Name: brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors
Uploaded: 2021-12-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק 075-15-2019-1669 ממשרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית (ניתוח RT-PCR) ועל ידי מענק מס '19-15-00425 מקרן המדע הרוסית (לכל עבודה אחרת). המחברים מודים גם לפאבל בליצ'קוב על עזרתו בעריכת הווידאו. דמויות בכתב היד נוצרו עם BioRender.com.

הערה: השתמש בטכניקה סטרילית לאורך הפרוטוקול, למעט שלבים 1.2 ו- 1.3. לחמם את כל מדיה תרבותית ופתרונות ל 37 °C (7 °F) לפני החלת על תאים או organoids. לטפח תאים באינקובטור CO2 ב 37 °C ב 5% CO2 על 80% לחות. ערכת הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
1. הפיכת מנות פטרי למיני ביו-ריאקטור...

<ol>
	<li>Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+neurodegenerative+and+neurodevelopmental+diseases.">Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases.</a> Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).</li><li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+brain+Organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells:+promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders.">3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside+out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+regionally+specified+hPSC+derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration.">Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+region+specific+organoids+using+mini+bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure.">Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region+specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+hippocampal+neurons+from+self-organizing+human+embryonic+stem+cell+derived+dorsomedial+telencephalic+tissue.">Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue.</a> Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).</li><li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease.">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+platforms+for+drug+discovery.">Pluripotent stem cell platforms for drug discovery.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).</li><li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+depletes+neural+progenitors+in+human+cerebral+organoids+through+activation+of+the+innate+immune+receptor+TLR3.">Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).</li><li>Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+tissue-specific+SARS-CoV-2+infection+and+host+responses+using+human+stem+cell-derived+lung+and+cerebral+organoids.">Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).</li><li>Ao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-stop+microfluidic+assembly+of+human+brain+organoids+to+model+prenatal+cannabis+exposure.">One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure.</a> Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).</li><li>Di Nardo, P., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+standardization.">Stem cell standardization.</a> Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).</li><li>Jo, J., Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Matsui, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-month+cultured+cerebral+organoids+from+human+ES+cells+contain+matured+neural+cells.">Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells.</a> Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).</li><li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development.">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).</li><li>Eremeev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necessity+Is+the+mother+of+invention&#8221;+or+inexpensive,+reliable,+and+reproducible+protocol+for+generating+organoids.">Necessity Is the mother of invention&#8221; or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids.</a> Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region&#8211;specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region&#8211;specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).</li><li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+human+brain+organoids.">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li><li>Hall, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned,+organoid-based+cartilaginous+implants+exhibit+zone+specific+functionality+forming+osteochondral-like+tissues+in+vivo.">Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo.</a> Biomaterials. 273, 120820 (2021).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids&#8212;challenges+to+establish+a+brain+prototype.">Cerebral organoids&#8212;challenges to establish a brain prototype.</a> Cells. 10 (7), 1790 (2021).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+Cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).</li></ol>

הפרוטוקול המתואר כולל שני שלבים מכריעים המאפשרים יצירת אורגנוידים באיכות גבוהה בגודל אחיד. ראשית, האורגנוידים גדלים מפרואידים שהם כמעט זהים במספר התא ובבגרות התא. שנית, הביו-ראקטורים תוצרת בית מספקים לכל אורגנויד סביבה אחידה, שבה האורגנוידים אינם מצטופפים או נשארים זה לזה.
<p class="jove_content...

