Name: brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors
Uploaded: 2021-12-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال المنحة 075-15-2019-1669 من وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي (تحليل RT-PCR) والمنحة رقم 19-15-00425 من مؤسسة العلوم الروسية (لجميع الأعمال الأخرى). كما يشكر المؤلفون بافل بيلكوف على مساعدته في تحرير الفيديو. تم إنشاء الأرقام في المخطوطة مع BioRender.com.

ملاحظة: استخدام تقنية عقيمة في جميع أنحاء البروتوكول، باستثناء الخطوتين 1.2 و 1.3. قم بتدفئة جميع الوسائط والثقافة والحلول إلى 37 درجة مئوية قبل تطبيقها على الخلايا أو الأعضاء العضوية. زراعة الخلايا فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 عند رطوبة 80٪. يظهر مخطط البروتو...

<ol>
	<li>Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+neurodegenerative+and+neurodevelopmental+diseases.">Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases.</a> Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).</li><li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+brain+Organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells:+promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders.">3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside+out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+regionally+specified+hPSC+derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration.">Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+region+specific+organoids+using+mini+bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure.">Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region+specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+hippocampal+neurons+from+self-organizing+human+embryonic+stem+cell+derived+dorsomedial+telencephalic+tissue.">Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue.</a> Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).</li><li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease.">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+platforms+for+drug+discovery.">Pluripotent stem cell platforms for drug discovery.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).</li><li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+depletes+neural+progenitors+in+human+cerebral+organoids+through+activation+of+the+innate+immune+receptor+TLR3.">Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).</li><li>Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+tissue-specific+SARS-CoV-2+infection+and+host+responses+using+human+stem+cell-derived+lung+and+cerebral+organoids.">Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).</li><li>Ao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-stop+microfluidic+assembly+of+human+brain+organoids+to+model+prenatal+cannabis+exposure.">One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure.</a> Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).</li><li>Di Nardo, P., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+standardization.">Stem cell standardization.</a> Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).</li><li>Jo, J., Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Matsui, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-month+cultured+cerebral+organoids+from+human+ES+cells+contain+matured+neural+cells.">Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells.</a> Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).</li><li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development.">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).</li><li>Eremeev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necessity+Is+the+mother+of+invention&#8221;+or+inexpensive,+reliable,+and+reproducible+protocol+for+generating+organoids.">Necessity Is the mother of invention&#8221; or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids.</a> Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region&#8211;specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region&#8211;specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).</li><li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+human+brain+organoids.">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li><li>Hall, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned,+organoid-based+cartilaginous+implants+exhibit+zone+specific+functionality+forming+osteochondral-like+tissues+in+vivo.">Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo.</a> Biomaterials. 273, 120820 (2021).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids&#8212;challenges+to+establish+a+brain+prototype.">Cerebral organoids&#8212;challenges to establish a brain prototype.</a> Cells. 10 (7), 1790 (2021).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+Cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).</li></ol>

البروتوكول الموصوف له خطوتان حاسمتان تسمحان بتوليده من الأجهزة عالية الجودة ذات الحجم الموحد. أولا ، تنمو الأجهزة العضوية من كرويات متطابقة تقريبا في عدد الخلايا ونضج الخلية. ثانيا، توفر المفاعلات الحيوية المصنوعة منزليا لكل عضو بيئة موحدة، حيث لا تزاحم الأعضاء أو تلتصق ببعضها البعض.
<...

