Name: flow cytometric analysis for identification of the innate and adaptive immune cells of murine lung
Uploaded: 2021-11-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd R01CA238263 og R01CA229784 (VAB).

Alle studier og eksperimenter beskrevet i denne protokollen ble utført under retningslinjer i henhold til Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Beth Israel Deaconess Medical Center. Seks til ti uker gamle C57BL/6 mus av begge kjønn ble brukt til å utvikle denne protokollen.
1. Kirurgisk eksisjon og vevsforberedelse
<ol><li>Avlive musen ved intraperitoneally injisere 1 ml tribromoetanol (utarbeidet i henhold til standardprotokoll; Tabell over materialer)....

<ol>
	<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF.">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li><li>Tan, S. Y., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+of+lung+macrophage+diversity.">Developmental origin of lung macrophage diversity.</a> Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).</li><li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung.">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).</li><li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state.">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li><li>Ural, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nerve-associated,+lung-resident+interstitial+macrophage+subset+with+distinct+localization+and+immunoregulatory+properties.">Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties.</a> Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).</li><li>Chakarov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+interstitial+macrophage+populations+coexist+across+tissues+in+specific+subtissular+niches.">Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches.</a> Science. 363 (6432), (2019).</li><li>Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interstitial+macrophage:+A+long-neglected+piece+in+the+puzzle+of+lung+immunity.">The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity.</a> Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).</li><li>Stouch, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaB+kinase+activity+drives+fetal+lung+macrophage+maturation+along+a+non-M1/M2+paradigm.">IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm.</a> Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).</li><li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells.">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).</li><li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+and+monocyte-derived+CD11b(+)+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen.">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+trafficking+and+function+in+rare+lung+diseases.">Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).</li><li>Cook, P. C., MacDonald, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+lung+immunopathology.">Dendritic cells in lung immunopathology.</a> Seminars in Immunopathology. 38, 449-460 (2016).</li><li>Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+between+lung+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+defense+against+pulmonary+infections.">Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections.</a> Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).</li><li>Nobs, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR&#947;+in+dendritic+cells+and+T+cells+drives+pathogenic+type-2+effector+responses+in+lung+inflammation.">PPAR&#947; in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).</li><li>Aegerter, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza-induced+monocyte-derived+alveolar+macrophages+confer+prolonged+antibacterial+protection.">Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection.</a> Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).</li><li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung.">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).</li><li>Hoffmann, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+interaction+of+murine+pulmonary+phagocytes+in+the+naive+and+allergic+lung.">Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Mesnil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-resident+eosinophils+represent+a+distinct+regulatory+eosinophil+subset.">Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).</li><li>Zaynagetdinov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+myeloid+cell+subsets+in+murine+lungs+using+flow+cytometry.">Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).</li><li>Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+self-limited+acute+lung+injury+by+unilateral+intra-bronchial+acid+instillation.">A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Krishnamoorthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+cytoplasts+induce+TH17+differentiation+and+skew+inflammation+toward+neutrophilia+in+severe+asthma.">Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma.</a> Science Immunology. 3 (26), (2018).</li><li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3+CD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire.">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+natural+killer+cells+in+mice:+phenotype+and+response+to+respiratory+infection.">Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection.</a> Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).</li><li>Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+CD4-CD8-+double-negative+T+cells+are+prominent+producers+of+IL-17A+and+IFN-gamma+during+primary+respiratory+murine+infection+with+Francisella+tularensis+live+vaccine+strain.">Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain.</a> Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).</li><li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V., Alper, S., Janssen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mononuclear+phagocytes+in+the+mouse+lung+and+lymph+nodes.+In+Lung+innate+immunity+and+inflammation.">Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation.</a> Methods in Molecular Biology. 1809, (2018).</li><li>Singer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+method+for+simultaneous+analysis+of+mouse+lung+epithelial,+endothelial,+and+hematopoietic+lineage+cells.">Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).</li><li>Matsushima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD248+and+integrin+alpha-8+are+candidate+markers+for+differentiating+lung+fibroblast+subtypes.">CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes.</a> BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).</li><li>Cong, J., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+in+the+lungs.">Natural killer cells in the lungs.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1416 (2019).</li><li>Daubeuf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast,+easy,+and+customizable+eight-color+flow+cytometric+method+for+analysis+of+the+cellular+content+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+the+mouse.">A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).</li><li>Yi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+recruitment+is+dynamically+regulated+by+interplay+among+lung+dendritic+cell+subsets+after+allergen+challenge.">Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge.</a> Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).</li><li>Langlet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD64+expression+distinguishes+monocyte-derived+and+conventional+dendritic+cells+and+reveals+their+distinct+role+during+intramuscular+immunization.">CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization.</a> Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).</li><li>Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+Ccr7+expression+in+distinct+lineages+of+lung+dendritic+cells.">Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).</li><li>Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+interstitial+macrophages:+past,+present,+and+future.">Lung interstitial macrophages: past, present, and future.</a> Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).</li><li>Krljanac, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELMalpha-expressing+macrophages+protect+against+fatal+lung+damage+and+reduce+parasite+burden+during+helminth+infection.">RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection.</a> Science Immunology. 4 (35), (2019).</li><li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis.">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li><li>Svedberg, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+environment+controls+alveolar+macrophage+metabolism+and+responsiveness+in+type+2+inflammation.">The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation.</a> Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).</li><li>Yona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+origins+and+dynamics+of+monocytes+and+tissue+macrophages+under+homeostasis.">Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis.</a> Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).</li><li>Misharin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span.">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).</li><li>Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Interstitial+Macrophages:+Establishing+Identity+and+Uncovering+Heterogeneity.">Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).</li></ol>

