 350 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הכן פתרון נוגדנים משטח על ידי דילול הנוגדנים על פני השטח במאגר כתמים. לשפץ את התאים ב 50 מיקרוליטרים של פתרון נוגדן פני השטח ולדגור את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס בחושך.לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ כתמים. הכן את חיץ הקיבעון והחדירות על ידי ערבוב של שלושה קיבוע חלקים ודילול חדירות וחלק אחד של מאגר כתמים. הקדישו מחדש את התאים ל-50 מיקרוליטרים של המאגר המוכן מראש לבאר של הצלחת בת 96 הבאר ודגרו אותם במשך 20 עד 25 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך.לדלל את חיץ permeabilization עם מים מטוהרים deionified להכין פעם אחת חוצץ permeabilization ולהשתמש בו כדי לשטוף את התאים. הכן פתרון נוגדנים תאיים על ידי דילול עם מיליליטר אחד של מאגר פרמביליזציה. לשפץ את התאים ב 50 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים תאיים מדוללת לבאר של צלחת 96 באר ודגר במשך 40 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך.לשטוף את התאים עם מאגר חדירות, ולאחר מכן עם מאגר כתמים. לאחר השטיפה הסופית, הקדישו מחדש את התאים ל-200 מיקרוליטרים של חיץ כתמים. לרכוש מינימום של 1.5 מיליון תאים לכל מדגם על cytometer הזרימה.לאחר ניתוח מוצלח והליך מתאים לאחר הניתוח, הפסולת והכפילים הוחרגו באמצעות אסטרטגיית gating. תאי מערכת החיסון זוהו באמצעות סמן CD45 + hematopoietic באמצעות cytometry זרימה. התאים נבדלו כחיים או מתים.תאי הריאה החיסוניים סווגו לשלוש קבוצות באמצעות נוגדנים נגד GR-1 ואנטי CD68. נויטרופילים זוהו ואומתו באמצעות Ly6G כסמן ייחודי. אוכלוסיית CD45+מכילה גם תאי רוצח טבעיים, תאי T ותאי B.תאים אלה היו מוכתמים ואומתו על ידי רוצח טבעי 1.1, CD3, ו B220 נוגדנים. שטיפת הסימפונות זיהתה אאוזינופילים שהיו חיוביים לסמן CD11b, ומקרופאגים מכתשיים שלא הביעו רמות גבוהות של CD11b. CD45 + תאים דנדריטיים נמצאו ואושרו על ידי ביטוי CD24.תאים אלה הראו תגובה חיובית או שלילית כלפי סמני CD103 ו- CD11b. תאים שליליים CD103 סווגו כתאים דנדריטיים קונבנציונליים ומונוציטים המבוססים על ביטוי CD64. התאים הדנדריטיים שמקורם במונוציטים היו חיוביים נמוכים עבור הסמן הדנדריטי CD24, וחיוביים לסמן פאן-מקרופאג' CD64.מקרופאגים ביניים עם מונוציטים קלאסיים ולא קלאסיים נבדלו בהתבסס על ביטוי CD64 ו- GR-1. תאים אלה הראו ביטוי חיובי עבור קולטן כימוקין CX3C אחד. השלבים החשובים ביותר בהליך זה הם קצירת רקמות נכונה, עיכול, והכנה של השעיה של תא יחיד, ו gating על תאים חיים סינגלים.בנוסף לאפיון תאי החיסון של הריאה על ידי ציטומטריית זרימה, תרבית התאים והבדיקות התפקודיות יכולות להתבצע באוכלוסיות תאים מבודדות. טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים לחקור שאלות חדשות במחלות של הריאה, כגון זיהומים, מחלות אוטואימוניות וסרטן.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

בידוד וזיהוי של תאים חיסוניים Extravascular של הלב

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...