وتستخدم على نطاق واسع نماذج الإنسان iPSC المستمدة في دراسات الاضطرابات العصبية النمائية والعصبية1. على مدى العقد الماضي، نماذج أنسجة الدماغ 3D، ما يسمى organoids الدماغ، تكمل أساسا الثقافات العصبية التقليدية 2D2. الأجهزة العضوية تلخيص إلى حد ما الهندسة المعمارية 3D من الدماغ الجنيني والسماح النمذجة أكثر دقة. يتم نشر العديد من البروتوكولات لجيل من organoids تمثل مناطق الدماغ المختلفة: قشرة الدماغ3,4,5, المخيخ6, منتصف الدماغ, الدماغ الأمامي, تحت المهاد7,8,9, والحصين10. كانت هناك أمثلة متعددة لاستخدام organoids لدراسة أمراض الجهاز العصبي البشري11. أيضا ، تم تنفيذ organoids في الاكتشافات المخدرات12 وتستخدم في دراسات الأمراض المعدية ، بما في ذلك سارس - كوف - 213،14.
يمكن أن تصل عضويات الدماغ إلى عدة ملليمترات في القطر. لذلك ، قد تعاني المنطقة الداخلية من الجهاز من نقص الأكسيجة أو سوء التغذية وتصبح في نهاية المطاف نخرية. لذلك، تتضمن العديد من البروتوكولات المفاعلات الحيوية الخاصة8،الهزازات، أو أنظمة microfluidic15. قد تتطلب هذه الأجهزة كميات كبيرة من الوسائط ثقافة الخلية مكلفة. كما أن تكلفة هذه المعدات عادة ما تكون مرتفعة. تتكون بعض المفاعلات الحيوية من العديد من الأجزاء الميكانيكية التي تجعل من الصعب تعقيمها لإعادة استخدامها.
معظم البروتوكولات تعاني من "تأثير دفعي"16، مما يولد تباينا كبيرا بين organoids التي تم الحصول عليها من iPSCs متطابقة. هذا التباين يعوق اختبار المخدرات أو الدراسات قبل السريرية التي تتطلب التوحيد. الغلة العالية من organoids بما فيه الكفاية لتحديد organoids من حجم موحد قد يحل جزئيا هذه المشكلة.
عامل الوقت هو أيضا مشكلة كبيرة. أظهر ماتسوي وآخرون (2018) أن أعضاء الدماغ تتطلب ستة أشهر على الأقل للوصول إلى مرحلة النضج17. تروخيلو وآخرون (2019) أظهر أيضا أن النشاط الكهربي حدث في الأجهزة العضوية فقط بعد ستة أشهر منالزراعة 18. بسبب فترة النضج العضوي الطويلة ، يطلق الباحثون في كثير من الأحيان تمايزا جديدا قبل إكمال سابقه. تتطلب عمليات التمايز المتوازية المتعددة نفقات ومعدات ومساحات مختبرية إضافية.
لقد قمنا مؤخرا بتطوير مفاعل حيوي مصغر يحل بشكل رئيسي المشاكل المذكورة أعلاه19. يتكون هذا المفاعل الحيوي المصنوع منزليا من التصاق منخفض للغاية أو طبق بيتري غير المعالج مع مقبض بلاستيكي في الوسط. هذا مقبض بلاستيكي يمنع تزاحم organoids وconglutination بهم في وسط طبق بيتري، الذي يسببه تناوب شاكر. تصف هذه الورقة كيف أن هذا المفاعل الحيوي الصغير غير المكلف والبسيط المصنوع منزليا يسمح بتوليد أعضاء دماغية عالية الجودة بكميات كبيرة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>DMEM/F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>34425</td>
			<td>24-well culture plate with microwells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuronal supplement B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Serum replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>85850</td>
			<td>Pliripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Antimicrobials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>540220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Y27632</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-538</td>
			<td>Y27632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Dorsomorphin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-466</td>
			<td>Dorsomorphin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS LDN-193189</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-540</td>
			<td>LDN-193189</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS SB431542</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-543</td>
			<td>SB431542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versen solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040066</td>
			<td>0.48 mM EDTA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors

الجهاز العضوي الدماغ المستمدة من iPSC هي تقنية واعدة للنمذجة في المختبر أمراض الجهاز العصبي وفحص المخدرات. وقد ظهرت هذه التكنولوجيا في الآونة الأخيرة. وهي لا تزال في مهدها ولم تحل بعض القيود بعد. البروتوكولات الحالية لا تسمح الحصول على organoids لتكون متسقة بما فيه الكفاية لاكتشاف المخدرات والدراسات قبل السريرية. يمكن أن يستغرق نضوج الأعضاء ما يصل إلى عام ، مما يدفع الباحثين إلى إطلاق عمليات تمايز متعددة في وقت واحد. ويفرض تكاليف إضافية على المختبر من حيث المساحة والمعدات. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يكون لدى أعضاء الدماغ منطقة نخرية في المركز ، والتي تعاني من نقص المغذيات والأوكسجين. ومن ثم، فإن معظم البروتوكولات الحالية تستخدم نظاما متداولا للوسط الثقافي لتحسين التغذية.
وفي الوقت نفسه، لا توجد أنظمة ديناميكية غير مكلفة أو مفاعلات حيوية لزراعة الأعضاء العضوية. تصف هذه الورقة بروتوكولا لإنتاج أعضاء الدماغ في المفاعلات الحيوية الصغيرة المدمجة وغير المكلفة المصنوعة منزليا. يسمح هذا البروتوكول بالحصول على أجهزة عضوية عالية الجودة بكميات كبيرة.

