Name: flow cytometric analysis for identification of the innate and adaptive immune cells of murine lung
Uploaded: 2021-11-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01CA238263 y R01CA229784 (VAB).

Todos los estudios y experimentos descritos en este protocolo se llevaron a cabo bajo pautas de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Médico Beth Israel Deaconess. Se utilizaron ratones C57BL/6 de seis a diez semanas de edad de ambos sexos para desarrollar este protocolo.
1. Escisión quirúrgica y preparación de tejidos
<ol><li>Eutanasiar al ratón inyectando intraperitonealmente 1 ml de tribromoetanol (preparado según protocolo estándar; <...

<ol>
	<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF.">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li><li>Tan, S. Y., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+of+lung+macrophage+diversity.">Developmental origin of lung macrophage diversity.</a> Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).</li><li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung.">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).</li><li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state.">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li><li>Ural, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+nerve-associated,+lung-resident+interstitial+macrophage+subset+with+distinct+localization+and+immunoregulatory+properties.">Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties.</a> Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).</li><li>Chakarov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+interstitial+macrophage+populations+coexist+across+tissues+in+specific+subtissular+niches.">Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches.</a> Science. 363 (6432), (2019).</li><li>Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interstitial+macrophage:+A+long-neglected+piece+in+the+puzzle+of+lung+immunity.">The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity.</a> Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).</li><li>Stouch, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IkappaB+kinase+activity+drives+fetal+lung+macrophage+maturation+along+a+non-M1/M2+paradigm.">IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm.</a> Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).</li><li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells.">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).</li><li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+and+monocyte-derived+CD11b(+)+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen.">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+trafficking+and+function+in+rare+lung+diseases.">Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).</li><li>Cook, P. C., MacDonald, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+lung+immunopathology.">Dendritic cells in lung immunopathology.</a> Seminars in Immunopathology. 38, 449-460 (2016).</li><li>Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+between+lung+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+defense+against+pulmonary+infections.">Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections.</a> Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).</li><li>Nobs, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR&#947;+in+dendritic+cells+and+T+cells+drives+pathogenic+type-2+effector+responses+in+lung+inflammation.">PPAR&#947; in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).</li><li>Aegerter, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza-induced+monocyte-derived+alveolar+macrophages+confer+prolonged+antibacterial+protection.">Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection.</a> Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).</li><li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung.">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).</li><li>Hoffmann, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+interaction+of+murine+pulmonary+phagocytes+in+the+naive+and+allergic+lung.">Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Mesnil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-resident+eosinophils+represent+a+distinct+regulatory+eosinophil+subset.">Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).</li><li>Zaynagetdinov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+myeloid+cell+subsets+in+murine+lungs+using+flow+cytometry.">Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).</li><li>Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+self-limited+acute+lung+injury+by+unilateral+intra-bronchial+acid+instillation.">A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Krishnamoorthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+cytoplasts+induce+TH17+differentiation+and+skew+inflammation+toward+neutrophilia+in+severe+asthma.">Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma.</a> Science Immunology. 3 (26), (2018).</li><li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3+CD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire.">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+natural+killer+cells+in+mice:+phenotype+and+response+to+respiratory+infection.">Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection.</a> Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).</li><li>Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+CD4-CD8-+double-negative+T+cells+are+prominent+producers+of+IL-17A+and+IFN-gamma+during+primary+respiratory+murine+infection+with+Francisella+tularensis+live+vaccine+strain.">Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain.</a> Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).</li><li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V., Alper, S., Janssen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mononuclear+phagocytes+in+the+mouse+lung+and+lymph+nodes.+In+Lung+innate+immunity+and+inflammation.">Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation.</a> Methods in Molecular Biology. 1809, (2018).</li><li>Singer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+method+for+simultaneous+analysis+of+mouse+lung+epithelial,+endothelial,+and+hematopoietic+lineage+cells.">Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).</li><li>Matsushima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD248+and+integrin+alpha-8+are+candidate+markers+for+differentiating+lung+fibroblast+subtypes.">CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes.</a> BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).</li><li>Cong, J., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+in+the+lungs.">Natural killer cells in the lungs.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1416 (2019).</li><li>Daubeuf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast,+easy,+and+customizable+eight-color+flow+cytometric+method+for+analysis+of+the+cellular+content+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+the+mouse.">A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).</li><li>Yi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+recruitment+is+dynamically+regulated+by+interplay+among+lung+dendritic+cell+subsets+after+allergen+challenge.">Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge.</a> Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).</li><li>Langlet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD64+expression+distinguishes+monocyte-derived+and+conventional+dendritic+cells+and+reveals+their+distinct+role+during+intramuscular+immunization.">CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization.</a> Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).</li><li>Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+Ccr7+expression+in+distinct+lineages+of+lung+dendritic+cells.">Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).</li><li>Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+interstitial+macrophages:+past,+present,+and+future.">Lung interstitial macrophages: past, present, and future.</a> Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).</li><li>Krljanac, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELMalpha-expressing+macrophages+protect+against+fatal+lung+damage+and+reduce+parasite+burden+during+helminth+infection.">RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection.</a> Science Immunology. 4 (35), (2019).</li><li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis.">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li><li>Svedberg, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+environment+controls+alveolar+macrophage+metabolism+and+responsiveness+in+type+2+inflammation.">The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation.</a> Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).</li><li>Yona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+origins+and+dynamics+of+monocytes+and+tissue+macrophages+under+homeostasis.">Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis.</a> Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).</li><li>Misharin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span.">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).</li><li>Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Interstitial+Macrophages:+Establishing+Identity+and+Uncovering+Heterogeneity.">Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).</li></ol>

