Name: flow cytometric analysis for identification of the innate and adaptive immune cells of murine lung
Uploaded: 2021-11-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R01CA238263 e R01CA229784 (VAB).

Todos os estudos e experimentos descritos neste protocolo foram conduzidos sob diretrizes de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Beth Israel Deaconess Medical Center. De seis a dez semanas de idade, os ratos C57BL/6 de ambos os sexos foram usados para desenvolver este protocolo.
1. Excisão cirúrgica e preparação tecidual
<ol><li>Eutanize o mouse injetando 1 mL de tribromoetanol (preparado de acordo com o protocolo padrão; Tabela de Materiai...

<ol>
	<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF.">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li><li>Tan, S. Y., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+of+lung+macrophage+diversity.">Developmental origin of lung macrophage diversity.</a> Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).</li><li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung.">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).</li><li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state.">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li><li>Ural, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nerve-associated,+lung-resident+interstitial+macrophage+subset+with+distinct+localization+and+immunoregulatory+properties.">Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties.</a> Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).</li><li>Chakarov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+interstitial+macrophage+populations+coexist+across+tissues+in+specific+subtissular+niches.">Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches.</a> Science. 363 (6432), (2019).</li><li>Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interstitial+macrophage:+A+long-neglected+piece+in+the+puzzle+of+lung+immunity.">The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity.</a> Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).</li><li>Stouch, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaB+kinase+activity+drives+fetal+lung+macrophage+maturation+along+a+non-M1/M2+paradigm.">IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm.</a> Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).</li><li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells.">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).</li><li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+and+monocyte-derived+CD11b(+)+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen.">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+trafficking+and+function+in+rare+lung+diseases.">Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).</li><li>Cook, P. C., MacDonald, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+lung+immunopathology.">Dendritic cells in lung immunopathology.</a> Seminars in Immunopathology. 38, 449-460 (2016).</li><li>Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+between+lung+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+defense+against+pulmonary+infections.">Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections.</a> Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).</li><li>Nobs, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR&#947;+in+dendritic+cells+and+T+cells+drives+pathogenic+type-2+effector+responses+in+lung+inflammation.">PPAR&#947; in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).</li><li>Aegerter, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza-induced+monocyte-derived+alveolar+macrophages+confer+prolonged+antibacterial+protection.">Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection.</a> Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).</li><li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung.">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).</li><li>Hoffmann, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+interaction+of+murine+pulmonary+phagocytes+in+the+naive+and+allergic+lung.">Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Mesnil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-resident+eosinophils+represent+a+distinct+regulatory+eosinophil+subset.">Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).</li><li>Zaynagetdinov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+myeloid+cell+subsets+in+murine+lungs+using+flow+cytometry.">Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).</li><li>Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+self-limited+acute+lung+injury+by+unilateral+intra-bronchial+acid+instillation.">A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Krishnamoorthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+cytoplasts+induce+TH17+differentiation+and+skew+inflammation+toward+neutrophilia+in+severe+asthma.">Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma.</a> Science Immunology. 3 (26), (2018).</li><li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3+CD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire.">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+natural+killer+cells+in+mice:+phenotype+and+response+to+respiratory+infection.">Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection.</a> Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).</li><li>Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+CD4-CD8-+double-negative+T+cells+are+prominent+producers+of+IL-17A+and+IFN-gamma+during+primary+respiratory+murine+infection+with+Francisella+tularensis+live+vaccine+strain.">Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain.</a> Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).</li><li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V., Alper, S., Janssen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mononuclear+phagocytes+in+the+mouse+lung+and+lymph+nodes.+In+Lung+innate+immunity+and+inflammation.">Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation.</a> Methods in Molecular Biology. 1809, (2018).</li><li>Singer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+method+for+simultaneous+analysis+of+mouse+lung+epithelial,+endothelial,+and+hematopoietic+lineage+cells.">Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).</li><li>Matsushima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD248+and+integrin+alpha-8+are+candidate+markers+for+differentiating+lung+fibroblast+subtypes.">CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes.</a> BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).</li><li>Cong, J., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+in+the+lungs.">Natural killer cells in the lungs.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1416 (2019).</li><li>Daubeuf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast,+easy,+and+customizable+eight-color+flow+cytometric+method+for+analysis+of+the+cellular+content+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+the+mouse.">A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).</li><li>Yi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+recruitment+is+dynamically+regulated+by+interplay+among+lung+dendritic+cell+subsets+after+allergen+challenge.">Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge.</a> Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).</li><li>Langlet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD64+expression+distinguishes+monocyte-derived+and+conventional+dendritic+cells+and+reveals+their+distinct+role+during+intramuscular+immunization.">CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization.</a> Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).</li><li>Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+Ccr7+expression+in+distinct+lineages+of+lung+dendritic+cells.">Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).</li><li>Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+interstitial+macrophages:+past,+present,+and+future.">Lung interstitial macrophages: past, present, and future.</a> Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).</li><li>Krljanac, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELMalpha-expressing+macrophages+protect+against+fatal+lung+damage+and+reduce+parasite+burden+during+helminth+infection.">RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection.</a> Science Immunology. 4 (35), (2019).</li><li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis.">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li><li>Svedberg, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+environment+controls+alveolar+macrophage+metabolism+and+responsiveness+in+type+2+inflammation.">The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation.</a> Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).</li><li>Yona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+origins+and+dynamics+of+monocytes+and+tissue+macrophages+under+homeostasis.">Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis.</a> Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).</li><li>Misharin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span.">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).</li><li>Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Interstitial+Macrophages:+Establishing+Identity+and+Uncovering+Heterogeneity.">Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).</li></ol>