يظهر مخطط البروتوكول في الشكل 1. وتضمن البروتوكول خمس وسائط تمايزت فيها أجهزة iPSCs إلى أعضاء دماغية خلال شهر واحد على الأقل. بدأ التمايز ثم وصلت iPSCs إلى التقاء 75-90 ٪ (الشكل 2A، B). لوحظت العلامات الأولى للتمايز نحو الخلايا العصبية في الأيام 10-11 من زراعة iP...

Watch this Scientific Journal Video about Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors at JoVE.com

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

هنا نصف بروتوكول لتوليد الأجهزة العضوية في الدماغ من الخلايا الجذعية المستحثة من قبل الإنسان (iPSCs). للحصول على أعضاء الدماغ بكميات كبيرة وبجودة عالية، نستخدم المفاعلات الحيوية المصغرة المصنوعة منزليا.

توليد عضوي الدماغ من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات في المفاعلات الحيوية المصغرة المصنوعة منزليا

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

حتى الآن ، فإن الأعضاء الدماغية المتمايزة عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات هي نموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر الأقرب إلى أنسجة الدماغ البشرية الأصلية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الأعضاء الدماغية مناسبة بنفس القدر لنمذجة أمراض الجهاز العصبي المركزي المختلفة ، واختبار المواد النشطة دوائيا ، وكذلك للاستخدام في الطب التجديدي. وفي الوقت نفسه، لا تزال هذه التكنولوجيا في المرحلة الأولى من التطوير.ويمكن تقسيم البروتوكول إلى مجموعتين تبعا لطريقة الحصول على المجاميع وزراعة مزيد مع التمايز. الأول يتضمن بروتوكول ومخططات التمايز، مختلفة في وقت الزراعة ومحرضات التمايز مع النضج اللاحقة من organoid في شاكر في أجهزة خاصة منخفضة التصاق مثل أنابيب السوق أو لوحات. وتشمل مجموعة أخرى استخدام المفاعلات الحيوية الخاصة.وقد أظهر تحليل البروتوكولات المختلفة أنه ينبغي زراعة الأجهزة العضوية في ظل ظروف ذات وسيطة غذائية متداولة. ومع ذلك ، فإن عدم وجود أنظمة بسيطة وغير مكلفة للحصول على الجهازية ذات الحجم القياسي والمورفولوجيا تتطلب تطوير مثل هذه الأجهزة لتوسيع نطاق العملية. في هذا العمل، ونحن نصف طريقتنا للحصول على واختبار المفاعلات الحيوية البسيطة وغير مكلفة الصغيرة التي تجعل من الممكن الحصول على كميات كبيرة من الأجهزة عالية الجودة.قطع أنابيب الطرد المركزي العقيمة 15 ملليلتر في الحلقات، 7 أو 8 ملليمترات في الارتفاع. أوتوكلاف الحلقات. كسر التجمعات المنخفضة على أطباق بيتري المعالجة أو الميكروبيولوجية إلى فتات.حل حوالي 1 غرام من فتات البلاستيك في 10 ملليلتر من الكلوروفورم بين عشية وضحاها لإعداد البلاستيك السائل. جعل مقبض بلاستيكي في وسط طبق بيتري فائقة الالتصاق 6 سنتيمترات العقيمة. هناك طريقتان مناسبتان بنفس القدر.الأول، وضع الأوتوكلاف في حلقة بلاستيكية على مركز وتطبيق نصف ملليلتر من البلاستيك السائل إلى داخل الحلبة. والثاني، دون أي حلقات بلاستيكية إسقاط نصف ملليلتر من البلاستيك السائل على وسط طبق بيتري. اترك الأطباق مفتوحة لمدة ساعتين أو ثلاث ساعات في غطاء تدفق صفح حتى يجف تماما.زراعة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات في الوسط للخلايا الجذعية متعددة القدرات ، ما يصل إلى 75 أو 90٪ التقاء في أطباق بيتري 35 ملليمتر ، المغلفة مسبقا بمصفوفة مذابة في دولبيكو متوسط النسر المعدل البارد ، وفيشر-12 المتوسطة. إعداد المتوسطة A زائد استبدال المصل. زراعة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لمدة يوم واحد في الوسط مع استبدال المصل.