Name: brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors
Uploaded: 2021-12-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la subvention 075-15-2019-1669 du ministère de la Science et de l’Enseignement supérieur de la Fédération de Russie (analyse RT-PCR) et par la subvention n ° 19-15-00425 de la Fondation russe pour la science (pour tous les autres travaux). Les auteurs remercient également Pavel Belikov pour son aide au montage vidéo. Les figures du manuscrit ont été créées avec BioRender.com.

NOTE : Utiliser la technique stérile tout au long du protocole, à l’exception des étapes 1.2 et 1.3. Réchauffer tous les milieux de culture et les solutions à 37 °C avant de les appliquer sur les cellules ou les organoïdes. Cultivez des cellules dans un incubateur à CO2 à 37 °C dans 5 % de CO2 et 80 % d’humidité. Le schéma de protocole est illustré à la figure 1.
1. Transformer les boîtes de Petri en mini-bioréacteur...

<ol>
	<li>Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+neurodegenerative+and+neurodevelopmental+diseases.">Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases.</a> Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).</li><li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+brain+Organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells:+promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders.">3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside+out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+regionally+specified+hPSC+derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration.">Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+region+specific+organoids+using+mini+bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure.">Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region+specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+hippocampal+neurons+from+self-organizing+human+embryonic+stem+cell+derived+dorsomedial+telencephalic+tissue.">Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue.</a> Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).</li><li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease.">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+platforms+for+drug+discovery.">Pluripotent stem cell platforms for drug discovery.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).</li><li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+depletes+neural+progenitors+in+human+cerebral+organoids+through+activation+of+the+innate+immune+receptor+TLR3.">Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).</li><li>Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+tissue-specific+SARS-CoV-2+infection+and+host+responses+using+human+stem+cell-derived+lung+and+cerebral+organoids.">Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).</li><li>Ao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-stop+microfluidic+assembly+of+human+brain+organoids+to+model+prenatal+cannabis+exposure.">One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure.</a> Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).</li><li>Di Nardo, P., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+standardization.">Stem cell standardization.</a> Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).</li><li>Jo, J., Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Matsui, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-month+cultured+cerebral+organoids+from+human+ES+cells+contain+matured+neural+cells.">Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells.</a> Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).</li><li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development.">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).</li><li>Eremeev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necessity+Is+the+mother+of+invention&#8221;+or+inexpensive,+reliable,+and+reproducible+protocol+for+generating+organoids.">Necessity Is the mother of invention&#8221; or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids.</a> Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region&#8211;specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region&#8211;specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).</li><li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+human+brain+organoids.">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li><li>Hall, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned,+organoid-based+cartilaginous+implants+exhibit+zone+specific+functionality+forming+osteochondral-like+tissues+in+vivo.">Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo.</a> Biomaterials. 273, 120820 (2021).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids&#8212;challenges+to+establish+a+brain+prototype.">Cerebral organoids&#8212;challenges to establish a brain prototype.</a> Cells. 10 (7), 1790 (2021).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+Cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).</li></ol>

Le protocole décrit comporte deux étapes cruciales permettant la génération d’organoïdes de haute qualité de taille uniforme. Tout d’abord, les organoïdes se développent à partir de sphéroïdes qui sont presque identiques en nombre de cellules et en maturité cellulaire. Deuxièmement, les bioréacteurs faits maison fournissent à chaque organoïde un environnement uniforme, où les organoïdes ne s’encombrent pas ou ne collent pas ensemble.
La qualité cellulaire et l’état ...

