Name: flow cytometric analysis for identification of the innate and adaptive immune cells of murine lung
Uploaded: 2021-11-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung at JoVE.com

이 작업은 NIH 보조금 R01CA238263 및 R01CA229784 (VAB)에 의해 지원되었습니다.

이 프로토콜에 설명 된 모든 연구 및 실험은 Beth Israel Deaconess Medical Center의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 지침에 따라 수행되었습니다. 6 내지 10주령의 C57BL/6 생쥐 중 어느 한쪽 성별이 이 프로토콜을 개발하는데 사용되었다.
1. 외과 적 절제 및 조직 준비
<ol><li>1 mL의 트리브로모에탄올을 복강내 주사하여 마우스를 안락사시킨다 (표준 프로토콜에 따라 제조됨...

<ol>
	<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF.">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li><li>Tan, S. Y., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+of+lung+macrophage+diversity.">Developmental origin of lung macrophage diversity.</a> Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).</li><li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung.">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).</li><li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state.">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li><li>Ural, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nerve-associated,+lung-resident+interstitial+macrophage+subset+with+distinct+localization+and+immunoregulatory+properties.">Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties.</a> Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).</li><li>Chakarov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+interstitial+macrophage+populations+coexist+across+tissues+in+specific+subtissular+niches.">Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches.</a> Science. 363 (6432), (2019).</li><li>Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interstitial+macrophage:+A+long-neglected+piece+in+the+puzzle+of+lung+immunity.">The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity.</a> Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).</li><li>Stouch, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaB+kinase+activity+drives+fetal+lung+macrophage+maturation+along+a+non-M1/M2+paradigm.">IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm.</a> Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).</li><li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells.">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).</li><li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+and+monocyte-derived+CD11b(+)+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen.">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+trafficking+and+function+in+rare+lung+diseases.">Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).</li><li>Cook, P. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR&#947;+in+dendritic+cells+and+T+cells+drives+pathogenic+type-2+effector+responses+in+lung+inflammation.">PPAR&#947; in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).</li><li>Aegerter, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza-induced+monocyte-derived+alveolar+macrophages+confer+prolonged+antibacterial+protection.">Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection.</a> Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).</li><li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung.">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).</li><li>Hoffmann, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+interaction+of+murine+pulmonary+phagocytes+in+the+naive+and+allergic+lung.">Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Mesnil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-resident+eosinophils+represent+a+distinct+regulatory+eosinophil+subset.">Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).</li><li>Zaynagetdinov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+myeloid+cell+subsets+in+murine+lungs+using+flow+cytometry.">Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).</li><li>Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+self-limited+acute+lung+injury+by+unilateral+intra-bronchial+acid+instillation.">A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Krishnamoorthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+cytoplasts+induce+TH17+differentiation+and+skew+inflammation+toward+neutrophilia+in+severe+asthma.">Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma.</a> Science Immunology. 3 (26), (2018).</li><li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3+CD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire.">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+natural+killer+cells+in+mice:+phenotype+and+response+to+respiratory+infection.">Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection.</a> Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).</li><li>Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+CD4-CD8-+double-negative+T+cells+are+prominent+producers+of+IL-17A+and+IFN-gamma+during+primary+respiratory+murine+infection+with+Francisella+tularensis+live+vaccine+strain.">Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain.</a> Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).</li><li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V., Alper, S., Janssen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mononuclear+phagocytes+in+the+mouse+lung+and+lymph+nodes.+In+Lung+innate+immunity+and+inflammation.">Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation.</a> Methods in Molecular Biology. 1809, (2018).</li><li>Singer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+method+for+simultaneous+analysis+of+mouse+lung+epithelial,+endothelial,+and+hematopoietic+lineage+cells.">Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).</li><li>Matsushima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD248+and+integrin+alpha-8+are+candidate+markers+for+differentiating+lung+fibroblast+subtypes.">CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes.</a> BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).</li><li>Cong, J., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+in+the+lungs.">Natural killer cells in the lungs.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1416 (2019).</li><li>Daubeuf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast,+easy,+and+customizable+eight-color+flow+cytometric+method+for+analysis+of+the+cellular+content+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+the+mouse.">A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).</li><li>Yi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+recruitment+is+dynamically+regulated+by+interplay+among+lung+dendritic+cell+subsets+after+allergen+challenge.">Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge.</a> Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).</li><li>Langlet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD64+expression+distinguishes+monocyte-derived+and+conventional+dendritic+cells+and+reveals+their+distinct+role+during+intramuscular+immunization.">CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization.</a> Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).</li><li>Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+Ccr7+expression+in+distinct+lineages+of+lung+dendritic+cells.">Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).</li><li>Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+interstitial+macrophages:+past,+present,+and+future.">Lung interstitial macrophages: past, present, and future.</a> Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).</li><li>Krljanac, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELMalpha-expressing+macrophages+protect+against+fatal+lung+damage+and+reduce+parasite+burden+during+helminth+infection.">RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection.</a> Science Immunology. 4 (35), (2019).</li><li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis.">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li><li>Svedberg, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+environment+controls+alveolar+macrophage+metabolism+and+responsiveness+in+type+2+inflammation.">The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation.</a> Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).</li><li>Yona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+origins+and+dynamics+of+monocytes+and+tissue+macrophages+under+homeostasis.">Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis.</a> Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).</li><li>Misharin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span.">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).</li><li>Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Interstitial+Macrophages:+Establishing+Identity+and+Uncovering+Heterogeneity.">Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).</li></ol>

