Name: brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors
Uploaded: 2021-12-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidie 075-15-2019-1669 van het ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie (RT-PCR-analyse) en door subsidie nr. 19-15-00425 van de Russian Science Foundation (voor al het andere werk). De auteurs bedanken ook Pavel Belikov voor zijn hulp bij de videobewerking. Figuren in het manuscript zijn gemaakt met BioRender.com.

OPMERKING: Gebruik steriele techniek in het hele protocol, met uitzondering van stap 1.2 en 1.3. Verwarm alle kweekmedia en -oplossingen tot 37 °C voordat u ze op cellen of organoïden aanbrengt. Kweek cellen in een CO2-incubator bij 37 °C in 5% CO2 bij 80% luchtvochtigheid. Het protocolschema is weergegeven in figuur 1.
1. Petrischaaltjes omtvormen tot mini-bioreactoren
<ol><li>Schroef steriele centrifugebuizen van 15 ml...

<ol>
	<li>Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+neurodegenerative+and+neurodevelopmental+diseases.">Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases.</a> Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).</li><li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+brain+Organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells:+promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders.">3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside+out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+regionally+specified+hPSC+derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration.">Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+region+specific+organoids+using+mini+bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure.">Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region+specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+hippocampal+neurons+from+self-organizing+human+embryonic+stem+cell+derived+dorsomedial+telencephalic+tissue.">Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue.</a> Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).</li><li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease.">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+platforms+for+drug+discovery.">Pluripotent stem cell platforms for drug discovery.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).</li><li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+depletes+neural+progenitors+in+human+cerebral+organoids+through+activation+of+the+innate+immune+receptor+TLR3.">Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).</li><li>Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+tissue-specific+SARS-CoV-2+infection+and+host+responses+using+human+stem+cell-derived+lung+and+cerebral+organoids.">Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).</li><li>Ao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-stop+microfluidic+assembly+of+human+brain+organoids+to+model+prenatal+cannabis+exposure.">One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure.</a> Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).</li><li>Di Nardo, P., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+standardization.">Stem cell standardization.</a> Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).</li><li>Jo, J., Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Matsui, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-month+cultured+cerebral+organoids+from+human+ES+cells+contain+matured+neural+cells.">Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells.</a> Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).</li><li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development.">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).</li><li>Eremeev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necessity+Is+the+mother+of+invention&#8221;+or+inexpensive,+reliable,+and+reproducible+protocol+for+generating+organoids.">Necessity Is the mother of invention&#8221; or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids.</a> Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region&#8211;specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region&#8211;specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).</li><li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+human+brain+organoids.">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li><li>Hall, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned,+organoid-based+cartilaginous+implants+exhibit+zone+specific+functionality+forming+osteochondral-like+tissues+in+vivo.">Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo.</a> Biomaterials. 273, 120820 (2021).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids&#8212;challenges+to+establish+a+brain+prototype.">Cerebral organoids&#8212;challenges to establish a brain prototype.</a> Cells. 10 (7), 1790 (2021).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+Cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).</li></ol>

Het beschreven protocol heeft twee cruciale stappen die het genereren van hoogwaardige organoïden van uniforme grootte mogelijk maken. Ten eerste groeien de organoïden uit sferoïden die bijna identiek zijn in celnummer en celvolwassenheid. Ten tweede bieden de zelfgemaakte bioreactoren elke organoïde een uniforme omgeving, waar organoïden zich niet verdringen of aan elkaar plakken.
De celkwaliteit en de toestand van celrijping zijn essentieel om het protocol uit te voeren. Het is van cruc...