מודלים אנושיים נגזר iPSC נמצאים בשימוש נרחב במחקרים של הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות1. במהלך העשור האחרון, מודלים של רקמת מוח תלת-ממדית, מה שמכונה organoidsהמוח, השלימו למעשה תרביות עצביות 2D מסורתיות . האורגנוידים מסכמים במידה מסוימת את הארכיטקטורה התת-ממדית של המוח העוברי ומאפשרים מידול מדויק יותר. פרוטוקולים רבים מתפרסמים עבור הדור של organoids המייצגים אזורי מוח שונים: קליפת המוח3,4,5, המוח הקטן6, המוח האמצעי, המוח הקדמי, ההיפותלמוס7,8,9, והיפוקמפוס10. היו דוגמאות רבות לשימוש באורגנוידים כדי לחקור מחלות מערכת העצבים האנושית11. כמו כן, organoids יושמו בתגליות סמים12 ושימש במחקרים של מחלות זיהומיות, כולל SARS-Cov-213,14.
האורגנוידים במוח יכולים להגיע לקוטר של עד כמה מילימטרים. לכן, האזור הפנימי של האורגנויד עלול לסבול מהיפוקסיה או מתת תזונה ובסופו של דבר להפוך לנמק. לכן, פרוטוקולים רבים כוללים bioreactors מיוחדים8, שייקרים, או מערכות microfluidic15. התקנים אלה עשויים לדרוש כמויות גדולות של מדיה יקרה של תרבית תאים. כמו כן, העלות של ציוד כזה היא בדרך כלל גבוהה. כמה bioreactors מורכבים חלקים מכניים רבים שהופכים אותם קשה לעקר לשימוש חוזר.
רוב הפרוטוקולים סובלים "אפקט אצווה"16, אשר מייצר שונות משמעותית בין organoids המתקבלים iPSCs זהה. שונות זו מעכבת בדיקות סמים או מחקרים פרה-קליניים הדורשים אחידות. התשואה הגבוהה של organoids מספיק כדי לבחור organoids בגודל אחיד עשוי לפתור חלקית בעיה זו.
גורם הזמן הוא גם בעיה משמעותית. Matsui ואח ' (2018) הראה כי organoids המוח דורשים לפחות שישה חודשים כדי להגיע לבגרות17. Trujillo ואח ' (2019) גם הוכיח כי פעילות אלקטרופיזיולוגית התרחשה organoids רק לאחר שישה חודשים של טיפוח18. בשל זמן ההתבגרות האורגנויד הארוך, החוקרים לעתים קרובות להשיק בידול חדש לפני השלמת הקודם. תהליכים מקבילים מרובים של בידול דורשים הוצאות נוספות, ציוד ושטח מעבדה.
לאחרונה פיתחנו מיני bioreactor זה פותר בעיקר את הבעיות שהוזכרו לעיל19. ביו-ריאקטור ביתי זה מורכב מהדבקה נמוכה במיוחד או צלחת פטרי לא מטופלת עם ידית פלסטיק במרכז. ידית פלסטיק זו מונעת צפיפות של organoids ואת conglutination שלהם במרכז צלחת פטרי, אשר נגרמת על ידי סיבוב של שייקר. מאמר זה מתאר כיצד ביו-רקטור מיני זול ופשוט תוצרת בית זה מאפשר לייצר אורגנוידים במוח באיכות גבוהה בכמויות גדולות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>DMEM/F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>34425</td>
			<td>24-well culture plate with microwells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuronal supplement B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Serum replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>85850</td>
			<td>Pliripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Antimicrobials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>540220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Y27632</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-538</td>
			<td>Y27632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Dorsomorphin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-466</td>
			<td>Dorsomorphin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS LDN-193189</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-540</td>
			<td>LDN-193189</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS SB431542</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-543</td>
			<td>SB431542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versen solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040066</td>
			<td>0.48 mM EDTA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors

האורגנויד המוחי שמקורו ב- iPSC הוא טכנולוגיה מבטיחה למידול במבחנה של הפתולוגיות של מערכת העצבים והקרנת סמים. טכנולוגיה זו התפתחה לאחרונה. הוא עדיין בחיתוליו ויש לו כמה מגבלות שעדיין לא נפתרו. הפרוטוקולים הנוכחיים אינם מאפשרים להשיג organoids להיות עקבי מספיק לגילוי סמים ומחקרים פרה קליניים. ההתבגרות של organoids יכול לקחת עד שנה, דוחף את החוקרים להשיק תהליכי בידול מרובים בו זמנית. היא מטילה עלויות נוספות עבור המעבדה מבחינת שטח וציוד. בנוסף, אורגנוידים במוח לעתים קרובות יש אזור נמק במרכז, אשר סובל ממחסור בחומרים מזינים וחמצן. לפיכך, רוב הפרוטוקולים הנוכחיים להשתמש במערכת במחזור עבור מדיום תרבות כדי לשפר את התזונה.
בינתיים, אין מערכות דינמיות זולות או bioreactors לטיפוח organoid. מאמר זה מתאר פרוטוקול לייצור אורגנוידים במוח במיני-רה-קטרים ביתיים קומפקטיים וזולים. פרוטוקול זה מאפשר קבלת organoids באיכות גבוהה בכמויות גדולות.

ערכת הפרוטוקול מוצגת באיור 1. הפרוטוקול כלל חמש מדיה שבה IPSCs נבדלו לאורגנואידים במוח במהלך חודש אחד לפחות. ההבחנה החלה ואז IPSCs הגיעו למפגש של 75-90%(איור 2A,B). הסימנים הראשונים של בידול כלפי נוירונים נצפו בימים 10-11 של טיפוח iPSC במצב בינוני A כאשר תאים החלו ...

Watch this Scientific Journal Video about Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors at JoVE.com

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנוידים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (IPSCs). כדי להשיג אורגנוידים במוח בכמויות גדולות ובאיכות גבוהה, אנו משתמשים ביו-רה-קטרים מיני תוצרת בית.

דור אורגנויד במוח מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים במיני ביו-רהקטורים תוצרת בית