폐 면역 세포의 확인은 폐에 상주하는 여러 면역 세포 유형과 다른 조직에 거주하는 상대편에 비해 독특한 면역 표현형 특성 때문에 어려울 수 있습니다. 여러 병리학 적 조건에서 뚜렷한 표현형 특징을 가진 세포가 폐에 나타납니다. 예를 들어, 블레오마이신-유도된 폐 손상은 폐포 공간에서 순환하는 단핵구 유래 대식세포의 모집을 초래하며, 여기서 이들은 일년 동안 남아있을 수 있고 심지어 ?...

뮤린 호흡기에는 병원균과 싸우고 면역 항상성을 유지하는 독특한 면역 체계가 포함되어 있습니다. 폐 면역 체계는 표현형, 기능, 기원 및 위치에서 상당한 이질성을 가진 세포 집단으로 구성됩니다. 상주 폐포 대식세포 (AMs)는 주로 태아 단핵구에서 유래하여 폐포 루멘1에 상주하며, 골수 유래 간질성 대식세포 (IMs)는 폐 실질2에 상주합니다. IMs는 CD206의 발현에 의해 추가로 하위분류될 수 있다. CD206+ IM은 기관지 주위 및 혈관주위 영역을 채우는 반면, CD206-IM은 폐포 간질3에 위치한다. IM의 몇 가지 하위 분류가 최근에 제안되었습니다 3,4,5,6. IM이 AM보다 덜 연구되었지만, 최근의 증거는 폐의 면역 체계 조절에 중요한 역할을지지합니다7. 또한, CD206은 또한 대안적으로 활성화된 AMs8에서 발현된다.
폐 수지상 세포 (DCs)는 폐 면역 세포의 또 다른 이종 그룹으로서 그들의 기능적 특성, 위치 및 기원과 관련하여 존재한다. DC의 네 가지 하위 범주가 폐에 기술되었다: 통상적인 CD103+ DCs(cDC1로도 알려짐), 통상적인 CD11b+ DCs(cDC2로도 알려짐), 단핵구 유래 DCs(MoDCs), 및 혈장세포성 DCs9,10,11,12,13. 처음 세 개의 서브클래스는 주조직 적합성 복합체(MHC) II+CD11c+9,10,14,15로 정의될 수 있다. 플라스마사이토이드 DC는 MHC II를 발현하고 CD11c에 대해 중간 양성이지만 높은 수준의 B220 및 PDCA-19,13,16을 발현한다. 순진한 뮤린 폐에서 CD103 DC와 CD11b DC는 기도 간질에 위치하는 반면, 혈장 세포질 DC는 폐포 간질에 위치합니다17.
단핵구의 두 가지 주요 집단은 정상 상태 동안 폐에 거주합니다 : 고전적인 단핵구와 비 고전적 단핵구. 고전적 단핵구는 Ly6C+이며 초기 염증 반응에 매우 중요합니다. 대조적으로, 비고전적 단핵구는 Ly6C-항염증 세포3,16,18로서 널리 간주되어 왔다. 최근에, CD64+CD16.2+ 단핵구의 추가 집단이 기술되었고, 이는 Ly6C-단핵구로부터 기원하고 CD206+ IMs3를 야기한다.
호산구는 주로 기생충 감염이나 알레르기 상태 동안 폐에 나타납니다. 그러나, 정상 상태 동안 폐 실질에는 소수의 호산구가 존재하며, 이는 상주 호산구로 알려져 있다. 상주 호산구와는 달리, 염증성 호산구는 폐 간질염 및 기관지 폐포 세척 (BAL)에서 발견됩니다. 집먼지 진드기 (HDM)의 마우스 모델에서, 염증성 호산구는 항원 매개 자극 후 폐로 모집된다. 상주 호산구는 HDM19에 대한 T 헬퍼 2 (Th2) 감작을 억제함으로써 알레르기에 대한 조절 역할을 할 수 있다고 제안되었습니다.
나머지 폐 골수성 세포와는 달리, 호중구는 CD68이 아닌 Ly6G를 발현하며 CD68-Ly6G+ 면역표현형16,20,21의 시그니처를 특징으로 한다. 시각화 연구는 정상 상태 동안, 폐는 혈관내 구획에 호중구 풀을 보유하고, 상당한 수의 혈관외 호중구를 숙주로 한다는 것을 보여주었다22. 호산구와 유사하게, 호중구는 정상 상태에서 BAL에서 발견되지 않는다; 그러나 LPS 챌 린지, 천식 또는 폐렴과 같은 여러 형태의 면역 자극은 호중구를 폐포 내강으로 유도하여 BAL21,22,23에 존재하게됩니다.
폐의 상당한 수의 CD45+ 세포는 자연 살해 (NK), T 세포, 및 B 세포를 나타내며, 대부분의 골수성 마커24에 대해 음성이다. 순진한 마우스의 폐에서, 이들 세 가지 세포 유형은 CD11b 및 MHC II18의 발현에 기초하여 확인될 수 있다. 폐 CD45+ 세포의 약 25%는 B 세포인 반면, NK 세포의 비율은 다른 림프성 및 비림프성 조직보다 폐에서 더 높다24,25,26. 폐 T 세포 중에서, 상당한 분획은 CD4-CD8-호흡기 감염26에서 중요한 역할을 한다.
폐는 매우 복잡하고 독특한 면역 체계를 보유하고 있기 때문에 폐 면역 세포의 확인을위한 몇 가지 게이팅 전략이 개발되어 16,18,20,27보고되었습니다. 본원에 기재된 게이팅 전략은 9개의 마커를 사용하여 최대 12개의 상이한 폐 골수성 및 비골수성 면역 집단을 확인하기 위한 포괄적이고 재현가능한 방법을 제공한다. 결과의 유효성을 검사하기 위해 추가 마커가 사용되었습니다. 또한, 세포 사멸을 최소화하고 폐의 면역 세포 구획의 가장 완전한 프로파일의 확인을 허용하는 단일 세포 현탁액의 제조를 위한 상세한 방법이 제공된다. 상피 세포 (CD45-CD326+CD31-), 내피 세포 (CD45-CD326-CD31+), 및 섬유아세포와 같은 폐의 비면역 세포의 동정은 상이한 접근법을 필요로 한다는 점에 유의해야 한다28,29. 