Identifisering av lungeimmuneceller kan være utfordrende på grunn av de mange immuncelletypene som bor i lungen og deres unike immunofenotypiske egenskaper sammenlignet med deres kolleger som bor i andre vev. Under flere patologiske forhold vises celler med tydelige fenotypiske egenskaper i lungene. For eksempel resulterer bleomycinindusert lungeskade i rekrutteringen av sirkulerende monocytt-avledede makrofager i alveolarrommet, hvor de kan forbli så lenge som ett år og til og med vedvare etter bleomycinindusert fib...

Murin luftveiene inneholder et unikt immunsystem som er ansvarlig for å bekjempe patogener og opprettholde immun homeostase. Lungeimmunsystemet består av cellulære populasjoner med betydelig heterogenitet i fenotype, funksjon, opprinnelse og plassering. Resident alveolar makrofager (AMs), stammer hovedsakelig fra fostermonocytter, bor i alveolar lumen1, mens benmargsavledede interstitielle makrofager (IMs) bor i lungeparenchyma2. Direktemeldinger kan underklassifiseres ytterligere av uttrykket for CD206. CD206+ IMs fyller peribronchial og perivascular området, mens CD206- IMs er plassert på alveolar interstitium3. Noen få underklassifiseringer av direktemeldinger er foreslått nylig3,4,5,6. Selv om IMs er mindre studert enn AMs, støtter nyere bevis deres avgjørende rolle i reguleringen av immunsystemet i lungen7. I tillegg uttrykkes CD206 også i alternativt aktiverte AMs8.
Lunge dendritiske celler (DCs) er en annen heterogen gruppe lunge immunceller med hensyn til deres funksjonelle egenskaper, plassering og opprinnelse. Fire underkategorier av domenekontrollere er beskrevet i lungene: konvensjonelle CD103+ domenekontrollere (også kjent som cDC1), konvensjonelle CD11b+ domenekontrollere (også kjent som cDC2), monocytt-avledede domenekontrollere (MoDC) og plasmacytoid-domenekontrollere9,10,11,12,13. De tre første underklassene kan defineres som hovedkomplekset for histokompatibilitet (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Plasmacytoid DCs uttrykker MHC II og er mellomliggende positive for CD11c, men uttrykker høye nivåer av B220 og PDCA-19,13,16. I naive murin lunger er CD103 DCs og CD11b DCs plassert i luftveiene interstitium, mens plasmacytoid DCs ligger i alveolar interstitium17.
To store populasjoner av monocytter bor i lungen under steady state: klassiske monocytter og ikke-klassiske monocytter. Klassiske monocytter er Ly6C + og er kritiske for den første inflammatoriske responsen. Derimot er ikke-klassiske monocytter Ly6C- og har blitt sett på som antiinflammatoriske celler3,16,18. Nylig ble en ekstra populasjon av CD64 + CD16.2 + monocytter beskrevet, som stammer fra Ly6C- monocytter og gir opphav til CD206 + IMs3.
Eosinofiler forekommer hovedsakelig i lungene under helminthinfeksjon eller allergiske forhold. Imidlertid er det et lite antall eosinofiler i lungeparenchyma under steady state, kjent som bosatt eosinofiler. I motsetning til de bosatte eosinofiler finnes inflammatoriske eosinofiler i lungeinterstitium og bronkoalveolar lavage (BAL). I musemodeller av husstøvmitt (HDM) rekrutteres inflammatoriske eosinofiler i lungene etter antigenmediert stimulering. Det er foreslått at bosatte eosinofiler kan ha en regulatorisk rolle i allergi ved å hemme T-hjelper 2 (Th2) sensibilisering til HDM19.
I motsetning til resten av lunge myeloidceller uttrykker nøytrofiler Ly6G, men ikke CD68 og er preget av en signatur av CD68-Ly6G + immunofenotype16,20,21. Visualiseringsstudier har vist at lungene under steady state reserverer et basseng med nøytrofiler i det intravaskulære rommet og er vert for et betydelig antall ekstravaskulære nøytrofiler22. I likhet med eosinofiler finnes ikke nøytrofiler i BAL ved steady state; Imidlertid driver flere former for immunstimulering, som LPS-utfordring, astma eller lungebetennelse, nøytrofiler inn i alveolar lumen, noe som resulterer i deres tilstedeværelse i BAL21,22,23.
Et betydelig antall CD45+ celler i lungen representerer naturlig morder (NK), T-celler og B-celler og er negative for de fleste myeloidmarkører24. I lungene til naive mus kan disse tre celletypene identifiseres basert på uttrykket av CD11b og MHC II18. Rundt 25% av lunge-CD45+ celler er B-celler, mens prosentandelen NK-celler er høyere i lungen enn andre lymfoide og ikke-lymfoide vev24,25,26. Blant lunge T-celler er en betydelig brøkdel CD4-CD8- og spiller en viktig rolle i luftveisinfeksjoner26.