A identificação de células imunes pulmonares pode ser desafiadora devido aos múltiplos tipos de células imunes residentes no pulmão e suas características imunofenópicas únicas em comparação com suas contrapartes residentes em outros tecidos. Em várias condições patológicas, células com características fenotípicas distintas aparecem nos pulmões. Por exemplo, a lesão pulmonar induzida pela bleomicina resulta no recrutamento de macrófagos derivados de monócitos circulantes no espaço alveolar, onde po...

O trato respiratório murino contém um sistema imunológico único responsável por combater patógenos e manter a homeostase imunológica. O sistema imunológico pulmonar consiste em populações celulares com heterogeneidade significativa em seu fenótipo, função, origem e localização. Os macrófagos alveolares residentes (AMs), originados principalmente de monócitos fetais, residem no lúmen 1 alveolar, enquanto macrófagos intersticiais (IMs) derivados da medula óssea residem no pulmão parenchyma2. Os IMs podem ser ainda mais subclassificados pela expressão do CD206. Os IMs CD206+ povoam a área peribronquial e perivascular, enquanto os IMs CD206-IMs estão localizados no interstício alveolar3. Algumas subclassificações de IMs foram propostas recentemente 3,4,5,6. Embora os IMs sejam menos estudados do que as AMs, evidências recentes apoiam seu papel crucial na regulação do sistema imunológico do pulmão7. Além disso, o CD206 também é expresso em AMs8 ativados alternativamente.
As células dendríticas pulmonares (DCs) são outro grupo heterogêneo de células imunes pulmonares em relação às suas propriedades funcionais, localização e origem. Quatro subcategorias de DCs foram descritas no pulmão: DCs cd103+ convencionais (também conhecidos como cDC1), CD11b+ DCs convencionais (também conhecidos como cDC2), DCs derivados de monocitoides (MoDCs) e DCs 9,10,11,12,13. As três primeiras subclasses podem ser definidas como principais complexos de histocompatibilidade (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Os DCs plasmacitóides expressam MHC II e são intermediavelmente positivos para CD11c, mas expressam altos níveis de B220 e PDCA-19,13,16. Em pulmões murinos ingênuos, os DCs CD103 e os DCs CD11b estão localizados no interstício das vias aéreas, enquanto os DCs plasmacitóides estão localizados no interstício alveolar17.
Duas grandes populações de monócitos residem no pulmão durante o estado estável: monócitos clássicos e monócitos não clássicos. Os monócitos clássicos são Ly6C+ e são críticos para a resposta inflamatória inicial. Em contraste, os monócitos não clássicos são Ly6C e têm sido amplamente vistos como células anti-inflamatórias3,16,18. Recentemente, foi descrita uma população adicional de monócitos CD64+CD16.2+, que se originam de monócitos Ly6C e dão origem a IMs3 CD206+.
Os eosinófilos aparecem principalmente nos pulmões durante a infecção por helminto ou condições alérgicas. No entanto, há um pequeno número de eosinófilos no parenchyma pulmonar durante o estado estável, conhecidos como eosinófilos residentes. Ao contrário dos eosinófilos residentes, eosinófilos inflamatórios são encontrados no interstício pulmonar e na lavagem broncoalveolar (BAL). Em modelos de camundongos de ácaro de poeira doméstica (HDM), eosinófilos inflamatórios são recrutados para o pulmão após estimulação mediada por antígeno. Foi proposto que os eosinófilos residentes possam ter um papel regulatório na alergia, inibindo a sensibilização do auxiliar T 2 (Th2) para o HDM19.
Em contraste com o resto das células mielóides pulmonares, os neutrófilos expressam Ly6G, mas não CD68, e são caracterizados por uma assinatura do imunofenótipo CD68-Ly6G+16,20,21. Estudos de visualização mostraram que, durante o estado estável, o pulmão reserva um pool de neutrófilos no compartimento intravascular e hospeda um número considerável de neutrófilos extravasculares22. Semelhante aos eosinófilos, os neutrófilos não são encontrados em BAL em estado estável; no entanto, várias formas de estimulação imunológica, como desafio LPS, asma ou pneumonia, levam os neutrófilos para o lúmen alveolar, resultando em sua presença em BAL21,22,23.
Um número substancial de células CD45+ do pulmão representam o assassino natural (NK), células T e células B e são negativos para a maioria dos marcadores mieloides24. Nos pulmões de camundongos ingênuos, esses três tipos de células podem ser identificados com base na expressão de CD11b e MHC II18. Cerca de 25% das células CD45+ pulmonares são células B, enquanto a porcentagem de células NK é maior no pulmão do que outros tecidos linfoides e não linfoides24,25,26. Entre as células T pulmonares, uma fração considerável é CD4-CD8- e desempenha um papel importante nas infecções respiratórias26.
