Name: brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors
Uploaded: 2021-12-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors at JoVE.com

この研究は、ロシア連邦科学高等教育省からの助成金075-15-2019-1669(RT-PCR分析)とロシア科学財団からの助成金No.19-15-00425(他のすべての仕事のために)によって支えられました。著者らはまた、ビデオ編集に彼の助けを借りてパヴェル・ベリコフに感謝します。原稿の中の数字は BioRender.com で作成されました。

メモ:手順1.2と1.3を除いて、プロトコル全体で無菌技術を使用してください。細胞またはオルガノイドに塗布する前に、すべての培養培地と溶液を37°Cに温めます。CO2インキュベーターで、湿度80%で5%CO2で37°Cで細胞を培養します。プロトコル スキームを図1に示します。
1. ペトリ皿をミニバイオリアクターに変える
<ol><...

<ol>
	<li>Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+neurodegenerative+and+neurodevelopmental+diseases.">Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases.</a> Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).</li><li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+brain+Organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells:+promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders.">3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside+out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+regionally+specified+hPSC+derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration.">Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+region+specific+organoids+using+mini+bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure.">Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region+specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+hippocampal+neurons+from+self-organizing+human+embryonic+stem+cell+derived+dorsomedial+telencephalic+tissue.">Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue.</a> Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).</li><li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease.">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+platforms+for+drug+discovery.">Pluripotent stem cell platforms for drug discovery.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).</li><li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+depletes+neural+progenitors+in+human+cerebral+organoids+through+activation+of+the+innate+immune+receptor+TLR3.">Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).</li><li>Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+tissue-specific+SARS-CoV-2+infection+and+host+responses+using+human+stem+cell-derived+lung+and+cerebral+organoids.">Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).</li><li>Ao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-stop+microfluidic+assembly+of+human+brain+organoids+to+model+prenatal+cannabis+exposure.">One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure.</a> Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).</li><li>Di Nardo, P., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+standardization.">Stem cell standardization.</a> Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).</li><li>Jo, J., Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Matsui, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-month+cultured+cerebral+organoids+from+human+ES+cells+contain+matured+neural+cells.">Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells.</a> Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).</li><li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development.">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).</li><li>Eremeev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necessity+Is+the+mother+of+invention&#8221;+or+inexpensive,+reliable,+and+reproducible+protocol+for+generating+organoids.">Necessity Is the mother of invention&#8221; or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids.</a> Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region&#8211;specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region&#8211;specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).</li><li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+human+brain+organoids.">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li><li>Hall, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned,+organoid-based+cartilaginous+implants+exhibit+zone+specific+functionality+forming+osteochondral-like+tissues+in+vivo.">Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo.</a> Biomaterials. 273, 120820 (2021).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids&#8212;challenges+to+establish+a+brain+prototype.">Cerebral organoids&#8212;challenges to establish a brain prototype.</a> Cells. 10 (7), 1790 (2021).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+Cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).</li></ol>

記載されたプロトコルは、均一なサイズの高品質オルガノイドの生成を可能にする2つの重要なステップを有する。まず、オルガノイドは、細胞数と細胞成熟度がほぼ同じスフェロイドから成長する。第二に、自家製のバイオリアクターは、オルガノイドが群がったりくっつくりしない均一な環境を各オルガノイドに提供します。
細胞の品質と細胞成熟の状態は、プロト?...