Fordi lungen er vert for et svært komplekst og unikt immunsystem, har flere gating strategier for identifisering av lungeimmunceller blitt utviklet og rapportert16,18,20,27. Gating strategien beskrevet heri gir en omfattende og reproduserbar måte å identifisere opptil 12 forskjellige lunge myeloid og ikke-myeloid immunpopulasjoner ved hjelp av 9 markører. Flere indikatorer er brukt til å validere resultatene. Videre er det gitt en detaljert metode for fremstilling av en encellet suspensjon som minimerer celledød og tillater identifisering av den mest komplette profilen til immuncellerommet i lungen. Det skal bemerkes at identifisering av ikke-immunceller i lungen, for eksempel epitelceller (CD45-CD326 +CD31-), endotelceller (CD45-CD326-CD31+), og fibroblaster krever en annen tilnærming28,29. Identifisering av slike populasjoner er ikke inkludert i protokollen og metoden som er beskrevet her.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringe plunger</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon/corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101215</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117339 / 117337</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103115</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD64</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139319</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD68</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>137009</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse GR-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108433</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Siglec F</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>155503</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVERTIN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103228</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121405 / 121419</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>138503</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100205</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 1</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>149005</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123133</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcBlock (CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101301</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Serrated Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Futura Safety Scalpel</td>
			<td>Merit Medical Systems</td>
			<td>SMS210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L34973</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERTK</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>151505</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC-II</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107621</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108705</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>SORVAL ST 16R</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small curved scissor</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis for identification of the innate and adaptive immune cells of murine lung

Luftveiene er i direkte kontakt med utemiljøet og krever et nøyaktig regulert immunsystem for å gi beskyttelse samtidig som uønskede reaksjoner på miljøantigener undertrykkes. Lunger er vert for flere populasjoner av medfødte og adaptive immunceller som gir immunovervåking, men også formidler beskyttende immunresponser. Disse cellene, som holder det sunne lunge immunforsvaret i balanse, deltar også i flere patologiske forhold som astma, infeksjoner, autoimmune sykdommer og kreft. Selektivt uttrykk for overflate og intracellulære proteiner gir unike immunofenotypiske egenskaper til immuncellene i lungen. Derfor har strømningscytometri en viktig rolle i identifiseringen av slike cellepopulasjoner under steady-state og patologiske forhold. Dette dokumentet presenterer en protokoll som beskriver en konsekvent og reproduserbar metode for å identifisere immuncellene som ligger i lungene til friske mus under steady-state forhold. Denne protokollen kan imidlertid også brukes til å identifisere endringer i disse cellepopulasjonene i ulike sykdomsmodeller for å bidra til å identifisere sykdomsspesifikke endringer i lungeimmunelandskapet.