이러한 집단의 확인은 여기에 설명된 프로토콜 및 방법에 포함되지 않는다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringe plunger</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon/corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101215</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117339 / 117337</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103115</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD64</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139319</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD68</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>137009</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse GR-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108433</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Siglec F</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>155503</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVERTIN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103228</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121405 / 121419</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>138503</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100205</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 1</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>149005</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123133</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcBlock (CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101301</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Serrated Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Futura Safety Scalpel</td>
			<td>Merit Medical Systems</td>
			<td>SMS210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L34973</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERTK</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>151505</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC-II</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107621</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108705</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>SORVAL ST 16R</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small curved scissor</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis for identification of the innate and adaptive immune cells of murine lung

호흡기는 외부 환경과 직접 접촉하며 환경 항원에 대한 원치 않는 반응을 억제하면서 보호를 제공하기 위해 정밀하게 조절된 면역 체계가 필요합니다. 폐는 면역 감시를 제공하지만 보호 면역 반응을 매개하는 선천적 및 적응 면역 세포의 여러 집단을 호스트합니다. 건강한 폐 면역 체계의 균형을 유지하는 이러한 세포는 천식, 감염, 자가면역 질환 및 암과 같은 여러 병리학 적 상태에도 참여합니다. 표면 및 세포내 단백질의 선택적 발현은 폐의 면역 세포에 독특한 면역표현형 특성을 제공한다. 결과적으로, 유세포 측정은 정상 상태 및 병리학 적 조건 동안 그러한 세포 집단의 확인에 중요한 역할을합니다. 이 논문은 정상 상태 조건 하에서 건강한 마우스의 폐에 상주하는 면역 세포를 확인하기위한 일관되고 재현 가능한 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 그러나, 이 프로토콜은 또한 폐 면역 환경에서 질환 특이적 변화를 식별하는 것을 돕기 위해 다양한 질병 모델에서 이들 세포 집단의 변화를 확인하는데 사용될 수 있다.