Como o pulmão possui um sistema imunológico muito complexo e único, várias estratégias de gating para a identificação de células imunes pulmonares foram desenvolvidas e relatadas16,18,20,27. A estratégia de gating descrita aqui fornece uma maneira abrangente e reprodutível de identificar até 12 populações imunes mielóides pulmonares e não mieloides usando 9 marcadores. Marcadores adicionais foram usados para validar os resultados. Além disso, é fornecido um método detalhado para a preparação de uma suspensão unicelular que minimize a morte celular e permita a identificação do perfil mais completo do compartimento de células imunes do pulmão. Deve-se notar que a identificação de células não imunes do pulmão, como células epiteliais (CD45-CD326+CD31-), células endoteliais (CD45-CD326-CD31+) e fibroblastos requer uma abordagem diferente28,29. A identificação dessas populações não está incluída no protocolo e método aqui descrito.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringe plunger</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon/corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101215</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117339 / 117337</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103115</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD64</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139319</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD68</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>137009</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse GR-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108433</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Siglec F</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>155503</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVERTIN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103228</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121405 / 121419</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>138503</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100205</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 1</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>149005</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123133</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcBlock (CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101301</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Serrated Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Futura Safety Scalpel</td>
			<td>Merit Medical Systems</td>
			<td>SMS210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L34973</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERTK</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>151505</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC-II</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107621</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108705</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>SORVAL ST 16R</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small curved scissor</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis for identification of the innate and adaptive immune cells of murine lung

O trato respiratório está em contato direto com o ambiente externo e requer um sistema imunológico precisamente regulado para fornecer proteção enquanto suprime reações indesejadas a antígenos ambientais. Os pulmões abrigam várias populações de células imunes inatas e adaptáveis que fornecem vigilância imunológica, mas também mediam respostas imunes protetoras. Essas células, que mantêm o sistema imunológico pulmonar saudável em equilíbrio, também participam de várias condições patológicas, como asma, infecções, doenças autoimunes e câncer. A expressão seletiva de proteínas superficiais e intracelulares fornece propriedades imunofenópicas únicas às células imunes do pulmão. Consequentemente, a citometria de fluxo tem um papel fundamental na identificação dessas populações celulares durante condições de estado estável e patológico. Este artigo apresenta um protocolo que descreve um método consistente e reprodutível para identificar as células imunes que residem nos pulmões de camundongos saudáveis em condições de estado estável. No entanto, este protocolo também pode ser usado para identificar alterações nessas populações celulares em vários modelos de doenças para ajudar a identificar alterações específicas da doença na paisagem imunológica pulmonar.