ヒトiPSC由来モデルは、神経発達および神経変性疾患の研究に広く使用されている。過去10年間で、3D脳組織モデル、いわゆる脳オルガノイドは、本質的に伝統的な2Dニューロン培養2を補完した。オルガノイドはある程度胚性脳の3Dアーキテクチャを再現し、より正確なモデリングを可能にする。大脳皮質3、4、5、小脳6、中脳、前脳、視床下部7、8、9、海馬10の異なる脳領域を表すオルガノイドの生成のために多くのプロトコルが公開されています。ヒト神経系疾患11を研究するためにオルガノイドを使用する複数の例がある。また、オルガノイドは、薬物発見12に実施され、感染症の研究に使用され、SARS-Cov-213,14を含む。
脳オルガノイドは直径数ミリメートルまで達することができます。だから、オルガノイドの内領域は、低酸素症や栄養失調に苦しみ、最終的に壊死的になることがあります。したがって、多くのプロトコルは、特殊なバイオリアクター8、シェーカー、またはマイクロ流体システム15を含む。これらの装置は、大量の高価な細胞培養培地を必要とするかもしれない。また、このような機器のコストは通常高いです。一部のバイオリアクターは、再利用のために殺菌することが困難になる多くの機械的な部品で構成されています。
ほとんどのプロトコルは、同一のiPSCから得られたオルガノイド間で有意な変動性を生み出す「バッチ効果」16に苦しんでいる。この変動は、薬物検査または均一性を必要とする前臨床試験を妨げる。オルガノイドの収率が高いため、均一なサイズのオルガノイドを選択できるほど、部分的にこの問題を解決できる。
時間係数も重大な問題です。松井ら(2018)は、脳オルガノイドが成熟17に達するまでに少なくとも6ヶ月を要することを示した。Trujilloら(2019)はまた、6ヶ月の培養18の後にのみオルガノイドで電気生理活性が起こったことを実証した。オルガノイド成熟時間が長いため、研究者はしばしば前の分化を完了する前に新しい分化を開始します。分化の複数の並列プロセスには、追加の費用、設備、および実験室スペースが必要です。
我々は最近、主に19上記の問題を解決するミニバイオリアクターを開発しました。この自家製バイオリアクターは、中央にプラスチックノブを備えた超低接着または未処理のペトリ皿で構成されています。このプラスチックノブは、シェーカーの回転によって引き起こされるペトリ皿の中央にオルガノイドとその凝集の混雑を防ぎます。この安価でシンプルな自家製ミニバイオリアクターが、高品質の脳オルガノイドを大量に生成する方法について説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>DMEM/F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>34425</td>
			<td>24-well culture plate with microwells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuronal supplement B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Serum replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>85850</td>
			<td>Pliripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Antimicrobials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>540220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Y27632</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-538</td>
			<td>Y27632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Dorsomorphin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-466</td>
			<td>Dorsomorphin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS LDN-193189</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-540</td>
			<td>LDN-193189</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS SB431542</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-543</td>
			<td>SB431542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versen solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040066</td>
			<td>0.48 mM EDTA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors

iPSC由来の脳オルガノイドは、イン ビトロで 神経系の病理と薬物スクリーニングをモデル化するための有望な技術です。この技術は最近登場しました。それはまだ初期段階にあり、まだ未解決のいくつかの制限があります。現在のプロトコルは、オルガノイドを得ることを薬物発見および前臨床試験のために十分に一貫することを可能にしていない。オルガノイドの成熟には最大1年かかる可能性が高く、研究者は複数の分化プロセスを同時に開始する。それはスペースおよび装置の点で実験室のための付加的な費用を課す。さらに、脳オルガノイドは、多くの場合、栄養と酸素欠乏症に苦しむ中心に壊死領域を持っています。したがって、ほとんどの現行プロトコルは、栄養を改善するために培養培地の循環系を使用する。
一方、オルガノイド栽培のための安価な動的システムやバイオリアクターはありません。本論文では、小型で安価な自家製ミニバイオリアクターで脳オルガノイドを製造するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、大量に高品質のオルガノイドを得ることができます。

プロトコル スキームを図1に示します。このプロトコルには、iPSCが少なくとも1ヶ月間に脳オルガノイドに分化する5つのメディアが含まれていました。分化が開始された後、iPSCは75-90%の合流点に達した(図2A、B)。細胞が「ロゼット」に集まり始めた時、ニューロンに対する分化の最初の兆候は、10~11日目に、細胞が「ロゼット」に集ま?...