Gating strategi Det første trinnet i vår gating strategi er utelukkelse av rusk og doublets (Figur 1A). Forsiktig utelukkelse av dobler er avgjørende for å unngå falske positive populasjoner (Supplerende figur S2). Deretter identifiseres immunceller ved hjelp av CD45+, en markør for hematopoietiske celler (figur 1B). Den levende døde flekken kan legges til for å utelukke døde celler. Denne protokollen resu...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

I denne studien presenterer vi en effektiv og reproduserbar protokoll for å isolere immunpopulasjonene i murin respiratorisk system. Vi tilbyr også en metode for identifisering av alle medfødte og adaptive immunceller som ligger i lungene til friske mus, ved hjelp av et 9-fargebasert strømningscytometripanel.

Flow cytometrisk analyse for identifisering av de medfødte og adaptive immuncellene i Murine Lung

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

Fordi lungen er vert for et svært komplekst og unikt immunsystem, har flere gating strategier for identifisering av lungeimmunceller blitt utviklet og rapportert. Eksistensen av flere forskjellige tilnærminger gjør det vanskelig å sammenligne resultater generert av forskjellige laboratorier. Vår gating strategi gir en omfattende og reproduserbar måte å identifisere opptil 12 forskjellige lunge myeloid og ikke-myeloid immunpopulasjoner ved hjelp av ni markører.Den nåværende protokollen beskriver karakterisering og identifisering av lungeimmunepopulasjoner under steady-state forhold. Denne protokollen kan imidlertid brukes til å identifisere endringer i disse cellepopulasjonene i ulike sykdomsmodeller, hvor den kan bidra til å identifisere sykdomsspesifikke endringer i lungeimmunelandskapet. Etterforskere som utfører denne teknikken for første gang, bør være oppmerksom på fordøyelsesforholdene og reagensene, da de gjør en stor forskjell i frigjøring av immunceller fra lungevevet.Begynn med å forberede det euthanized dyret for kirurgi. Stabiliser musen dorsalt ved å bruke nåler eller tape på de fire ekstremitetene, og bruk deretter 70% etanol for å desinfisere huden på ventralområdet. Lag et snitt fra nakken til magen.Fjern huden fra thoracic området, sammen med ribber og brystbenet. Skyll lungene ved å injisere 10 milliliter kald PBS i høyre ventrikel ved hjelp av en 18 til 21-gauge nål til de blir helt hvite. Fjern deretter thymus og hjerte uten å berøre lungene.Løsne lungene fra det omkringliggende vevet og overfør dem til et rør som inneholder kald BSA-buffer. Overfør lungen til en Petri-tallerken, hakk den med to fine skalpeller, og legg den deretter i et 50 milliliter konisk rør. Tilsett fem milliliter fordøyelsesbuffer for å vaske platen.Fest lokket på røret og fordøye lungen i 30 minutter på en orbital shaker med en hastighet på 150 rotasjoner per minutt ved 37 grader Celsius. Stopp reaksjonen ved å tilsette 10 milliliter kald BSA-buffer. Etter fordøyelsen, bland og oppløs lungestykkene ved hjelp av en 18-gauge nål.Plasser en 70-mikrometer filtersil på toppen av et nytt konisk rør på 50 milliliter og overfør den fordøyde lungeblandingen til silen. Bruk gummisiden av et 10 milliliter sprøytestempeble for å knuse de resterende lungestykkene på filteret og vask det med BSA-buffer. Sentrifuger encellet suspensjon ved 350 G i åtte minutter ved syv grader Celsius.Kast supernatanten og resuspend cellene i en milliliter ACK lysis buffer. Bland suspensjonen med en en milliliter pipette og inkuber den i 90 sekunder ved romtemperatur. Tilsett 10 milliliter kald BSA-buffer til reaksjonsblandingen og sentrifuger den ved 350 G i syv minutter ved fire grader Celsius.Kast supernatanten, resuspend pellet i farging buffer, og telle cellene ved hjelp av et hemocytometer. Resuspend cellene i en konsentrasjon på 5 millioner celler per milliliter for overflatefarging. Overfør 1 million celler i 200 mikroliter per brønn til en 96-brønns plate og sentrifuger platen ved 350 G i syv minutter ved fire grader Celsius.Forbered en strømningscytometriblokkløsning ved å fortynne anti-1632 antistoff i fargebuffer. Resuspender cellene i 50 mikroliter av strømningscytometriblokkløsningen. Inkuber suspensjonen i 15 til 20 minutter ved fire grader for Celsius eller på is.Tilsett deretter 150 mikroliter fargebuffer til platen og