Name: flow cytometric analysis for identification of the innate and adaptive immune cells of murine lung
Uploaded: 2021-11-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами NIH R01CA238263 и R01CA229784 (VAB).

Все исследования и эксперименты, описанные в этом протоколе, были проведены в соответствии с руководящими принципами в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского центра Бет Исраэль Диаконисс. Для разработки этого протокола и?...

<ol>
	<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF.">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li><li>Tan, S. Y., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+of+lung+macrophage+diversity.">Developmental origin of lung macrophage diversity.</a> Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).</li><li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung.">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).</li><li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state.">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li><li>Ural, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nerve-associated,+lung-resident+interstitial+macrophage+subset+with+distinct+localization+and+immunoregulatory+properties.">Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties.</a> Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).</li><li>Chakarov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+interstitial+macrophage+populations+coexist+across+tissues+in+specific+subtissular+niches.">Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches.</a> Science. 363 (6432), (2019).</li><li>Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interstitial+macrophage:+A+long-neglected+piece+in+the+puzzle+of+lung+immunity.">The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity.</a> Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).</li><li>Stouch, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaB+kinase+activity+drives+fetal+lung+macrophage+maturation+along+a+non-M1/M2+paradigm.">IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm.</a> Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).</li><li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells.">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).</li><li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+and+monocyte-derived+CD11b(+)+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen.">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+trafficking+and+function+in+rare+lung+diseases.">Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).</li><li>Cook, P. C., MacDonald, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+lung+immunopathology.">Dendritic cells in lung immunopathology.</a> Seminars in Immunopathology. 38, 449-460 (2016).</li><li>Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+between+lung+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+defense+against+pulmonary+infections.">Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections.</a> Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).</li><li>Nobs, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR&#947;+in+dendritic+cells+and+T+cells+drives+pathogenic+type-2+effector+responses+in+lung+inflammation.">PPAR&#947; in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).</li><li>Aegerter, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza-induced+monocyte-derived+alveolar+macrophages+confer+prolonged+antibacterial+protection.">Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection.</a> Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).</li><li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung.">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).</li><li>Hoffmann, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+interaction+of+murine+pulmonary+phagocytes+in+the+naive+and+allergic+lung.">Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Mesnil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-resident+eosinophils+represent+a+distinct+regulatory+eosinophil+subset.">Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).</li><li>Zaynagetdinov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+myeloid+cell+subsets+in+murine+lungs+using+flow+cytometry.">Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).</li><li>Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+self-limited+acute+lung+injury+by+unilateral+intra-bronchial+acid+instillation.">A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Krishnamoorthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+cytoplasts+induce+TH17+differentiation+and+skew+inflammation+toward+neutrophilia+in+severe+asthma.">Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma.</a> Science Immunology. 3 (26), (2018).</li><li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3+CD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire.">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+natural+killer+cells+in+mice:+phenotype+and+response+to+respiratory+infection.">Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection.</a> Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).</li><li>Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+CD4-CD8-+double-negative+T+cells+are+prominent+producers+of+IL-17A+and+IFN-gamma+during+primary+respiratory+murine+infection+with+Francisella+tularensis+live+vaccine+strain.">Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain.</a> Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).</li><li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V., Alper, S., Janssen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mononuclear+phagocytes+in+the+mouse+lung+and+lymph+nodes.+In+Lung+innate+immunity+and+inflammation.">Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation.</a> Methods in Molecular Biology. 1809, (2018).</li><li>Singer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+method+for+simultaneous+analysis+of+mouse+lung+epithelial,+endothelial,+and+hematopoietic+lineage+cells.">Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).</li><li>Matsushima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD248+and+integrin+alpha-8+are+candidate+markers+for+differentiating+lung+fibroblast+subtypes.">CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes.</a> BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).</li><li>Cong, J., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+in+the+lungs.">Natural killer cells in the lungs.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1416 (2019).</li><li>Daubeuf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast,+easy,+and+customizable+eight-color+flow+cytometric+method+for+analysis+of+the+cellular+content+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+the+mouse.">A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).</li><li>Yi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+recruitment+is+dynamically+regulated+by+interplay+among+lung+dendritic+cell+subsets+after+allergen+challenge.">Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge.</a> Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).</li><li>Langlet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD64+expression+distinguishes+monocyte-derived+and+conventional+dendritic+cells+and+reveals+their+distinct+role+during+intramuscular+immunization.">CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization.</a> Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).</li><li>Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+Ccr7+expression+in+distinct+lineages+of+lung+dendritic+cells.">Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).</li><li>Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+interstitial+macrophages:+past,+present,+and+future.">Lung interstitial macrophages: past, present, and future.</a> Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).</li><li>Krljanac, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELMalpha-expressing+macrophages+protect+against+fatal+lung+damage+and+reduce+parasite+burden+during+helminth+infection.">RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection.</a> Science Immunology. 4 (35), (2019).</li><li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis.">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li><li>Svedberg, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+environment+controls+alveolar+macrophage+metabolism+and+responsiveness+in+type+2+inflammation.">The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation.</a> Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).</li><li>Yona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+origins+and+dynamics+of+monocytes+and+tissue+macrophages+under+homeostasis.">Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis.</a> Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).</li><li>Misharin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span.">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).</li><li>Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Interstitial+Macrophages:+Establishing+Identity+and+Uncovering+Heterogeneity.">Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).</li></ol>