Menselijke iPSC-afgeleide modellen worden veel gebruikt in de studies van neurologische en neurodegeneratieve aandoeningen1. In het afgelopen decennium hebben 3D-hersenweefselmodellen, zogenaamde hersenorganoïden, in wezen traditionele 2D-neuronale culturenaangevuld 2. De organoïden vatten tot op zekere hoogte de 3D-architectuur van het embryonale brein samen en maken nauwkeurigere modellering mogelijk. Veel protocollen zijn gepubliceerd voor het genereren van organoïden die verschillende hersengebieden vertegenwoordigen: hersenschors3,4,5,cerebellum6,middenhersenen, voorhersenen, hypothalamus7,8,9en hippocampus10. Er zijn meerdere voorbeelden van het gebruik van organoïden om ziekten van het menselijk zenuwstelsel tebestuderen 11. Ook werden de organoïden geïmplementeerd in medicijnontdekkingen12 en gebruikt in studies van infectieziekten, waaronder SARS-Cov-213,14.
De hersenorganoïden kunnen tot enkele millimeters in diameter reiken. De binnenste zone van de organoïde kan dus lijden aan hypoxie of ondervoeding en uiteindelijk necrotisch worden. Daarom omvatten veel protocollen speciale bioreactoren8,shakers of microfluïdische systemen15. Deze apparaten kunnen grote hoeveelheden dure celkweekmedia vereisen. Ook zijn de kosten van dergelijke apparatuur meestal hoog. Sommige bioreactoren bestaan uit veel mechanische onderdelen waardoor ze moeilijk te steriliseren zijn voor hergebruik.
De meeste protocollen lijden aan het "batch-effect"16, dat aanzienlijke variabiliteit genereert tussen organoïden verkregen uit de identieke iPSC's. Deze variabiliteit belemmert het testen van geneesmiddelen of preklinische studies die uniformiteit vereisen. De hoge opbrengst van organoïden genoeg om organoïden van uniforme grootte te selecteren, kan dit probleem gedeeltelijk oplossen.
De factor tijd is ook een groot probleem. Matsui et al. (2018) toonden aan dat hersenorganoïden minstens zes maanden nodig hebben om volwassen te worden17. Trujillo et al. (2019) toonden ook aan dat elektrofysiologische activiteit in organoïden pas na zes maanden teeltoptrad 18. Vanwege de lange organische rijpingstijd lanceren de onderzoekers vaak nieuwe differentiatie voordat ze de vorige voltooien. Meerdere parallelle differentiatieprocessen vereisen extra kosten, apparatuur en laboratoriumruimte.
We hebben onlangs een mini-bioreactor ontwikkeld die voornamelijk de hierboven genoemde problemen oplost19. Deze zelfgemaakte bioreactor bestaat uit een ultralage hechting of onbehandelde petrischaal met een plastic knop in het midden. Deze plastic knop voorkomt verdringing van organoïden en hun conglutinatie in het midden van de petrischaal, die wordt veroorzaakt door de rotatie van de shaker. Dit artikel beschrijft hoe deze goedkope en eenvoudige zelfgemaakte mini-bioreactor het mogelijk maakt om in grote hoeveelheden hoogwaardige hersenorganoïden te genereren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>DMEM/F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>34425</td>
			<td>24-well culture plate with microwells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuronal supplement B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Serum replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>85850</td>
			<td>Pliripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Antimicrobials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>540220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Y27632</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-538</td>
			<td>Y27632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Dorsomorphin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-466</td>
			<td>Dorsomorphin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS LDN-193189</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-540</td>
			<td>LDN-193189</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS SB431542</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-543</td>
			<td>SB431542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versen solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040066</td>
			<td>0.48 mM EDTA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors

De iPSC-afgeleide hersenorganoïde is een veelbelovende technologie voor het in vitro modelleren van de pathologieën van het zenuwstelsel en het screenen van geneesmiddelen. Deze technologie is onlangs ontstaan. Het staat nog in de kinderschoenen en heeft een aantal beperkingen die nog niet zijn opgelost. De huidige protocollen staan niet toe dat het verkrijgen van organoïden consistent genoeg is voor het ontdekken van geneesmiddelen en preklinische studies. De rijping van organoïden kan tot een jaar duren, waardoor de onderzoekers meerdere differentiatieprocessen tegelijkertijd moeten starten. Het brengt extra kosten met zich mee voor het laboratorium op het gebied van ruimte en apparatuur. Bovendien hebben hersenorganoïden vaak een necrotische zone in het centrum, die lijdt aan voedings- en zuurstoftekort. Vandaar dat de meeste huidige protocollen een circulerend systeem voor kweekmedium gebruiken om de voeding te verbeteren.
Ondertussen zijn er geen goedkope dynamische systemen of bioreactoren voor organoïde teelt. Dit artikel beschrijft een protocol voor het produceren van hersenorganoïden in compacte en goedkope zelfgemaakte mini-bioreactoren. Dit protocol maakt het mogelijk om organoïden van hoge kwaliteit in grote hoeveelheden te verkrijgen.

Het protocolschema is weergegeven in figuur 1. Het protocol omvatte vijf media waarin iPSC's gedurende ten minste één maand differentieerden in hersenorganoïden. De differentiatie werd gestart toen iPSC's de 75-90% confluentie bereikten(figuur 2A,B). De eerste tekenen van differentiatie naar neuronen werden waargenomen op dag 10-11 van iPSC-cultivatie in medium A toen cellen begonnen te clusteren in "rozetten" (Figuur 2C<...

Watch this Scientific Journal Video about Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors at JoVE.com

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van hersenorganoïden uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Om hersenorganoïden in grote hoeveelheden en van hoge kwaliteit te verkrijgen, gebruiken we zelfgemaakte mini-bioreactoren.