La identificación de las células inmunes pulmonares puede ser un desafío debido a los múltiples tipos de células inmunes que residen en el pulmón y sus características inmunofenotípicas únicas en comparación con sus contrapartes que residen en otros tejidos. En varias condiciones patológicas, las células con características fenotípicas distintas aparecen en los pulmones. Por ejemplo, la lesión pulmonar inducida por bleomicina resulta en el reclutamiento de macrófagos circulantes derivados de monocitos en ...

El tracto respiratorio murino contiene un sistema inmunológico único responsable de combatir los patógenos y mantener la homeostasis inmune. El sistema inmune pulmonar consiste en poblaciones celulares con heterogeneidad significativa en su fenotipo, función, origen y ubicación. Los macrófagos alveolares residentes (AM), originados principalmente a partir de monocitos fetales, residen en la luz alveolar1, mientras que los macrófagos intersticiales (IM) derivados de la médula ósea residen en el parénquima pulmonar2. Los mensajes instantáneos se pueden subclasificar aún más mediante la expresión de CD206. Los IM CD206+ pueblan el área peribronquial y perivascular, mientras que los IM CD206- se encuentran en el intersticio alveolar3. Recientemente se han propuesto algunas subclasificaciones de IM3,4,5,6. Aunque los IM están menos estudiados que los AM, la evidencia reciente apoya su papel crucial en la regulación del sistema inmune del pulmón7. Además, CD206 también se expresa en AMs8 activado alternativamente.
Las células dendríticas pulmonares (CD) son otro grupo heterogéneo de células inmunes pulmonares con respecto a sus propiedades funcionales, ubicación y origen. Se han descrito cuatro subcategorías de DC en el pulmón: DC CD103+ convencionales (también conocidos como cDC1), CD CD11b+ convencionales (también conocidos como cDC2), DC derivados de monocitos (MoDC) y DC plasmocitoides9,10,11,12,13. Las tres primeras subclases se pueden definir como complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Los DC plasmocitoides expresan MHC II y son intermediamente positivos para CD11c, pero expresan altos niveles de B220 y PDCA-19,13,16. En los pulmones murinos naïve, los CD CD103 y cd11b se localizan en el intersticio de las vías respiratorias, mientras que los CD plasmocitoides se localizan en el intersticio alveolar17.
Dos poblaciones principales de monocitos residen en el pulmón durante el estado estacionario: monocitos clásicos y monocitos no clásicos. Los monocitos clásicos son Ly6C+ y son críticos para la respuesta inflamatoria inicial. Por el contrario, los monocitos no clásicos son Ly6C- y han sido ampliamente vistos como células antiinflamatorias3,16,18. Recientemente, se describió una población adicional de monocitos CD64+CD16.2+, que se originan a partir de monocitos Ly6C- y dan lugar a IM CD206+3.
Los eosinófilos aparecen principalmente en los pulmones durante la infección por helmintos o afecciones alérgicas. Sin embargo, hay un pequeño número de eosinófilos en el parénquima pulmonar durante el estado estacionario, conocidos como eosinófilos residentes. A diferencia de los eosinófilos residentes, los eosinófilos inflamatorios se encuentran en el intersticio pulmonar y el lavado broncoalveolar (BAL). En modelos de ratón de ácaros del polvo doméstico (HDM), los eosinófilos inflamatorios se reclutan en el pulmón después de la estimulación mediada por antígenos. Se ha propuesto que los eosinófilos residentes podrían tener un papel regulador en la alergia al inhibir la sensibilización del T helper 2 (Th2) a HDM19.
A diferencia del resto de células mieloides pulmonares, los neutrófilos expresan Ly6G pero no CD68 y se caracterizan por una firma del inmunofenotipo CD68-Ly6G+16,20,21. Los estudios de visualización han demostrado que durante el estado estacionario, el pulmón reserva un grupo de neutrófilos en el compartimento intravascular y alberga un número considerable de neutrófilos extravasculares22. Al igual que los eosinófilos, los neutrófilos no se encuentran en BAL en estado estacionario; sin embargo, varias formas de estimulación inmune, como el desafío LPS, el asma o la neumonía, conducen a los neutrófilos a la luz alveolar, lo que resulta en su presencia en BAL21,22,23.
Un número sustancial de células CD45+ del pulmón representan un asesino natural (NK), células T y células B y son negativas para la mayoría de los marcadores mieloides24. En los pulmones de ratones ingenuos, estos tres tipos de células se pueden identificar en función de la expresión de CD11b y MHC II18. Alrededor del 25% de las células CD45+ pulmonares son células B, mientras que el porcentaje de células NK es mayor en el pulmón que en otros tejidos linfoides y no linfoides24,25,26. Entre las células T pulmonares, una fracción considerable es CD4-CD8- y juega un papel importante en las infecciones respiratorias26.