게이팅 전략 게이팅 전략의 첫 번째 단계는 파편과 더블릿을 배제하는 것입니다(그림 1A). 위양성 집단을 피하기 위해 더블릿을 신중하게 배제하는 것이 중요합니다 (보충 그림 S2). 이어서, 면역 세포는 조혈 세포에 대한 마커인 CD45+를 사용하여 확인된다(도 1B). 살아있는 죽은 얼룩은 죽은 세포를 배제하기 위해 추가 ...

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Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

이 연구에서, 우리는 뮤린 호흡기의 면역 집단을 분리하기위한 효과적이고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 9 색 기반 유세포 측정 패널을 사용하여 건강한 마우스의 폐에 존재하는 모든 선천적 및 적응 면역 세포를 확인하는 방법을 제공합니다.

뮤린 폐의 선천적 및 적응성 면역 세포의 확인을 위한 유세포 분석

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

폐는 매우 복잡하고 독특한 면역 체계를 보유하기 때문에 폐 면역 세포의 확인을위한 몇 가지 게이팅 전략이 개발되고보고되었습니다. 여러 가지 접근법이 존재하기 때문에 다른 실험실에서 생성 된 결과를 비교하기가 어렵습니다. 우리의 게이팅 전략은 아홉 개의 마커를 사용하여 최대 12 개의 다른 폐 골수성 및 비 골수성 면역 집단을 식별 할 수있는 포괄적이고 재현 가능한 방법을 제공합니다.본 프로토콜은 정상 상태 조건 하에서 폐 면역 집단의 특성화 및 동정을 기술한다. 그러나, 이 프로토콜은 다양한 질병 모델에서 이들 세포 집단의 변화를 확인하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 폐 면역 환경의 질병 특이적 변화를 확인하는 것을 도울 수 있다. 이 기술을 처음으로 수행하는 연구자는 폐 조직에서 면역 세포의 방출에 큰 차이를 만들기 때문에 소화 조건과 시약에주의를 기울여야합니다.수술을 위해 안락사 된 동물을 준비하는 것으로 시작하십시오. 네 사지에 바늘이나 테이프를 사용하여 마우스를 등쪽으로 안정화 한 다음 70 % 에탄올을 사용하여 복부 부위의 피부를 소독하십시오. 목에서 복부까지 절개하십시오.갈비뼈와 흉골과 함께 흉부 부위에서 피부를 제거하십시오. 완전히 흰색이 될 때까지 18 ~ 21 게이지 바늘을 사용하여 10 밀리리터의 차가운 PBS를 우심실에 주입하여 폐를 플러시하십시오. 그런 다음 폐를 만지지 않고 흉선과 심장을 제거하십시오.폐를 주변 조직에서 분리하여 차가운 BSA 버퍼가 들어있는 튜브로 옮깁니다. 폐를 페트리 접시로 옮기고 두 개의 미세한 메스를 사용하여 다진 다음 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 넣으십시오. 다섯 밀리리터의 소화 완충액을 넣어 접시를 씻으십시오.튜브의 뚜껑을 고정하고 섭씨 37도에서 분당 150 회전의 속도로 궤도 쉐이커에서 30 분 동안 폐를 소화하십시오. 차가운 BSA 버퍼 10 밀리리터를 첨가하여 반응을 중지하십시오. 소화 후, 18 게이지 바늘을 사용하여 폐 조각을 혼합하고 용해시킨다.새로운 50 밀리리터 원뿔형 튜브 위에 70 마이크로 미터 필터 스트레이너를 놓고 소화 된 폐 혼합물을 스트레이너로 옮깁니다. 10밀리리터 주사기 플런저의 고무 면을 사용하여 필터의 나머지 폐 조각을 부수고 BSA 버퍼로 세척합니다. 단일 세포 현탁액을 섭씨 7도에서 8분 동안 350 G에서 원심분리한다.상청액을 버리고 세포를 ACK 용해 완충액 한 밀리리터에 재현탁시킨다. 현탁액을 일밀리리터 피펫을 사용하여 혼합하고 실온에서 90초 동안 인큐베이션한다. 차가운 BSA 완충액 10 밀리리터를 반응 혼합물에 첨가하고, 섭씨 네 도에서 7분 동안 350 G에서 원심분리한다.상청액을 버리고, 펠렛을 염색 완충액에 재현탁시키고, 혈구분석기를 사용하여 세포를 계수한다. 표면 염색을 위해 세포를 밀리리터 당 5 백만 세포의 농도로 재현탁하십시오. 