Les modèles humains dérivés de l’iPSC sont largement utilisés dans les études des troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifs1. Au cours de la dernière décennie, les modèles de tissus cérébraux 3D, appelés organoïdes cérébraux, ont essentiellement complété les cultures neuronales 2D traditionnelles2. Les organoïdes récapitulent dans une certaine mesure l’architecture 3D du cerveau embryonnaire et permettent une modélisation plus précise. De nombreux protocoles sont publiés pour la génération d’organoïdes représentant différentes régions du cerveau : cortex cérébral3,4,5,cervelet6,mésencéphale, cerveau antérieur, hypothalamus7,8,9et hippocampe10. Il y a eu de multiples exemples d’utilisation d’organoïdes pour étudier les maladies du système nerveux humain11. En outre, les organoïdes ont été mis en œuvre dans les découvertes de médicaments12 et utilisés dans des études sur les maladies infectieuses, y compris le SARS-Cov-213,14.
Les organoïdes cérébraux peuvent atteindre plusieurs millimètres de diamètre. Ainsi, la zone interne de l’organoïde peut souffrir d’hypoxie ou de malnutrition et éventuellement devenir nécrotique. Par conséquent, de nombreux protocoles incluent des bioréacteurs spéciaux8,des agitateurs ou des systèmes microfluidiques15. Ces dispositifs peuvent nécessiter de grands volumes de milieux de culture cellulaire coûteux. En outre, le coût d’un tel équipement est généralement élevé. Certains bioréacteurs sont constitués de nombreuses pièces mécaniques qui les rendent difficiles à stériliser pour les réutiliser.
La plupart des protocoles souffrent de « l’effet batch »16, qui génère une variabilité significative entre les organoïdes obtenus à partir des cSI identiques. Cette variabilité entrave les tests de dépistage de drogues ou les études précliniques nécessitant une uniformité. Le rendement élevé des organoïdes suffisant pour sélectionner des organoïdes de taille uniforme peut résoudre partiellement ce problème.
Le facteur temps est également un problème important. Matsui et al. (2018) ont montré que les organoïdes cérébraux ont besoin d’au moins six mois pour atteindrela maturité 17. Trujillo et al. (2019) ont également démontré que l’activité électrophysiologique ne se produisait dans les organoïdes qu’après six mois de culture18. En raison du long temps de maturation des organoïdes, les chercheurs lancent souvent une nouvelle différenciation avant de terminer la précédente. De multiples processus parallèles de différenciation nécessitent des dépenses, des équipements et des espaces de laboratoire supplémentaires.
Nous avons récemment développé un mini bioréacteur qui résout principalement les problèmes mentionnés ci-dessus19. Ce bioréacteur fait maison se compose d’une boîte de Petri à très faible adhérence ou non traitée avec un bouton en plastique au centre. Ce bouton en plastique empêche l’encombrement des organoïdes et leur conglutination au centre de la boîte de Pétri, qui est causée par la rotation du shaker. Cet article décrit comment ce mini bioréacteur maison peu coûteux et simple permet de générer des organoïdes cérébraux de haute qualité en grande quantité.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>DMEM/F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>34425</td>
			<td>24-well culture plate with microwells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuronal supplement B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Serum replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>85850</td>
			<td>Pliripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Antimicrobials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>540220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Y27632</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-538</td>
			<td>Y27632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Dorsomorphin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-466</td>
			<td>Dorsomorphin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS LDN-193189</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-540</td>
			<td>LDN-193189</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS SB431542</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-543</td>
			<td>SB431542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versen solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040066</td>
			<td>0.48 mM EDTA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors

L’organoïde cérébral dérivé de l’iPSC est une technologie prometteuse pour la modélisation in vitro des pathologies du système nerveux et le dépistage des médicaments. Cette technologie a émergé récemment. Il en est encore à ses balbutiements et a encore certaines limites non résolues. Les protocoles actuels ne permettent pas d’obtenir des organoïdes de manière suffisamment cohérente pour la découverte de médicaments et les études précliniques. La maturation des organoïdes peut prendre jusqu’à un an, poussant les chercheurs à lancer plusieurs processus de différenciation simultanément. Il impose des coûts supplémentaires pour le laboratoire en termes d’espace et d’équipement. En outre, les organoïdes cérébraux ont souvent une zone nécrotique au centre, qui souffre d’une carence en nutriments et en oxygène. Par conséquent, la plupart des protocoles actuels utilisent un système de circulation pour le milieu de culture afin d’améliorer la nutrition.
Pendant ce temps, il n’y a pas de systèmes dynamiques peu coûteux ou de bioréacteurs pour la culture d’organoïdes. Cet article décrit un protocole pour la production d’organoïdes cérébraux dans des mini-bioréacteurs compacts et peu coûteux fabriqués à la maison. Ce protocole permet d’obtenir des organoïdes de haute qualité en grande quantité.

Le schéma de protocole est illustré à la figure 1. Le protocole comprenait cinq milieux dans lesquels les CSPe se différenciaient en organoïdes cérébraux pendant au moins un mois. La différenciation a commencé puis les CSPe ont atteint la confluence de 75 à 90 %(Figure 2A,B). Les premiers signes de différenciation vers les neurones ont été observés aux jours 10 à 11 de la culture de l’iPSC dans le milieu A lorsque les cellules o...

Watch this Scientific Journal Video about Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors at JoVE.com

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

Nous décrivons ici un protocole pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSI). Pour obtenir des organoïdes cérébraux en grande quantité et de haute qualité, nous utilisons des mini-bioréacteurs faits maison.