Debido a que el pulmón alberga un sistema inmune muy complejo y único, se han desarrollado y reportado varias estrategias de cierre para la identificación de células inmunes pulmonares16,18,20,27. La estrategia de cierre descrita en este documento proporciona una forma integral y reproducible de identificar hasta 12 poblaciones diferentes de inmunitarias mieloides pulmonares y no mieloides utilizando 9 marcadores. Se han utilizado marcadores adicionales para validar los resultados. Además, se proporciona un método detallado para la preparación de una suspensión unicelular que minimiza la muerte celular y permite la identificación del perfil más completo del compartimiento de células inmunes del pulmón. Cabe destacar que la identificación de células no inmunes del pulmón, como las células epiteliales (CD45-CD326+CD31-), las células endoteliales (CD45-CD326-CD31+) y los fibroblastos requiere un abordaje diferente28,29. La identificación de tales poblaciones no está incluida en el protocolo y método descritos aquí.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringe plunger</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>305165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon/corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101215</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117339 / 117337</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103115</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD64</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139319</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD68</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>137009</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse GR-1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108433</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Siglec F</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>155503</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVERTIN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>240486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103228</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121405 / 121419</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD24</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>138503</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100205</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 1</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CX3CR1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>149005</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123133</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcBlock (CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101301</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Serrated Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Futura Safety Scalpel</td>
			<td>Merit Medical Systems</td>
			<td>SMS210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L34973</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERTK</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>151505</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC-II</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107621</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108705</td>
			<td>For details see Table 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>SORVAL ST 16R</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small curved scissor</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis for identification of the innate and adaptive immune cells of murine lung

El tracto respiratorio está en contacto directo con el entorno exterior y requiere un sistema inmunológico regulado con precisión para proporcionar protección al tiempo que suprime las reacciones no deseadas a los antígenos ambientales. Los pulmones albergan varias poblaciones de células inmunes innatas y adaptativas que proporcionan vigilancia inmune, pero también median respuestas inmunes protectoras. Estas células, que mantienen el sistema inmunológico pulmonar sano en equilibrio, también participan en varias condiciones patológicas como el asma, infecciones, enfermedades autoinmunes y cáncer. La expresión selectiva de proteínas de superficie e intracelulares proporciona propiedades inmunofenotípicas únicas a las células inmunes del pulmón. En consecuencia, la citometría de flujo tiene un papel instrumental en la identificación de tales poblaciones celulares durante el estado estacionario y las condiciones patológicas. Este artículo presenta un protocolo que describe un método consistente y reproducible para identificar las células inmunes que residen en los pulmones de ratones sanos en condiciones de estado estacionario. Sin embargo, este protocolo también se puede utilizar para identificar cambios en estas poblaciones celulares en varios modelos de enfermedad para ayudar a identificar cambios específicos de la enfermedad en el panorama inmunológico pulmonar.