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Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを生成するためのプロトコルについて説明する。脳オルガノイドを大量に、高品質で得るために、自家製ミニバイオリアクターを使用しています。

自家製ミニバイオリアクターにおける人工多能性幹細胞からの脳オルガノイド発生

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

現在までに、多能性幹細胞から分化した大脳オルガノイドは、ヒトの脳組織に最も近い3D型のvitroモデルである。さらに、大脳オルガノイドは、様々な中枢神経系の病態のモデル化、薬理学的活性物質の試験、再生医療への使用にも同様に適しています。一方、この技術は開発の初期段階にあります。このプロトコルは、分化を伴う凝集体の取得方法とさらなる栽培に応じて2つのグループに分けることができる。最初の分化のプロトコルとスキームを含みます, 市場のチューブやプレートのような特別な低接着デバイスでシェーカーでオルガノイドのその後の成熟と栽培時間と分化誘導器で異なります.別のグループには、特殊なバイオリアクターの使用が含まれます。様々なプロトコルの分析は、オルガノイドが循環栄養培地と条件下で栽培されるべきであることを示しています。しかし、標準サイズと形態を有するオルガノイドを得るための簡単で安価なシステムがない場合、プロセスをスケーリングするためのそのようなデバイスの開発が必要である。本研究では、高品質のオルガノイドを大量に得ることを可能にする、簡素で安価なミニバイオリアクターの入手と試験を行う方法を説明する。無菌15ミリリットルの遠心管をリングに切り込み、高さ7~8ミリメートル。リングをオートクレーブします。処理されたまたは微生物学的なペトリ皿の低凝集をパン粉に分解する。一晩クロロホルムの10ミリリットルに約1グラムのプラスチックパン粉を溶解し、液体プラスチックを調製します。滅菌超低接着6センチメートルペトリ皿の中央にプラスチックノブを作ります。2つの同様に適切な方法があります。最初に、オートクレーブを中央のプラスチックリングに入れ、リングの内側に液体プラスチックの半ミリリットルを塗布します。第二に、プラスチックリングなしでペトリ皿の中央に液体プラスチックの半ミリリットルを落とします。完全な乾燥がするまで、皿流フードで2〜3時間開いたままにしておきます。多能性幹細胞用培地中に誘導多能性幹細胞を培養し、ペトリ皿35ミリメートルで最大75または90%合流し、冷たいダルベックコ改変イーグル培地に溶解したマトリックスで前塗りし、フィッシャー-12培地を行う。培地Aプラス血清交換を準備します。血清置換を用いて培地中で1日間、誘導多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞の培地を分化ゼロ日の血清置換培地に変更する。培地A.分化2日目に培地Aに変更します。培地Aで2週間培養し、2日ごとにペトリ皿に培地をさわやかにします。14日目に、各ウェルに約1,200マイクロウェルを含む特別な24ウェル培養プレートを使用してスフェロイドの形成を開始します。マイクロウェルで24ウェルの培養プレートを準備します。各ウェルにミディアムA1ミリリットル、遠心分離機を1,300gで5分間、プレートホルダーを取り付けたスイングバケットローターに加えます。マイクロウェルに気泡がないことを顕微鏡でコントロールする。中ミディアムB.ペトリ皿から培地を取り出します。細胞剥離の場合は、PBSで調製した1.5ミリリットルのEDTA溶液で細胞を治療します。顕微鏡下で細胞剥離を制御します。細胞を15ミリリットルのチューブに収穫する。5ミリリットルの混合ダルベッコとフィッシャー培地をチューブに加えて細胞に向かって入れ.200gで5分間遠心分離機。