Идентификация легочных иммунных клеток может быть сложной задачей из-за нескольких типов иммунных клеток, находящихся в легких, и их уникальных иммунофенотипических характеристик по сравнению с их аналогами, находящимися в других тканях. При некоторых патологических состояниях клет?...

Мышиные дыхательные пути содержат уникальную иммунную систему, отвечающую за борьбу с патогенами и поддержание иммунного гомеостаза. Легочная иммунная система состоит из клеточных популяций со значительной гетерогенностью по фенотипу, функции, происхождению и расположению. Резидентные альвеолярные макрофаги (АМ), происходящие в основном из моноцитов плода, находятся в альвеолярном просвете1, в то время как интерстициальные макрофаги (ИМ), полученные из костного мозга, находятся в паренхиме легких2. IM могут быть дополнительно подклассифицированы выражением CD206. CD206+ IM заполняют перибронхиальную и периваскулярную область, в то время как CD206-IM расположены в альвеолярном интерстиции3. Недавно было предложено несколько подклассификаций ИМ3,4,5,6. Хотя ИМ менее изучены, чем АМ, последние данные подтверждают их решающую роль в регуляции иммунной системы легких7. Кроме того, CD206 также выражается в альтернативно активированных AMs8.
Легочные дендритные клетки (ДК) являются еще одной гетерогенной группой иммунных клеток легких в отношении их функциональных свойств, местоположения и происхождения. В легких были описаны четыре подкатегории ДК: обычные CD103+ DC (также известные как cDC1), обычные CD11b+ DC (также известные как cDC2), моноцитарные ДК (MoDC) и плазмоцитоидные DC9,10,11,12,13. Первые три подкласса можно определить как основной комплекс гистосовместимости (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Плазмоцитоидные ДК экспрессируют MHC II и являются промежуточными положительными для CD11c, но экспрессируют высокие уровни B220 и PDCA-19,13,16. В наивных мышиных легких CD103 DC и CD11b DC расположены в интерстиции дыхательных путей, тогда как плазмоцитоидные ДК расположены в альвеолярном интерстиции17.
Две основные популяции моноцитов находятся в легких во время устойчивого состояния: классические моноциты и неклассические моноциты. Классические моноциты являются Ly6C+ и имеют решающее значение для первоначальной воспалительной реакции. Напротив, неклассические моноциты являются Ly6C- и широко рассматриваются как противовоспалительные клетки3,16,18. Недавно была описана дополнительная популяция моноцитов CD64 +CD16.2+, которые происходят из Ly6C-моноцитов и дают начало CD206+ IMs3.
Эозинофилы в основном появляются в легких во время гельминтной инфекции или аллергических состояний. Тем не менее, существует небольшое количество эозинофилов в легочной паренхиме во время устойчивого состояния, известных как резидентные эозинофилы. В отличие от резидентных эозинофилов, воспалительные эозинофилы обнаруживаются в интерстиции легких и бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ). В мышиных моделях клеща домашней пыли (HDM) воспалительные эозинофилы набираются в легкие после антиген-опосредованной стимуляции. Было высказано предположение, что резидентные эозинофилы могут играть регулирующую роль в аллергии, ингибируя сенсибилизацию Т-хелпера 2 (Th2) к HDM19.
В отличие от остальных легочных миелоидных клеток, нейтрофилы экспрессируют Ly6G, но не CD68, и характеризуются сигнатурой иммунофенотипа CD68-Ly6G+16,20,21. Исследования визуализации показали, что в установившемся состоянии легкое резервирует пул нейтрофилов во внутрисосудистом компартменте и содержит значительное количество внесосудистых нейтрофилов22. Подобно эозинофилам, нейтрофилы не обнаруживаются в БАЛ в установившемся состоянии; однако несколько форм иммунной стимуляции, таких как вызов ЛПС, астма или пневмония, загоняют нейтрофилы в альвеолярный просвет, что приводит к их присутствию в BAL21,22,23.
Значительное количество CD45+ клеток легких представляют собой естественный киллер (NK), Т-клетки и В-клетки и являются отрицательными для большинства миелоидных маркеров24. В легких наивных мышей эти три типа клеток могут быть идентифицированы на основе экспрессии CD11b и MHC II18. Около 25% легочных CD45+ клеток являются В-клетками, тогда как процент NK-клеток выше в легких, чем в других лимфоидных и нелимфоидных тканях24,25,26. Среди легочных Т-клеток значительную долю составляет CD4-CD8- и играет важную роль при респираторных инфекциях26.