sentrifuger den 350 G i fem minutter ved fire grader Celsius. Forbered overflateantistoffløsning ved å fortynne overflateantistoffene i fargingsbufferen. Resuspend cellene i 50 mikroliter av overflaten antistoff løsning og inkubere platen ved fire grader Celsius i mørket.Vask deretter cellene to ganger med fargebuffer. Forbered fikserings- og permeabiliseringsbufferen ved å blande tre deler fiksering og permeabiliseringsdynningsmiddel og en del fargingsbuffer. Resuspend cellene i 50 mikroliter av prepreparert buffer per brønn av 96-brønnsplaten og inkuber dem i 20 til 25 minutter ved fire grader Celsius i mørket.Fortynn permeabiliseringsbufferen med renset deionisert vann for å forberede en ganger permeabiliseringsbuffer og bruk den til å vaske cellene. Forbered en intracellulær antistoffløsning ved å fortynne med en milliliter permeabiliseringsbuffer. Resuspend cellene i 50 mikroliter av fortynnet intracellulær antistoff løsning per brønn av 96-brønnsplaten og inkubere i 40 minutter ved fire grader Celsius i mørket.Vask cellene med permeabiliseringsbuffer, deretter med fargebuffer. Etter den endelige vasken, resuspend cellene i 200 mikroliter av farging buffer. Skaff deg minst 1,5 millioner celler per prøve på strømningscytometeret.Etter en vellykket operasjon og passende postoperativ prosedyre ble rusk og dobler utelukket gjennom en gating strategi. Immunceller ble identifisert ved hjelp av CD45 + hematopoietisk markør via strømningscytometri. Cellene ble skilt ut som levende eller døde.Immun lungecellene ble kategorisert i tre grupper ved hjelp av anti-GR-1 og anti-CD68 antistoffer. Nøytrofiler ble identifisert og verifisert ved hjelp av Ly6G som en unik markør. CD45+-populasjonen inneholder også naturlige morderceller, T-celler og B-celler.Disse cellene ble farget og verifisert av naturlig morder 1.1, CD3 og B220 antistoffer. Bronchoalveolar lavage identifiserte eosinofiler som var positive for CD11b-markøren, og alveolar makrofager som ikke uttrykte høye nivåer av CD11b. CD45 + dendritiske celler ble funnet og bekreftet av CD24-uttrykk.Disse cellene viste enten en positiv eller negativ respons mot CD103- og CD11b-markører. CD103 negative celler ble klassifisert som konvensjonelle og monocytt-avledede dendrittiske celler basert på CD64-uttrykk. de monocyttavledede dendrittiske cellene var lave positive for dendrittiske CD24-markøren, og positive for CD64-panmakrofagmarkøren.Interstitielle makrofager med klassiske og ikke-klassiske monocytter ble skilt ut basert på CD64- og GR-1-uttrykk. Disse cellene viste positivt uttrykk for CX3C kjemokinreseptor en. De viktigste trinnene i denne prosedyren er riktig vevshøsting, fordøyelse og forberedelse av encellet suspensjon, og gating på levende celler og singlets.I tillegg til å karakterisere immunceller i lungen ved strømningscytometri, kan cellekultur og funksjonelle analyser utføres i isolerte cellepopulasjoner. Denne teknikken kan bane vei for forskere å utforske nye spørsmål i sykdommer i lungen, for eksempel infeksjoner, autoimmune sykdommer og kreft.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrisk Isolering av Primary Murine Type II alveolære epitelceller for Funksjonell og molekylær studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Ved hjelp av RNA-interferens for å undersøke det medfødte immunrespons i Musemakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolasjon og flowcytometrisk analyse av immunceller fra iskemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering og flowcytometrisk analyse av gliom-infiltrerende perifere mononukleære blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolasjon og Flowcytometriske Karakterisering av Murine Small Intestinal Lymfocytter

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse av Natural Killer Cell Lytisk aktivitet i humant fullblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolasjon og Flowcytometriske analyse av endocervikale Gamma Delta T-celler

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolasjon og identifisering av ekstravaskulær overvåking av immunceller av hjertet

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Fordøyelsen av Murine leveren for en flyt Cytometric analyse av lymfatisk endotelceller

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...