تغيير المتوسطة للخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى وسيط استبدال المصل في اليوم صفر من التمايز. إعداد متوسط A.Change المتوسط إلى المتوسط A في اليوم الثاني من التمايز. زراعة الخلايا في المتوسطة A لمدة 2 أسابيع، منعش المتوسطة في أطباق بيتري كل 2 يوم.في اليوم 14، بدء تشكيل كروية باستخدام لوحة خاصة ثقافة 24 جيدا الذي يحتوي على ما يقرب من 1200 ميكروويل في كل بئر. إعداد لوحة ثقافة 24 جيدا مع microwells. أضف إلى كل بئر 1 ملليلتر من المتوسط A، الطرد المركزي لفترة وجيزة في 1، 300g لمدة 5 دقائق في الدوار يتأرجح دلو مزودة حامل لوحة.السيطرة تحت المجهر أنه لا توجد فقاعات في microwells. إعداد B.Remove المتوسطة المتوسطة من طبق بيتري. مفرزة الخلية، علاج الخلايا مع 1.5 ملليلتر EDTA الحل المعدة على برنامج تلفزيوني.السيطرة على مفرزة الخلية تحت المجهر. حصاد الخلية في أنبوب 15 ملليلتر. إضافة 5 ملليلتر مختلطة دولبيكو وفيشر المتوسطة في أنبوب نحو الخلايا.الطرد المركزي في 200g لمدة 5 دقائق. إزالة الخلايا العملاقة وإعادة تعليق في 2 ملليلتر من B.Transfer المتوسط تعليق الخلايا التي تحتوي على 1 مليار خلية في كل بئر من لوحة 24 جيدا مع microwells. خلايا ماصة بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات والطرد المركزي لفترة وجيزة 100g لمدة 1 دقيقة لالتقاط الخلية في microwells.السيطرة تحت المجهر أن يتم توزيع الخلية بالتساوي في microwells. احتضان لوحة بين عشية وضحاها لتجميع الخلايا في كرويدات. في صباح اليوم التالي، اليوم 15، تحقق تحت المجاهر من جودة كرويدات، والتي هي شفافة وسلسة إذا كانت صحية.جمع بعناية كرويدات من كل بئر في أنبوب 15 ملليلتر، وترك كرويدات للتعجيل بالجاذبية لمدة 2 و 3 دقائق، ومن ثم إزالة supernatant. إضافة إلى كرويدات 2 ملليلتر من المصفوفة، إذابة وسابق مؤقت على الجليد. تخلط بلطف عن طريق الأنابيب واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.لغسل الزائدة من المصفوفة، إضافة إلى أنبوب 8 ملليلتر من B.Pipette المتوسطة بلطف، ثم الطرد المركزي الأنبوب لمدة 1 دقيقة في 100g. أزل الناتنات الفائق. إضافة إلى أنبوب 20 ملليلتر من B المتوسطة، ماصة بلطف، ثم تقسيم تعليق كروية بين المفاعلات الحيوية المصغرة.ثم ضع المفاعلات الحيوية المصغرة في طبق بيتري طوله 15 سنتيمترا ، مما يمنع تبخر الماء والتلوث. وضع طبق بيتري مع المفاعلات الحيوية المصغرة على شاكر المدارية. زراعة organoids بمعدل دوران 70، 75rpm.في اليوم 16، قم بإعداد الجهازي المتوسط C.Transfer إلى أنبوب 50 ملليلتر. لمدة 5 دقائق، دعهم يسقطون إلى الأسفل. يستنشق supernatant وإضافة 5 ملليلتر من C.Rejoin المتوسطة organoids في المفاعلات الحيوية المصغرة.زراعة كرويدات في المتوسط C لمدة 2 أسابيع، منعش المتوسطة كل 2 أيام. خلال هذه الأسابيع 2، حدد حوالي 100 كروية لكل المفاعلات الحيوية المصغرة للزراعة التالية. في اليوم 30، إعداد متوسطة D.Change زراعة المتوسطة إلى المتوسطة D، وهو وسيط النضج.تحديث زراعة المتوسطة كل 2 أو 3 أيام لمدة 3 أسابيع. ثم استخدم متوسط D المذاب في F و GDNF. بعد شهر واحد من الزراعة المتتالية في المتوسط A و B ، يتم الحصول على الأجهزة العضوية الموحدة في الحجم والمورفولوجيا.