Поскольку в легких находится очень сложная и уникальная иммунная система, было разработано несколько стратегий идентификации иммунных клеток легких16,18,20,27. Стратегия гатинга, описанная в настоящем описании, обеспечивает комплексный и воспроизводимый способ идентификации до 12 различных легочных миелоидных и немиелоидных иммунных популяций с использованием 9 маркеров. Для проверки результатов использовались дополнительные маркеры. Кроме того, предусмотрен подробный способ получения одноклеточной суспензии, которая минимизирует гибель клеток и позволяет идентифицировать наиболее полный профиль иммунно-клеточного компартмента легкого. Следует отметить, что идентификация неиммунных клеток легких, таких как эпителиальные клетки (CD45-CD326+CD31-), эндотелиальные клетки (CD45-CD326-CD31+) и фибробласты, требует иного подхода28,29. Идентификация таких популяций не включена в протокол и метод, описанные здесь.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringe plunger</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon/corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101215</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117339 / 117337</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103115</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD64</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139319</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD68</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>137009</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse GR-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108433</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Siglec F</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>155503</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVERTIN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103228</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121405 / 121419</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>138503</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100205</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 1</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>149005</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123133</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcBlock (CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101301</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Serrated Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Futura Safety Scalpel</td>
			<td>Merit Medical Systems</td>
			<td>SMS210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L34973</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERTK</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>151505</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC-II</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107621</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108705</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>SORVAL ST 16R</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small curved scissor</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis for identification of the innate and adaptive immune cells of murine lung

Дыхательные пути находятся в непосредственном контакте с внешней средой и требуют точно регулируемой иммунной системы для обеспечения защиты при подавлении нежелательных реакций на антигены окружающей среды. Легкие содержат несколько популяций врожденных и адаптивных иммунных клеток, которые обеспечивают иммунный надзор, но также опосредуют защитные иммунные реакции. Эти клетки, которые поддерживают здоровую легочную иммунную систему в равновесии, также участвуют в нескольких патологических состояниях, таких как астма, инфекции, аутоиммунные заболевания и рак. Селективная экспрессия поверхностных и внутриклеточных белков обеспечивает уникальные иммунофенотипические свойства иммунным клеткам легкого. Следовательно, проточная цитометрия играет важную роль в идентификации таких клеточных популяций во время стационарных и патологических состояний. В этой статье представлен протокол, который описывает последовательный и воспроизводимый метод идентификации иммунных клеток, которые находятся в легких здоровых мышей в стационарных условиях. Тем не менее, этот протокол также может быть использован для выявления изменений в этих клеточных популяциях в различных моделях заболеваний, чтобы помочь идентифицировать специфические для заболевания изменения в иммунном ландшафте легких.