웰당 200마이크로리터의 1백만 세포를 96웰 플레이트로 옮기고 플레이트를 섭씨 4도에서 7분 동안 350G에서 원심분리한다.항-1632 항체를 염색 완충액에 희석하여 유세포 분석 블록 용액을 제조하였다. 세포를 50 마이크로리터의 유세포 분석 블록 용액에 재현탁시킨다. 현탁액을 섭씨 또는 얼음 위에서 네 도에서 15 ~ 20 분 동안 배양하십시오.이어서, 150 마이크로리터의 염색 완충액을 플레이트에 첨가하고, 이를 섭씨 네 도에서 5분 동안 350 G로 원심분리한다. 표면 항체를 염색 완충액에 희석하여 표면 항체 용액을 준비한다. 세포를 표면 항체 용액의 50 마이크로리터에 재현탁시키고, 플레이트를 어둠 속에서 섭씨 네 도에서 인큐베이션한다.그런 다음 염색 버퍼로 세포를 두 번 씻으십시오. 고정화 및 투과화 완충액을 세 부 고정과 투과 희석제와 한 부 염색 완충액을 혼합하여 준비한다. 세포를 96-웰 플레이트의 웰 당 미리 준비된 완충액 50 마이크로리터에 재현탁시키고, 어둠 속에서 섭씨 4도에서 20 내지 25분 동안 인큐베이션한다.투과 완충액을 정제된 탈이온수로 희석하여 일회 투과 완충액을 제조하고 이를 이용하여 세포를 세척한다. 한 밀리리터의 투과 완충액으로 희석하여 세포내 항체 용액을 준비한다. 세포를 96-웰 플레이트의 웰 당 희석된 세포내 항체 용액 50 마이크로리터에 재현탁시키고, 어둠 속에서 섭씨 4도에서 40분 동안 인큐베이션한다.투과 완충액으로 세포를 세척 한 다음 염색 완충액으로 씻으십시오. 최종 세척 후, 세포를 200 마이크로리터의 염색 완충액에 재현탁시킨다. 유세포 분석기 상에서 샘플 당 최소 1.5백만 세포를 획득한다.성공적인 수술과 적절한 수술 후 수술 후, 파편과 이중은 게이팅 전략을 통해 배제되었습니다. 면역 세포는 유세포 분석기를 통해 CD45+조혈 마커를 사용하여 확인되었다. 세포는 살아있는 또는 죽은 것으로 구별되었다.면역 폐 세포를 항-GR-1 및 항-CD68 항체를 사용하여 세 그룹으로 분류하였다. 호중구는 독특한 마커로서 Ly6G를 사용하여 확인되고 검증되었다. CD45+ 집단은 또한 자연 살해 세포, T 세포 및 B 세포를 함유한다.이들 세포를 염색하고 자연 살해 1.1, CD3, 및 B220 항체에 의해 검증하였다. 기관지 폐포 세척은 CD11b 마커에 대해 양성인 호산구와 높은 수준의 CD11b를 발현하지 않는 폐포 대식세포를 확인했다. CD45+수지상 세포는 CD24 발현에 의해 발견되고 확인되었다.이들 세포는 CD103 및 CD11b 마커에 대해 양성 또는 음성 반응을 보였다. CD103 음성 세포는 CD64 발현에 기초하여 통상적인 단핵구 유래 수지상 세포로 분류되었다. 단핵구 유래 수지상 세포는 CD24 수지상 마커에 대해 낮은 양성이었고, CD64 범 대식세포 마커에 대해 양성이었다.고전적 및 비고전적 단핵구를 갖는 간질성 대식세포는 CD64 및 GR-1 발현에 기초하여 구별되었다. 이들 세포는 CX3C 케모카인 수용체에 대해 양성 발현을 나타냈다. 이 절차에서 가장 중요한 단계는 적절한 조직 수확, 소화 및 단일 세포 현탁액의 준비, 살아있는 세포 및 일중항 위의 게이팅입니다.유세포 분석기에 의해 폐의 면역 세포를 특성화하는 것 외에도, 세포 배양 및 기능적 분석은 단리된 세포 집단에서 수행될 수 있다. 이 기술은 연구자가 감염,자가 면역 질환 및 암과 같은 폐 질환에 대한 새로운 질문을 탐구 할 수있는 길을 열어 줄 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

연구

면역학 및 감염병학

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

쥐 소장 림프구의 분리 및 유세포 특성

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

인간의 자궁 경부 감마 델타 T 세포의 분리 및 유세포 분석

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

절연 및 심장의 Extravascular 면역 세포의 식별

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...