Estrategia de cierre El primer paso de nuestra estrategia de cierre es la exclusión de los escombros y dobletes (Figura 1A). La exclusión cuidadosa de los dobletes es fundamental para evitar poblaciones falsamente positivas (Figura suplementaria S2). Luego, las células inmunes se identifican utilizando CD45+, un marcador para las células hematopoyéticas (Figura 1B). La mancha de muerto vivo se puede agregar pa...

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Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

En este estudio, presentamos un protocolo eficaz y reproducible para aislar las poblaciones inmunes del sistema respiratorio murino. También proporcionamos un método para la identificación de todas las células inmunes innatas y adaptativas que residen en los pulmones de ratones sanos, utilizando un panel de citometría de flujo basado en 9 colores.

Análisis citométrico de flujo para la identificación de las células inmunes innatas y adaptativas del pulmón murino

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

Debido a que el pulmón alberga un sistema inmunológico muy complejo y único, se han desarrollado e informado varias estrategias de cierre para la identificación de células inmunes pulmonares. La existencia de varios enfoques diferentes dificulta la comparación de los resultados generados por diferentes laboratorios. Nuestra estrategia de cierre proporciona una forma integral y reproducible de identificar hasta 12 poblaciones inmunes mieloides pulmonares y no mieloides diferentes utilizando nueve marcadores.El presente protocolo describe la caracterización e identificación de poblaciones inmunes pulmonares en condiciones de estado estacionario. Sin embargo, este protocolo se puede emplear para identificar cambios de estas poblaciones celulares en varios modelos de enfermedad, donde puede ayudar a identificar cambios específicos de la enfermedad del panorama inmune pulmonar. Los investigadores que realizan esta técnica por primera vez deben prestar atención a las condiciones de digestión y los reactivos, ya que marcan una gran diferencia en la liberación de células inmunes del tejido pulmonar.Comience por preparar al animal sacrificado para la cirugía. Estabilice el ratón dorsalmente usando agujas o cinta adhesiva en las cuatro extremidades, luego use etanol al 70% para desinfectar la piel del área ventral. Haga una incisión desde el cuello hasta el abdomen.Retire la piel del área torácica, junto con las costillas y el esternón. Enjuague los pulmones inyectando 10 mililitros de PBS frío en el ventrículo derecho con una aguja de calibre 18 a 21 hasta que se vuelvan completamente blancos. Luego, retire el timo y el corazón sin tocar los pulmones.Separe los pulmones de los tejidos circundantes y transfiéralos a un tubo que contenga tampón BSA frío. Transfiera el pulmón a una placa de Petri, pica con dos bisturíes finos y luego colóquelo en un tubo cónico de 50 mililitros. Agregue cinco mililitros de tampón de digestión para lavar el plato.Asegure la tapa del tubo y digiera el pulmón durante 30 minutos en un agitador orbital a una velocidad de 150 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados. Detenga la reacción agregando 10 mililitros de tampón BSA frío. Después de la digestión, mezcle y disuelva las piezas pulmonares con una aguja de calibre 18.Coloque un filtro de 70 micrómetros encima de un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y transfiera la mezcla pulmonar digerida al colador. Use el lado de goma de un émbolo de jeringa de 10 mililitros para romper las piezas pulmonares restantes en el filtro y lavarlo con tampón BSA. Centrifugar la suspensión unicelular a 350 G durante ocho minutos a siete grados centígrados.Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en un mililitro de tampón de lisis ACK. Mezclar la suspensión con una pipeta de un mililitro e incubarla durante 90 segundos a temperatura ambiente. Agregue 10 mililitros de tampón BSA frío a la mezcla de reacción y centrífuga a 350 G durante siete minutos a cuatro grados centígrados.Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en tampón de tinción y cuente las células con un hemocitómetro. Resuspend las células a una concentración de 5 millones de células por mililitro para la tinción superficial. Transfiera 1 millón de células en 200 microlitros por pozo a una placa de 96 pocillos y centrífuga la placa a 350 G durante siete minutos a cuatro grados centígrados.Prepare una solución de bloque de citometría de flujo diluyendo el anticuerpo anti-1632 en tampón de tinción. Resuspend las células en 50 microlitros de la solución de bloque de citometría de flujo. Incubar la suspensión durante 15 a 20 minutos a cuatro grados centígrados o en hielo.Luego, agregue 150 microlitros de tampón de tinción a la placa y centrífuga 350 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Prepare la solución de anticuerpos de superficie diluyendo los anticuerpos de superficie en tampón de tinción. Resuspend las células en 50 microlitros de la solución de anticuerpos de superficie e incubar la placa a cuatro grados centígrados en la oscuridad.Luego, lave las células dos veces con tampón de tinción. Prepare el tampón de fijación y permeabilización mezclando tres partes de diluyente de fijación y permeabilización y una parte de tampón de tinción. Resuspend las células en 50 microlitros del tampón prepreparado por pozo de la placa de 96 pocillos e incube durante 20 a 25 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.Diluya el tampón de permeabilización con agua desionizada purificada para preparar una vez el tampón de permeabilización y úselo para lavar las células. Prepare una solución de anticuerpos intracelulares diluyendo con un mililitro de tampón de permeabilización. Resuspend las células en 50 microlitros de la solución de anticuerpos intracelulares diluidos por pocillo de la placa de 96 pocillos e incubar durante 40 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.Lave las células con tampón de permeabilización, luego con tampón de tinción. Después del lavado final, vuelva a suspender las células en 200 microlitros de tampón de tinción. Adquirir un mínimo de 1,5 millones de células por muestra en el citómetro de flujo.Después de una cirugía exitosa y un procedimiento postoperatorio apropiado, los desechos y los dobletes se excluyeron a través de una estrategia de cierre. Las células inmunes se identificaron utilizando el marcador hematopoyético CD45+ a través de citometría de flujo. Las células se distinguían como vivas o muertas.Las células pulmonares inmunes se clasificaron en tres grupos utilizando anticuerpos anti-GR-1 y anti-CD68. Los neutrófilos fueron identificados y verificados usando Ly6G como un marcador único. La población CD45 + también contiene células asesinas naturales, células T y células B.Estas células fueron teñidas y verificadas por anticuerpos asesinos naturales 1.1, CD3 y B220. El lavado broncoalveolar identificó eosinófilos que fueron positivos para el marcador CD11b, y macrófagos alveolares que no expresaron altos niveles de CD11b. Se encontraron células dendríticas CD45 + y se confirmaron mediante la expresión de CD24.Estas células mostraron una respuesta positiva o negativa hacia los marcadores CD103 y CD11b. Las células CD103 negativas se clasificaron como células dendríticas convencionales y derivadas de monocitos en función de la expresión de CD64. las células dendríticas derivadas de monocitos fueron bajas positivas para el marcador dendrítico CD24 y positivas para el marcador panmacrófago CD64.Los macrófagos intersticiales con monocitos clásicos y no clásicos se distinguieron en función de la expresión de CD64 y GR-1. Estas células mostraron una expresión positiva para el receptor de quimiocina CX3C uno. Los pasos más importantes en este procedimiento son la recolección adecuada de tejidos, la digestión y la preparación de la suspensión unicelular, y la apertura de células vivas y singletes.Además de caracterizar las células inmunes del pulmón mediante citometría de flujo, se pueden realizar cultivos celulares y ensayos funcionales en poblaciones celulares aisladas. Esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores exploren nuevas preguntas en enfermedades del pulmón, como infecciones, enfermedades autoinmunes y cáncer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Investigación

Inmunología e Infección

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

El aislamiento y la citometría de flujo análisis de las células mononucleares de sangre periférica Glioma infiltrantes

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Aislamiento y Análisis de citometría de flujo, de Human endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Aislamiento e identificación de las células inmunes Extravascular del corazón

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Digestión del hígado murino para el análisis cytometric del flujo de las células endoteliales linfáticas

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...