Стратегия гейтинга Первым шагом нашей стратегии гаширования является исключение мусора и дублетов (рисунок 1А). Тщательное исключение дублетов имеет решающее значение для предотвращения ложноположительных популяций (дополнительный рисунок S2). Зат?...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

В этом исследовании мы представляем эффективный и воспроизводимый протокол для изоляции иммунных популяций дыхательной системы мышей. Мы также предоставляем метод идентификации всех врожденных и адаптивных иммунных клеток, которые находятся в легких здоровых мышей, с помощью 9-цветной панели проточной цитометрии.

Проточный цитометрический анализ для идентификации врожденных и адаптивных иммунных клеток мышиных легких

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

Поскольку в легких находится очень сложная и уникальная иммунная система, было разработано и сообщено о нескольких стратегиях определения иммунных клеток легких. Существование нескольких различных подходов затрудняет сравнение результатов, полученных различными лабораториями. Наша стратегия гейтинга обеспечивает комплексный и воспроизводимый способ идентификации до 12 различных легочных миелоидных и немиелоидных иммунных популяций с использованием девяти маркеров.Настоящий протокол описывает характеристику и идентификацию иммунных популяций легких в стационарных условиях. Тем не менее, этот протокол может быть использован для выявления изменений этих клеточных популяций в различных моделях заболеваний, где он может помочь идентифицировать специфические для заболевания изменения иммунного ландшафта легких. Исследователи, которые выполняют эту технику впервые, должны обратить внимание на условия пищеварения и реагенты, так как они имеют большое значение в высвобождении иммунных клеток из легочной ткани.Начните с подготовки усыпленного животного к операции. Стабилизируйте мышь дорсально, используя иглы или ленту на четырех конечностях, затем используйте 70% этанол для дезинфекции кожи вентральной области. Сделайте разрез от шеи до живота.Удалите кожу с грудного отдела вместе с ребрами и грудиной. Промывайте легкие, вводя 10 миллилитров холодного PBS в правый желудочек с помощью иглы 18-21 калибра, пока они не станут полностью белыми. Затем удалите тимус и сердце, не касаясь легких.Отделите легкие от окружающих тканей и перенесите их в трубку, содержащую холодный буфер BSA. Переложите легкое в чашку Петри, измельчите его с помощью двух тонких скальпелей, а затем поместите в 50-миллилитровую коническую трубку. Добавьте пять миллилитров буфера пищеварения, чтобы промыть пластину.Закрепите крышку трубки и переваривайте легкое в течение 30 минут на орбитальном шейкере со скоростью 150 оборотов в минуту при 37 градусах Цельсия. Остановите реакцию, добавив 10 миллилитров холодного буфера BSA. После пищеварения смешайте и растворите кусочки легких с помощью иглы 18-го калибра.Поместите 70-микрометровый фильтрующий фильтр поверх новой 50-миллилитровой конической трубки и перенесите переваренную смесь легких в ситечко. Используйте резиновую сторону 10-миллилитрового плунжера шприца, чтобы разбить оставшиеся части легких на фильтре и промыть его буфером BSA. Центрифугировать одноэлементную суспензию при 350 Г в течение восьми минут при семи градусах Цельсия.Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре буфера лизиса ACK. Смешайте суспензию с помощью одномиллилитровой пипетки и инкубируйте ее в течение 90 секунд при комнатной температуре. Добавьте 10 миллилитров холодного буфера BSA в реакционную смесь и центрифугируйте ее при 350 G в течение семи минут при четырех градусах Цельсия.Выбросьте супернатант, повторно суспендируйте гранулу в буфере окрашивания и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Повторное суспендирование клеток в концентрации 5 миллионов клеток на миллилитр для окрашивания поверхности. Переместите 1 миллион ячеек по 200 микролитров на скважину в 96-луночную пластину и центрифугируйте пластину при 350 G в течение семи минут при четырех градусах Цельсия.Готовят раствор блока проточной цитометрии путем разбавления антитела анти-1632 в буфере окрашивания. Повторное суспендирование клеток в 50 микролитрах раствора блока проточной цитометрии. Инкубировать суспензию в течение 15-20 минут при четырех градусах Цельсия или на льду.Затем добавьте 150 микролитров окрашивающего буфера на пластину и центрифугируйте ее 350 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Готовят раствор поверхностных антител путем разбавления поверхностных антител в окрашивающем буфере. Повторно суспендируют клетки в 50 микролитрах поверхностного раствора антител и инкубируют пластину при четырех градусах Цельсия в темноте.