Brain Organoid Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen in zelfgemaakte mini-bioreactoren

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

Tot op heden zijn de cerebrale organoïden die worden onderscheiden van pluripotente stamcellen een vitro 3D-model dat het dichtst bij het inheemse menselijke hersenweefsel staat. Bovendien zijn cerebrale organoïden even geschikt voor het modelleren van verschillende pathologieën van het centrale zenuwstelsel, het testen van farmacologisch actieve stoffen en ook voor gebruik in de regeneratieve geneeskunde. Ondertussen bevindt deze technologie zich nog in de beginfase van ontwikkeling.Het protocol kan worden onderverdeeld in twee groepen, afhankelijk van de methode voor het verkrijgen van aggregaten en de verdere teelt met differentiatie. De eerste omvat protocol en schema's van differentiatie, verschillend in de teelttijd en differentiatie-inductoren met daaropvolgende rijping van organoïde in de shaker in speciale apparaten met lage adhesie zoals marktbuizen of platen. Een andere groep omvat het gebruik van een speciale bioreactor.Analyse van verschillende protocollen heeft aangetoond dat organoïden moeten worden gekweekt onder omstandigheden met circulerende voedingsbodem. De afwezigheid van eenvoudige en goedkope systemen voor het verkrijgen van organoïden met een standaardgrootte en morfologie vereist echter de ontwikkeling van dergelijke apparaten voor het schalen van het proces. In dit werk beschrijven we onze methode voor het verkrijgen en testen van eenvoudige en goedkope mini-bioreactoren die het mogelijk maken om grote hoeveelheden hoogwaardige organoïden te verkrijgen.Snijd de steriele centrifugebuizen van 15 milliliter in de ringen, 7 of 8 millimeter hoog. Autoclaaf de ringen. Breek laagaggregaties op behandelde of microbiologische petrischalen in kruimels.Los ongeveer 1 gram plastic kruimels 's nachts op in 10 milliliter chloroform om een vloeibaar plastic te bereiden. Maak een plastic knop in het midden van een steriele ultra lage hechting 6 centimeter petrischaal. Er zijn twee even geschikte manieren.De eerste, plaats de autoclaaf in een plastic ring op een midden en breng halve milliliter vloeibaar plastic aan op de binnenkant van de ring. De tweede, zonder plastic ringen, laat halve milliliter vloeibaar plastic op het midden van de petrischaal vallen. Laat de gerechten 2 of 3 uur open in een laminaire flowkap tot ze volledig droog zijn.Kweek geïnduceerde pluripotente stamcellen in het medium voor pluripotente stamcellen, tot 75 of 90% samenvloeiing in de 35 millimeter petrischalen, voorgecoat met een matrix opgelost in koud Dulbecco Modified Eagle Medium en Fisher-12 medium. Bereid medium A plus serumvervanging voor. Kweek geïnduceerde pluripotente stamcellen gedurende 1 dag in het medium met serumvervanging.Verander het medium voor pluripotente stamcellen in een serumvervangend medium op de dag nul van differentiatie. Bereid medium A.Verander het medium in medium A op dag 2 van differentiatie. Kweek cellen in medium A gedurende 2 weken, verfrissend medium in petrischalen om de 2 dagen.Begin op dag 14 met de vorming van sferoïden met behulp van een speciale 24-well kweekplaat die ongeveer 1.200 microwells in elke put bevat. Bereid een 24-well kweekplaat met microwells. Voeg aan elke put 1 milliliter medium A toe, centrifugeer kort op 1, 300g gedurende 5 minuten in een zwenkbakrotor uitgerust met plaathouder.Controleer onder de microscoop dat er geen bubbels in microwells zijn. Bereid het medium B. Haal het medium uit de petrischaal. Behandel voor de celaflating de cellen met 1,5 milliliter EDTA-oplossing bereid op PBS.Controleer de celdetachement onder de microscoop. Oogst de cel in een buis van 15 milliliter. Voeg 5 milliliter gemengd Dulbecco en Fisher medium toe in de buis richting de cellen.Centrifugeer op 200g gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant en suspensie cellen opnieuw in 2 milliliter medium B.Breng de cellensuspensie met 1 miljard cellen over in elke put van een 24-well plaat met microwells. Pipetteer cellen voorzichtig meerdere keren op en neer en centrifugeer kort 100 g gedurende 1 minuut om cellen in microwells op te vangen.Controleer onder de microscoop dat de cel gelijkmatig verdeeld is in microwells. Incubeer de plaat 's nachts voor celaggregatie in sferoïden. Controleer de volgende ochtend, dag 15, onder de microscopen de kwaliteit van sferoïden, die transparant