Estratégia gating O primeiro passo da nossa estratégia de gating é a exclusão dos detritos e dobras (Figura 1A). A exclusão cuidadosa dos doublets é fundamental para evitar populações falso-positivas (Figura Suplementar S2). Em seguida, as células imunes são identificadas usando CD45+, um marcador para células hematopoiéticas (Figura 1B). A mancha morta pode ser adicionada para excluir células mortas. ...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

Neste estudo, apresentamos um protocolo eficaz e reprodutível para isolar as populações imunes do sistema respiratório murino. Também fornecemos um método para a identificação de todas as células imunes inatas e adaptativas que residem nos pulmões de camundongos saudáveis, usando um painel de citometria de fluxo baseado em 9 cores.

Análise Citométrica de Fluxo para Identificação das Células Imunes Inatas e Adaptativas do Pulmão murino

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

Como o pulmão possui um sistema imunológico muito complexo e único, várias estratégias de identificação de células imunes pulmonares foram desenvolvidas e relatadas. A existência de diversas abordagens diferentes dificulta a comparação de resultados gerados por diferentes laboratórios. Nossa estratégia de gating fornece uma maneira abrangente e reprodutível de identificar até 12 populações imunes pulmonares e não mieloides usando nove marcadores.O presente protocolo descreve a caracterização e identificação de populações imunes pulmonares em condições de estado estável. No entanto, este protocolo pode ser empregado para identificar alterações dessas populações de células em vários modelos de doenças, onde pode ajudar a identificar alterações específicas da doença da paisagem imunológica pulmonar. Os pesquisadores que realizam essa técnica pela primeira vez devem prestar atenção às condições de digestão e reagentes, pois fazem uma grande diferença na liberação de células imunes do tecido pulmonar.Comece preparando o animal eutanizado para a cirurgia. Estabilize o rato dorsalmente usando agulhas ou fitas nas quatro extremidades, depois use 70% de etanol para higienizar a pele da área ventral. Faça uma incisão do pescoço para o abdômen.Remova a pele da área torácica, juntamente com as costelas e o esterno. Lave os pulmões injetando 10 mililitros de PBS frio no ventrículo direito usando uma agulha de 18 a 21 graus até ficarem completamente brancos. Em seguida, remova o timo e o coração sem tocar nos pulmões.Retire os pulmões dos tecidos circundantes e transfira-os para um tubo contendo tampão BSA frio. Transfira o pulmão para uma placa de Petri, pique-o usando dois bisturis finos, e, em seguida, coloque-o em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione cinco mililitros de tampão de digestão para lavar a placa.Fixar a tampa do tubo e digerir o pulmão por 30 minutos em um agitador orbital a uma velocidade de 150 rotações por minuto a 37 graus Celsius. Pare a reação adicionando 10 mililitros de tampão BSA frio. Após a digestão, misture e dissolva os pedaços pulmonares usando uma agulha de calibre 18.Coloque um filtro de filtro de 70 micrômetros em cima de um novo tubo cônico de 50 mililitros e transfira a mistura pulmonar digerida para o coador. Use o lado de borracha de um êmbolo de seringa de 10 mililitros para esmagar as peças de pulmão restantes no filtro e lavá-lo com tampão BSA. Centrifugar a suspensão unicelular a 350 G por oito minutos a sete graus Celsius.Descarte o supernatante e resuspenja as células em um mililitro de tampão de lise ACK. Misture a suspensão usando uma pipeta de um mililitro e incuba-a por 90 segundos à temperatura ambiente. Adicione 10 mililitros de tampão BSA frio à mistura de reação e centrifuse-o a 350 G por sete minutos a quatro graus Celsius.Descarte o supernatante, resuspenque a pelota no tampão de coloração e conte as células usando um hemótmetro. Resuspend as células a uma concentração de 5 milhões de células por mililitro para coloração superficial. Transfira 1 milhão de células em 200 