Затем дважды промыть клетки с помощью окрашивающего буфера. Подготовьте буфер фиксации и пермеабилизации, смешивая три части фиксирующего и пермеабилизирующего разбавителя и одну часть окрашивающего буфера. Повторно суспендируют клетки в 50 микролитрах предварительно подготовленного буфера на лунку 96-луночной пластины и инкубируют их в течение 20-25 минут при четырех градусах Цельсия в темноте.Разбавьте буфер пермеабилизации очищенной деионизированной водой, чтобы подготовить один раз буфер пермеабилизации, и используйте его для промывки клеток. Готовят внутриклеточный раствор антител путем разбавления одним миллилитром пермеабилизационного буфера. Повторно суспендируют клетки в 50 микролитрах разбавленного внутриклеточного раствора антител на лунку 96-луночной пластины и инкубируют в течение 40 минут при четырех градусах Цельсия в темноте.Промыть клетки буфером пермеабилизации, затем буфером окрашивания. После окончательной промывки повторно суспендируйте клетки в 200 микролитров окрашивающего буфера. Приобретите минимум 1,5 миллиона клеток на образец на проточном цитометре.После успешной операции и соответствующей послеоперационной процедуры обломки и дублеты были исключены с помощью стратегии гатинга. Иммунные клетки были идентифицированы с использованием маркера CD45 + кроветворения с помощью проточной цитометрии. Клетки различались как живые или мертвые.Иммунные клетки легких были разделены на три группы с использованием антител против GR-1 и против CD68. Нейтрофилы были идентифицированы и проверены с использованием Ly6G в качестве уникального маркера. Популяция CD45 + также содержит естественные клетки-киллеры, Т-клетки и В-клетки.Эти клетки были окрашены и проверены естественными антителами-киллерами 1.1, CD3 и B220. Бронхоальвеолярный лаваж идентифицировал эозинофилы, которые были положительными для маркера CD11b, и альвеолярные макрофаги, которые не экспрессировали высокие уровни CD11b. CD45 + дендритные клетки были обнаружены и подтверждены экспрессией CD24.Эти клетки показали либо положительный, либо отрицательный ответ на маркеры CD103 и CD11b. CD103 отрицательные клетки были классифицированы как обычные и моноцитарные дендритные клетки на основе экспрессии CD64. дендритные клетки, полученные из моноцитов, были низкоположительными для дендритного маркера CD24 и положительными для маркера пан-макрофагов CD64.Различают интерстициальные макрофаги с классическими и неклассическими моноцитами на основе экспрессии CD64 и GR-1. Эти клетки показали положительную экспрессию для рецептора хемокина CX3C. Наиболее важными шагами в этой процедуре являются правильный сбор тканей, пищеварение и приготовление одноклеточной суспензии, а также захват живых клеток и синглетов.В дополнение к характеристике иммунных клеток легких с помощью проточной цитометрии, клеточная культура и функциональные анализы могут быть выполнены в изолированных клеточных популяциях. Этот метод может проложить путь для исследователей для изучения новых вопросов в заболеваниях легких, таких как инфекции, аутоиммунные заболевания и рак.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Проточной цитометрии анализа иммунных клеток мышей В аорты

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Проточной цитометрии Выделение первичных мышиных Type II альвеолярных эпителиальных клеток для функционального и молекулярных исследований

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Использование РНК-интерференции по расследованию врожденного иммунного ответа у мышей макрофагов

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Выделение и проточной цитометрии анализ иммунных клеток из мозга ишемического Mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Выделение и проточной цитометрии анализ глиомы инфильтрирующие мононуклеарных клеток периферической крови

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Выделение и проточной цитометрии Характеристика мышиных лимфоцитах тонкого кишечника

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Выделение и Flow Cytometric Анализ человеческого Endocervical Гамма-Дельта Т-клеток

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Изоляция и определение внесосудистой иммунных клеток сердца

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Пищеварение мышиных печени для анализа гранулярных поток лимфы эндотелиальных клеток

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...