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

עד כה, האורגנוידים המוחיים המובחנים מתאי גזע פלוריפוטנטיים הם מודל 3D במבחנה הקרוב ביותר לרקמת המוח האנושית המקומית. בנוסף, אורגנוידים מוחיים מתאימים באותה מידה למידול פתולוגיות שונות של מערכת העצבים המרכזית, לבדיקת חומרים פעילים פרמקולוגית, וגם לשימוש ברפואה רגנרטיבית. בינתיים, טכנולוגיה זו עדיין נמצאת בשלב הראשוני של הפיתוח.הפרוטוקול יכול להיות מחולק לשתי קבוצות בהתאם לשיטת קבלת אגרגטים ואת הטיפוח נוסף עם בידול. הראשון כולל פרוטוקול ומזימות של בידול, שונה בזמן הטיפוח ומעוררי בידול עם הבשלה מאוחרת יותר של organoid בשייקר במכשירים מיוחדים של הידבקות נמוכה כמו צינורות שוק או צלחות. קבוצה נוספת כוללת שימוש ביו-רה-קטרים מיוחדים.ניתוח של פרוטוקולים שונים הראה כי organoids צריך להיות מעובד בתנאים עם מדיום מיזים במחזור. עם זאת, היעדר מערכות פשוטות וזולות להשגת organoid עם גודל סטנדרטי ומורפולוגיה דורשים פיתוח של מכשירים כאלה כדי לשנות את קנה המידה של התהליך. בעבודה זו, אנו מתארים את השיטה שלנו לקבלת ובדיקה של ביו-רהקטורים מיני פשוטים וזולים המאפשרים להשיג כמויות גדולות של organoids באיכות גבוהה.חותכים את צינורות צנטריפוגות סטרילי 15 מיליליטר לתוך הטבעות, 7 או 8 מילימטרים גובה. תבודד את הטבעות. לשבור אגרגציות נמוכות על מנות פטרי מטופלות או מיקרוביולוגיות לפירורים.ממיסים כ 1 גרם של פירורי פלסטיק ב 10 מיליליטר של כלורופורם לילה כדי להכין פלסטיק נוזלי. הפוך ידית פלסטיק במרכז של סטרילי אולטרה הידבקות נמוכה 6 ס"מ צלחת פטרי. ישנן שתי דרכים מתאימות באותה מידה.הראשון, לשים את autoclave בטבעת פלסטיק על מרכז ולהחיל חצי מיליליטר של פלסטיק נוזלי לחלק הפנימי של הטבעת. השני, ללא טבעות פלסטיק טיפה חצי מיליליטר של פלסטיק נוזלי על מרכז צלחת פטרי. השאירו את הכלים פתוחים במשך 2 או 3 שעות במכסה המנוע של זרימה למינאר עד ליובש מוחלט.לטפח תאי גזע pluripotent המושרה במדיום עבור תאי גזע pluripotent, עד 75 או 90% מפגש בצלחות פטרי 35 מילימטר, מצופה מראש עם מטריצה מומסת דלבקו שונה נשר מדיום, ופישר-12 בינוני. הכן תחליף בינוני A פלוס סרום. לטפח תאי גזע פלוריפוטנטים המושרה במשך יום אחד במדיום עם החלפת סרום.החלף מדיום לתאי גזע פלוריפוטנטים למדיום החלפת סרום ביום האפס של בידול. הכן A.Change את בינוני עד בינוני A ביום 2 של בידול. לטפח תאים בינוני A במשך 2 שבועות, מרענן מדיום במנות פטרי כל 2 ימים.ביום 14, להתחיל את היווצרות של כדורי באמצעות צלחת תרבות מיוחדת 24-well המכיל כ 1, 200 microwells בכל באר. הכינו צלחת תרבית של 24 באר עם מיקרווולים. מוסיפים לכל באר 1 מיליליטר של בינוני A, צנטריפוגה לזמן קצר ב 1, 300 גרם במשך 5 דקות ברוטור דלי מתנדנד מצויד מחזיק צלחת.שליטה מתחת למיקרוסקופ שאין בועות במיקרווולים. מכינים את ה-B. מוציאים את המדיום מצלחת הפטרי. עבור ניתוק התא, לטפל בתאים עם 1.5 מיליליטר פתרון EDTA מוכן על PBS.שלוט בניתוק התא מתחת למיקרוסקופ. לקצור את התא לתוך צינור 15 מיליליטר. הוסף 5 מיליליטר מעורב דולבק ופישר מדיום בצינור לכיוון התאים.צנטריפוגה ב-200 גרם ל-5 דקות. הסר את תאי supernatant ולהשעות מחדש ב 2 מיליליטר של B. העבר את השעיית התאים המכילים 1 מיליארד תאים לתוך כל באר של צלחת 24 באר עם microwells. בעדינות pipette תאים עד ומטה מספר פעמים צנטריפוגה לזמן קצר 100 גרם במשך 1 דקה כדי ללכוד תא ב microwells.שליטה מתחת למיקרוסקופ שהתא מופץ באופן שווה במיקרווולים. לדגור את הצלחת לילה עבור צבירת תאים בפרואידים. למחרת בבוקר, יום 15, לבדוק מתחת למיקרוסקופים את איכות כדורי, שהם שקופים וחלקים אם בריאים.