Génération d’organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites dans des mini-bioréacteurs faits maison

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

À ce jour, les organoïdes cérébraux différenciés des cellules souches pluripotentes sont un modèle 3D vitro le plus proche du tissu cérébral humain natif. En outre, les organoïdes cérébraux conviennent également à la modélisation de diverses pathologies du système nerveux central, au test de substances pharmacologiquement actives et à une utilisation en médecine régénérative. Pendant ce temps, cette technologie en est encore au stade initial de développement.Le protocole peut être divisé en deux groupes en fonction de la méthode d’obtention des agrégats et de la culture ultérieure avec différenciation. Le premier comprend le protocole et les schémas de différenciation, différents dans le temps de culture et les inducteurs de différenciation avec maturation ultérieure de l’organoïde dans le shaker dans des dispositifs spéciaux à faible adhérence comme les tubes ou les plaques de marché. Un autre groupe comprend l’utilisation d’un bioréacteur spécial.L’analyse de divers protocoles a montré que les organoïdes doivent être cultivés dans des conditions de milieu nutritif circulant. Cependant, l’absence de systèmes simples et peu coûteux pour obtenir des organoïdes de taille et de morphologie standard nécessite le développement de tels dispositifs pour la mise à l’échelle du processus. Dans ce travail, nous décrivons notre méthode d’obtention et de test de mini bioréacteurs simples et peu coûteux qui permettent d’obtenir de grandes quantités d’organoïdes de haute qualité.Coupez les tubes de centrifugeuse stériles de 15 millilitres dans les anneaux, de 7 ou 8 millimètres de hauteur. Autoclavez les anneaux. Briser les faibles agrégations sur les boîtes de Petri traitées ou microbiologiques en miettes.Dissoudre environ 1 gramme de miettes de plastique dans 10 millilitres de chloroforme pendant la nuit pour préparer un plastique liquide. Faites un bouton en plastique au centre d’une boîte de Petri stérile ultra basse adhérence de 6 centimètres. Il existe deux façons également appropriées.Le premier, placez l’autoclave dans un anneau en plastique sur un centre et appliquez des demi-millilitres de plastique liquide à l’intérieur de l’anneau. Le second, sans anneaux en plastique, laisse tomber des demi-millilitres de plastique liquide sur le centre de la boîte de Pétri. Laissez la vaisselle ouverte pendant 2 ou 3 heures dans une hotte à écoulement laminaire jusqu’à séchage complet.Cultiver des cellules souches pluripotentes induites dans le milieu pour les cellules souches pluripotentes, jusqu’à 75 ou 90% de confluence dans les boîtes de Petri de 35 millimètres, pré-enduites d’une matrice dissoute dans le milieu Froid Dulbecco Modified Eagle Medium, et fisher-12 milieu. Préparer le milieu A plus le remplacement du sérum. Cultiver des cellules souches pluripotentes induites pendant 1 jour dans le milieu avec remplacement sérique.Changer le milieu des cellules souches pluripotentes en un milieu de remplacement sérique au jour zéro de la différenciation. Préparez le médium A.Changez le médium en moyen A au jour 2 de la différenciation. Cultivez des cellules en milieu A pendant 2 semaines, en milieu rafraîchissant dans des boîtes de Pétri tous les 2 jours.Au jour 14, commencez la formation de sphéroïde à l’aide d’une plaque de culture spéciale de 24 puits qui contient environ 1 200 micropuits dans chaque puits. Préparez une plaque de culture de 24 puits avec des micropuits. Ajouter à chaque puits 1 millilitre de milieu A, centrifuger brièvement à 1 300 g pendant 5 minutes dans un rotor à godet oscillant équipé d’un porte-plaque.Contrôlez au microscope qu’il n’y a pas de bulles dans les micropuits. Préparez le milieu B.Retirez le milieu de la boîte de Pétri. Pour le détachement cellulaire, traiter les cellules avec une solution d’EDTA de 1,5 millilitre préparée sur PBS.Contrôlez le détachement de la cellule au microscope. Récoltez la cellule dans un tube de 15 millilitres. Ajouter 5 millilitres de dulbecco mélangé et de milieu Fisher dans le tube vers les cellules.Centrifuger à 200g pendant 5 minutes. Retirez le surnageant et re-suspendez les cellules dans 2 millilitres de milieu B.Transférez la suspension de cellules contenant 1 milliard de cellules dans chaque puits d’une plaque de 24 puits avec des micropuits. Pipettez doucement les cellules jusqu’à plusieurs fois et centrifugez brièvement 100 g pendant 1 minute pour capturer la cellule dans les micropuits.Contrôlez au microscope que les cellules sont réparties uniformément dans des micropuits. Incuber la plaque pendant la nuit pour l’agrégation cellulaire dans les sphéroïdes. Le lendemain matin, jour 15, vérifiez au microscope la qualité des sphéroïdes, qui sont transparents et lisses s’ils sont sains.Recueillez soigneusement les sphéroïdes de chaque puits dans un tube de 15 millilitres, laissez les sphéroïdes