上清を取り除き、2ミリリットルの培地Bで細胞を再懸濁させ、10億個の細胞を含む細胞懸濁液をマイクロウェルを備えた24ウェルプレートの各ウェルに移す。ピペット細胞を数回上下に軽くし、遠心分離機は100gを1分間短くしてマイクロウェル内の細胞を捕捉する。細胞がマイクロウェルに均等に分布することを顕微鏡で制御する。スフェロイド中の細胞凝集のためにプレートを一晩インキュベートします。翌朝、15日目は、健康であれば透明で滑らかなスフェロイドの品質を顕微鏡で確認してください。慎重に15ミリリットルのチューブに各ウェルからスフェロイドを収集し、2と3分間重力によって沈殿するスプフェロイドを残し、その後、上清を除去します。マトリックスの2ミリリットルの回転楕円体に加え、解凍し、氷の上で元テンポを付ける。ピペットで軽く混ぜ、室温で30分間インキュベートします。マトリックスの過剰を洗浄するには、穏やかにミディアムB.ピペットのチューブ8ミリリットルに追加し、100gで1分間チューブを遠心します。上清を取り除く。ミディアムBのチューブ20ミリリットルに加え、ピペットを穏やかに、ミニバイオリアクター間でスプフェロイド懸濁液を分割する。その後、ミニバイオリアクターを15センチメートルのペトリ皿に入れ、水の蒸発と汚染を防ぎます。軌道シェーカーにミニバイオリアクターとペトリ皿を置きます。オルガノイドを回転速度70、75rpmで栽培する。16日目に、50ミリリットルチューブに中程度のC.トランスファーオルガノイドを調製する。5分間、底に落ちるようにします。上清を吸引し、ミニバイオリアクター内のオルガノイドに再結合する培地C.の5ミリリットルを加える。スフェロイドを培地Cで2週間栽培し、2日ごとに培地をリフレッシュする。これらの2週間の間に、次の栽培のためのミニバイオリアクターごとに約100スフェロイドを選択する。30日目に、成熟培地である培地Dに培地D.チェンジ培養培地を調製する。栽培培地を2~3日ごとに3週間リフレッシュします。次に、FとGDNFに溶解した培地Dを使用する。1ヶ月連続して培地A及びBで培養した後、サイズ及び形態で標準化されたオルガノイドが得られる。成長するにつれて、彼らはより頻繁に培地を変更する必要があります、週に4回までも増加します。2ヶ月の栽培後、直径4、5ミリに達する。そして、さらに1ヶ月後、5と6ミリメートルと成長が停止します。図は、ヘマトキシリンとエオジンで塗られたオルガノイド酵素、明確な部分の外観を示しています。1ヶ月間の免疫物質化学的分析は、中枢部を含む前駆細胞のSOX2陽性クラスターの存在を示す。オルガノイドの末梢では、グリアフィブリリン酸性タンパク質、微小管関連タンパク質2、およびチアジンヒドロラーゼ陽性。細胞は濃縮され、これは成熟した形態のニューロンに対応する。いくつかのケースでは、壊死領域上の白人のクラスターが中央部に形成されています。これは、より大きなオルガノイドを得るためのこのプロトコルの限界を示す。最も可能性の高い, 成長の制限要因は、栄養素と酸素の拡散率です。.様々なメディアや細胞タイプのスフェロイドと、オルガノイドのいくつかの種類のシステムをテストします。脳およびレチナの多くは、肝臓癌細胞と間葉系幹細胞からのオルガノイドを組み合わせたもので、資本芽球間葉系幹細胞呼び出しからのオルガノイドと、人工多能性幹細胞および腸オルガノイドからの造血幹細胞分化を組み合わせた。細胞の初期組成では可変でしたか?分化因子、培養、培地、細胞外マトリックス、およびおそらくガス混合物組成、プラットフォーム回転の速度、および他のパラメータも挙げている。様々な臓器や組織において同じ形状、大きさ、または形態モデルを有するオルガノイドを得ることが可能となる。ミニバイオリアクターの使用は、この研究に提案しました。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

関節リウマチ患者の関節から分離された線維芽細胞様滑膜細胞を用いて誘導多能性幹細胞の生成

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...