בזהירות לאסוף את כדורי מכל באר לתוך צינור 15 מיליליטר, להשאיר את כדורי לזרז על ידי כוח המשיכה במשך 2 ו 3 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant. מוסיפים לכדורואידים 2 מיליליטר של המטריצה, מופשרים ואקס טמפור על קרח. מערבבים בעדינות על ידי צנרת ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.כדי לשטוף עודף של מטריצה, להוסיף לצינור 8 מיליליטר של B.Pipette בינוני בעדינות, ולאחר מכן צנטריפוגה הצינור במשך 1 דקות ב 100g. הסר את סופר-טבעי. מוסיפים לצינור 20 מיליליטר של B בינוני, פיפטה בעדינות, ואז לפצל את ההשעיה כדורית בין bioreactors מיני.לאחר מכן מניחים את bioreactors מיני לתוך צלחת פטרי 15 ס"מ, אשר מונע אידוי של מים וזיהום. שים את צלחת פטרי עם bioreactors מיני על שייקר מסלולית. לטפח את organoids בקצב סיבוב 70, 75 סל"ד.ביום 16, להכין בינוני C.Transfer organoid לתוך צינור 50 מיליליטר. במשך 5 דקות, תן להם ליפול לתחתית. שאפו את הסופר-נט והוסיפו 5 מיליליטר של C.Re. הבינוני להצטרף האורגנוידים במיני bioreactors.לטפח כדוריות בינוני C במשך 2 שבועות, מרענן את המדיום כל 2 ימים. במהלך שבועיים אלה, בחר כ -100 כדורי כל מיני bioreactors לטיפוח הבא. ביום 30, להכין בינוני D.Change טיפוח בינוני עד בינוני D, שהוא מדיום התבגרות.רענן את המדיום כל 2 או 3 ימים במשך 3 שבועות. לאחר מכן השתמש ב- D הבינוני המומס ב- F וב- GDNF. לאחר חודש של טיפוח רצופים בינוני A ו- B, organoids מתוקננת בגודל ומורפולוגיה מתקבלים.ככל שהוא גדל, הם צריכים לשנות את המדיום לעתים קרובות יותר, עד 4 פעמים בשבוע גם עולה. לאחר חודשיים של טיפוח, הם מגיעים לקוטר של 4 ו-5 מ"מ. ואחרי עוד חודש, 5 ו-6 מ"מ והצמיחה נעצרת.האיור מראה את המראה של אנזים organoid, קטעים ברורים צבועים המטוקסילין ו אאוזין. ניתוח אימונוהיסטוכימי במשך חודש אחד מראה את נוכחותם של אשכולות חיוביים SOX2 של תאי אבות, כולל בתוך החלק המרכזי. בפריפריה של האורגנוידים, חלבון חומצי פרברילי גליה, חלבון הקשור למיקרוטובול 2, והידרולסה תיאזין חיובית.תאים מרוכזים, אשר מתאים צורה בוגרת של נוירונים. במקרים מסוימים, אשכולות של לבנים על שטח נמק נוצרים בחלק המרכזי. זה מציין את המגבלה של פרוטוקול זה לקבלת organoids גדול יותר.סביר להניח, הגורם המגביל של הצמיחה הוא קצב דיפוזיה של חומרים מזינים וחמצן. אמצעי התקשורת והתאים השונים של כדוריות ובדיקת המערכת שלנו עבור סוגים מסוימים של organoids. הרבה מוח ורשתית, אורגנוידים משולבים מתאי קרצינומה בכבד ותאי גזע מזנכימליים, אורגנוידים משולבים משיחות גזע מזנכימליות בפיצוץ הבירה והבחנה בין תאי גזע המטופויים לתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים ואורגנואידים במעיים.האם זה היה משתנה בהרכב הראשוני של תאים? גורמי בידול, תרבות, מטריצה בינונית, חוץ תאית, ואולי גם הרכב תערובת הגז, קצב סיבוב האסדה ופרמטרים אחרים. ניתן יהיה להשיג organoid עם אותה צורה, גודל, או מודל מורפולוגיה באיברים ורקמות שונים.השימוש במיני ביו-קטרים המוצעים לעבודה זו.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מתאי T ההיקפיים אנושיים באמצעות וירוס סנדאי בתנאים ללא מזין

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

הדור של גזע תאים מושרה-פלוריפוטנטיים שימוש פיברובלסטים דמויי Synoviocytes מבודדת מן מפרידים של בחולי דלקת מפרקים שגרונית

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

דור של תאי גזע מושרים ממלנומה האדם שחדר-גידול לימפוציטים

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

מוגדרי דור Scalable של תאי Hepatocyte דמוי מתאי גזע פלוריפוטנטיים האנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Chondrogenic גלולה היווצרות דם טבורי הנגזרות Pluripotent תאים גזעיים

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...