en glad zijn als ze gezond zijn.Verzamel voorzichtig de sferoïden uit elke put in een buis van 15 milliliter, laat de sferoïden gedurende 2 en 3 minuten neerslaan door de zwaartekracht en verwijder vervolgens het supernatant. Voeg aan de sferoïden 2 milliliter van de matrix toe, ontdooid en ex tempore op ijs. Meng voorzichtig door te pipetteren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.Om het overtollige van de matrix te wassen, voegt u voorzichtig 8 milliliter medium B.Pipet toe aan de buis en centrifugeert u de buis gedurende 1 minuut bij 100 g. Verwijder het supernatant. Voeg 20 milliliter medium B toe aan de buis, pipetteer voorzichtig en splits vervolgens de sferoïde suspensie tussen mini-bioreactoren.Plaats de mini-bioreactoren vervolgens in een petrischaaltje van 15 centimeter, wat de verdamping van water en vervuiling voorkomt. Zet de petrischaal met mini bioreactoren op een orbitale shaker. Cultiveer de organoïden met rotatiesnelheid 70, 75 rpm.Bereid op dag 16 medium C.Transfer organoid in de buis van 50 milliliter. Laat ze 5 minuten naar de bodem vallen. Adem het supernatant op en voeg 5 milliliter van het medium C toe. Voeg de organoïden in de mini-bioreactoren weer samen.Kweek sferoïden in medium C gedurende 2 weken en ververs het medium om de 2 dagen. Selecteer tijdens deze 2 weken ongeveer 100 sferoïden per mini-bioreactor voor de volgende teelt. Bereid op dag 30 medium D. Verander het teeltmedium in medium D, een rijpingsmedium.Ververs het teeltmedium om de 2 of 3 dagen gedurende 3 weken. Gebruik vervolgens het medium D opgelost in F en GDNF. Na 1 maand opeenvolgende teelt in medium A en B worden organoïden gestandaardiseerd in grootte en morfologie verkregen.Naarmate het groeit, moeten ze het medium vaker veranderen, tot 4 keer per week neemt ook toe. Na 2 maanden teelt bereiken ze een diameter van 4 en 5 millimeter. En na nog een maand, 5 en 6 millimeter en stopt de groei.De figuur toont het uiterlijk van organoïde enzym, heldere secties geschilderd met hematoxyline en eosine. Immunohistochemische analyse gedurende 1 maand toont de aanwezigheid van SOX2-positieve clusters van voorlopercellen, inclusief in het centrale deel. In de periferie van de organoïden, gliale fibrillaire zure eiwit, microtubule-geassocieerd eiwit 2, en thiazine hydrolase positief.Cellen zijn geconcentreerd, wat overeenkomt met de volwassen vorm van neuronen. In sommige gevallen worden clusters van wit op necrotisch gebied gevormd in het centrale deel. Dit duidt op de beperking van dit protocol voor het verkrijgen van grotere organoïden.Hoogstwaarschijnlijk is de beperkende factor van groei de snelheid van diffusie van voedingsstoffen en zuurstof. De verschillende media en celtype van sferoïden en het testen van ons systeem op sommige soorten organoïden. Veel hersenen en netvlies, gecombineerde organoïden uit levercarcinoomcellen en mesenchymale stamcellen, gecombineerde organoïden uit capital blast mesenchymale stamoproepen en de hematopoëtische stamcellen differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen en darmorganoïden.Was het variabel in de oorspronkelijke samenstelling van cellen? Differentiatiefactoren, cultuur en medium, extracellulaire matrix, en mogelijk ook de samenstelling van het gasmengsel, de snelheid van de platformrotatie en andere parameters. Het zal mogelijk zijn om organoïden met dezelfde vorm, grootte of morfologiemodel in verschillende organen en weefsels te verkrijgen.Het gebruik van mini-bioreactoren voorgesteld in dit werk.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere T-cellen met behulp van Sendai Virus in Feeder gratis Voorwaarden

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van fibroblast-achtige synoviocyten Geïsoleerd van de gewrichten van patiënten met reumatoïde artritis

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke Melanoom-Tumor-infiltrerende lymfocyten

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Gedefinieerd en Scalable Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Chondrogenische Pelletvorming van Koord Bloed afgeleide geïnduceerde Pluripotente Stamcellen

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van gestandaardiseerde en reproduceerbaar reukkolf-type cerebrale Organoids van mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van 3D huid Organoid van koord bloed afkomstige geïnduceerde pluripotente stamcellen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...