microliters por poço em uma placa de 96 poços e centrifugar a placa a 350 G por sete minutos a quatro graus Celsius.Prepare uma solução de bloco de citometria de fluxo diluindo anticorpos anti-1632 no tampão de coloração. Resuspense as células em 50 microliters da solução de bloco de citometria de fluxo. Incubar a suspensão por 15 a 20 minutos a quatro graus para Celsius ou no gelo.Em seguida, adicione 150 microliters de tampão de coloração à placa e centrífuga 350 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Prepare a solução de anticorpos superficiais diluindo os anticorpos superficiais no tampão de coloração. Resuspenque as células em 50 microliters da solução de anticorpos superficiais e incuba a placa a quatro graus Celsius no escuro.Em seguida, lave as células duas vezes com tampão de coloração. Prepare o tampão de fixação e permeabilização misturando três partes de fixação e diluente de permeabilização e uma parte do tampão de coloração. Resuspenque as células em 50 microliters do buffer pré-preparado por poço da placa de 96 poços e incuba-as por 20 a 25 minutos a quatro graus Celsius no escuro.Diluir o tampão de permeabilização com água deionizada purificada para preparar uma vez o tampão de permeabilização e usá-lo para lavar as células. Prepare uma solução de anticorpos intracelulares diluindo com um mililitro de tampão de permeabilização. Resuspenque as células em 50 microlitres da solução de anticorpos intracelular diluídos por poço da placa de 96 poços e incubar por 40 minutos a quatro graus Celsius no escuro.Lave as células com tampão de permeabilização e, em seguida, com tampão de coloração. Após a lavagem final, resuspenja as células em 200 microliters de tampão de coloração. Adquira um mínimo de 1,5 milhão de células por amostra no citômetro de fluxo.Após uma cirurgia bem sucedida e procedimento pós-operatório adequado, os detritos e dobras foram excluídos por meio de uma estratégia de gating. As células imunes foram identificadas utilizando o marcador CD45+hematopoiético por citometria de fluxo. As células eram distinguidas como vivas ou mortas.As células pulmonares imunes foram categorizadas em três grupos usando anticorpos anti-GR-1 e anti-CD68. Os neutrófilos foram identificados e verificados utilizando-se Ly6G como um marcador único. A população CD45+também contém células assassinas naturais, células T e células B.Estas células foram manchadas e verificadas por anticorpos assassinos naturais 1.1, CD3 e B220. A lavagem broncoalveolar identificou eosinófilos positivos para o marcador CD11b, e macrófagos alveolares que não expressaram altos níveis de CD11b. CÉLULAs CD45+dendríticas foram encontradas e confirmadas pela expressão CD24.Essas células apresentaram uma resposta positiva ou negativa em relação aos marcadores CD103 e CD11b. As células negativas CD103 foram classificadas como células dendríticas convencionais e derivadas de monócitos com base na expressão CD64. as células dendríticas derivadas do monócito foram baixas positivas para o marcador dendrático CD24 e positivas para o marcador pan-macrófago CD64.Macrófagos intersticiais com monócitos clássicos e não clássicos foram distinguidos com base na expressão CD64 e GR-1. Estas células mostraram expressão positiva para o receptor de quimioterapia CX3C um. Os passos mais importantes neste procedimento são a colheita adequada de tecidos, digestão e preparação de suspensão unicelular, e gating em células vivas e singlets.Além de caracterizar células imunes do pulmão por citometria de fluxo, a cultura celular e ensaios funcionais podem ser realizados em populações celulares isoladas. Essa técnica pode abrir caminho para os pesquisadores explorarem novas questões em doenças do pulmão, como infecções, doenças autoimunes e câncer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Imunologia e Infecção

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolamento e identificação de células do sistema imunológico Extravascular do coração

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...