précipiter par gravité pendant 2 et 3 minutes, puis retirez le surnageant. Ajouter aux sphéroïdes 2 millilitres de la matrice, décongelés et ex tempore sur glace. Mélanger doucement par pipetage et incuber à température ambiante pendant 30 minutes.Pour laver l’excès de matrice, ajouter au tube 8 millilitres de milieu B.Pipette doucement, puis centrifuger le tube pendant 1 minute à 100g. Retirez le surnageant. Ajouter au tube 20 millilitres de milieu B, pipeter doucement, puis répartir la suspension sphéroïde entre les mini-bioréacteurs.Placez ensuite les mini-bioréacteurs dans une boîte de Petri de 15 centimètres, ce qui empêche l’évaporation de l’eau et la contamination. Placez la boîte de Petri avec des mini-bioréacteurs sur un agitateur orbital. Cultivez les organoïdes à une vitesse de rotation de 70, 75 tr / min.Le jour 16, préparez le milieu C.Transférer l’organoïde dans un tube de 50 millilitres. Pendant 5 minutes, laissez-les tomber au fond. Aspirer le surnageant et ajouter 5 millilitres du milieu C.Rejoignez les organoïdes dans les mini-bioréacteurs.Cultivez les sphéroïdes en C moyen pendant 2 semaines, en rafraîchissant le milieu tous les 2 jours. Pendant ces 2 semaines, sélectionnez environ 100 sphéroïdes par mini bioréacteurs pour la culture suivante. Le jour 30, préparez le milieu D.Changez le milieu de culture en milieu D, qui est un milieu de maturation.Rafraîchir le milieu de culture tous les 2 ou 3 jours pendant 3 semaines. Utilisez ensuite le milieu D dissous dans F et GDNF. Après 1 mois de culture consécutive dans les milieux A et B, des organoïdes standardisés en taille et morphologie sont obtenus.Au fur et à mesure qu’il grandit, ils doivent changer le milieu plus souvent, jusqu’à 4 fois par semaine augmente également. Après 2 mois de culture, ils atteignent 4 et 5 millimètres de diamètre. Et après un autre mois, 5 et 6 millimètres et la croissance s’arrête.La figure montre l’apparition d’une enzyme organoïde, des sections claires peintes avec de l’hématoxyline et de l’éosine. L’analyse immunohistochimique pendant 1 mois montre la présence de grappes SOX2 positives de cellules progénitives, y compris à l’intérieur de la partie centrale. Dans la périphérie des organoïdes, la protéine acide fibrillaire gliale, la protéine 2 associée aux microtubules et l’hydrolase de thiazine positive.Les cellules sont concentrées, ce qui correspond à la forme mature des neurones. Dans certains cas, des grappes de blancs sur la zone nécrotique se forment dans la partie centrale. Cela indique la limitation de ce protocole pour l’obtention d’organoïdes plus gros.Très probablement, le facteur limitant de la croissance est le taux de diffusion des nutriments et de l’oxygène. Les différents types de médias et de cellules de sphéroïdes et le test de notre système pour certains types d’organoïdes. Beaucoup de cerveau et de rétine, des organoïdes combinés à partir de cellules de carcinome du foie et de cellules souches mésenchymateuses, des organoïdes combinés à partir d’appels de tige mésenchymateuses de blast capital et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques à partir de cellules souches pluripotentes induites et d’organoïdes intestinaux.Était-ce variable dans la composition initiale des cellules? Facteurs de différenciation, culture et milieu, matrice extracellulaire, et éventuellement aussi la composition du mélange gazeux, le taux de rotation de la plate-forme et d’autres paramètres. Il sera possible d’obtenir un organoïde avec la même forme, la même taille ou le même modèle morphologique dans divers organes et tissus.L’utilisation de mini-bioréacteurs proposée dans ce travail.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Frozen Buffy Manteaux en utilisant non-intégration épisomique plasmides

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Recherche

Biologie du développement

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules T périphériques humains à l&#39;aide de virus Sendai dans des conditions libres Feeder-

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Génération de cellules souches induites pluripotentes Utilisation synoviocytes fibroblaste Isolé Joints de la polyarthrite rhumatoïde Les patients

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Génération de Induced cellules souches pluripotentes à partir de mélanome humain Lymphocytes tumorales infiltrant

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Induite cellules souches pluripotentes génération de cellules sanguines utilisant Sendai Virus et Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Génération d&#39;Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Définition et génération évolutive des cellules hépatocytes-like de pluripotentes humaines Cellules souches

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Génération de type prosencéphale standardisées et reproductibles organoïdes cérébrale de l’homme induites par les cellules souches pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...