كما أنها تنمو، فإنها تحتاج إلى تغيير المتوسطة في كثير من الأحيان، تصل إلى 4 مرات في الأسبوع يزيد أيضا. بعد شهرين من الزراعة ، يصل قطرها إلى 4 و 5 ملليمترات. وبعد شهر آخر، 5 و 6 ملليمترات ويتوقف النمو.يظهر الشكل مظهر إنزيم الجهاز ، وأقسام واضحة مرسومة بالهيماتوكسيلين والإيوسين. يظهر التحليل المناعي الكيميائي لمدة شهر وجود مجموعات إيجابية من خلايا السلف SOX2 ، بما في ذلك داخل الجزء المركزي. في المحيطية من organoids، بروتين حمضي الرجفان الدبقية، والبروتين المرتبطة microtubule 2، وهيدرولاس الثيازين إيجابية.وتتركز الخلايا، والتي تتوافق مع شكل ناضج من الخلايا العصبية. في بعض الحالات ، تتشكل مجموعات من البيض على منطقة نخرية في الجزء المركزي. وهذا يشير إلى تقييد هذا البروتوكول للحصول على أكبر organoids.على الأرجح، فإن العامل المقيد للنمو هو معدل انتشار المواد الغذائية والأوكسجين. وسائل الإعلام المختلفة ونوع الخلية من كرويدات واختبار نظامنا لبعض أنواع organoids. الكثير من الدماغ والشبكية، والأعضاء مجتمعة من خلايا سرطان الكبد والخلايا الجذعية mesenchymal، organoids مجتمعة من العاصمة انفجار المكالمات الجذعية mesenchymal والخلايا الجذعية الدموية التمايز من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات والأعضاء الأمعاء.هل كان متغيرا في التكوين الأولي للخلايا؟ عوامل التمايز، والثقافة، والمتوسطة، مصفوفة خارج الخلية، وربما أيضا تكوين خليط الغاز، ومعدل دوران منصة، وغيرها من المعلمات. سيكون من الممكن الحصول على الجهازية بنفس الشكل والحجم أو نموذج مورفولوجيا في مختلف الأجهزة والأنسجة.استخدام المفاعلات الحيوية المصغرة المقترحة في هذا العمل.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من المجمدة بافي معاطف استخدام غير دمج-Episomal البلازميدات

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من الإنسان الطرفية T الخلايا باستخدام سينداي الفيروسات في ظروف خالية من الطاعم

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

جيل من الخلايا الجذعية المستحثة-المحفزة عن طريق Synoviocytes الخلايا الليفية مثل المعزولة من المفاصل من التهاب المفاصل الروماتويدي المرضى

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

جيل من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من سرطان الجلد البشري الخلايا اللمفاوية-التسلل الورم

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

الناجم المحفزة الجيل الخلايا الجذعية من خلايا الدم عن طريق سينداي الفيروسات والطرد المركزي

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

جيل من التكامل خالية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من الخلايا الطرفية الإنسان الدم وحيدات النوى عن طريق Episomal المتجهات

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

محددة وقابلة للتطوير الجيل من الخلايا تشبه الكبدية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

تشكيل بيليه غضروفي من الخلايا الجذعية المحفزة المستمدة من الدم الحبلية

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

جيل أورجانويدس الدماغي موحدة واستنساخه من نوع فوريبرين من الإنسان فعل الخلايا الجذعية Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

جيل أورجانويد الجلد 3D من سلك المستمدة من الدم الناجم عن الخلايا الجذعية Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...