Name: brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors
Uploaded: 2021-12-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd 075-15-2019-1669 fra Vitenskaps- og høyere utdanningsdepartementet i Russland (RT-PCR-analyse) og ved tilskudd nr. Forfatterne takker også Pavel Belikov for hans hjelp med videoredigering. Figurer i manuskriptet ble laget med BioRender.com.

MERK: Bruk steril teknikk i hele protokollen, unntatt trinn 1.2 og 1.3. Varm opp alle kulturmedier og løsninger til 37 °C før du påfører celler eller organoider. Dyrk celler i en CO2 inkubator ved 37 °C ved 5 % CO2 ved 80 % fuktighet. Protokolloppsettet vises i figur 1.
1. Transformere Petri-retter til minibioreaktorer
<ol><li>Klipp sterile 15 ml sentrifugerør i ringer på 7-8 mm i høyden; autoklavering av ringene.<...

<ol>
	<li>Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+neurodegenerative+and+neurodevelopmental+diseases.">Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases.</a> Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).</li><li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+brain+Organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells:+promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders.">3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside+out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+regionally+specified+hPSC+derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration.">Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+region+specific+organoids+using+mini+bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure.">Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region+specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+hippocampal+neurons+from+self-organizing+human+embryonic+stem+cell+derived+dorsomedial+telencephalic+tissue.">Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue.</a> Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).</li><li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease.">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+platforms+for+drug+discovery.">Pluripotent stem cell platforms for drug discovery.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).</li><li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+depletes+neural+progenitors+in+human+cerebral+organoids+through+activation+of+the+innate+immune+receptor+TLR3.">Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).</li><li>Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+tissue-specific+SARS-CoV-2+infection+and+host+responses+using+human+stem+cell-derived+lung+and+cerebral+organoids.">Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).</li><li>Ao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-stop+microfluidic+assembly+of+human+brain+organoids+to+model+prenatal+cannabis+exposure.">One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure.</a> Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).</li><li>Di Nardo, P., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+standardization.">Stem cell standardization.</a> Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).</li><li>Jo, J., Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Matsui, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-month+cultured+cerebral+organoids+from+human+ES+cells+contain+matured+neural+cells.">Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells.</a> Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).</li><li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development.">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).</li><li>Eremeev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necessity+Is+the+mother+of+invention&#8221;+or+inexpensive,+reliable,+and+reproducible+protocol+for+generating+organoids.">Necessity Is the mother of invention&#8221; or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids.</a> Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region&#8211;specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region&#8211;specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).</li><li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+human+brain+organoids.">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li><li>Hall, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned,+organoid-based+cartilaginous+implants+exhibit+zone+specific+functionality+forming+osteochondral-like+tissues+in+vivo.">Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo.</a> Biomaterials. 273, 120820 (2021).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids&#8212;challenges+to+establish+a+brain+prototype.">Cerebral organoids&#8212;challenges to establish a brain prototype.</a> Cells. 10 (7), 1790 (2021).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+Cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).</li></ol>

Den beskrevne protokollen har to viktige trinn som tillater generering av høykvalitets organoider av jevn størrelse. For det første vokser organoidene fra sfæroider som er nær identiske i cellenummer og cellemodenhet. For det andre gir de hjemmelagde bioreaktorer hvert organoid et ensartet miljø, hvor organoider ikke samler seg eller holder seg sammen.
Cellekvaliteten og tilstanden til cellemodning er avgjørende for å utføre protokollen. Det er viktig å starte nevronal differensierin...

Humane iPSC-avledede modeller er mye brukt i studier av nevrodevelopmentale og nevrodegenerative lidelser1. I løpet av det siste tiåret komplementerte 3D-hjernevevsmodeller, såkalte hjerneorganoider, i hovedsak tradisjonelle 2D-nevronkulturer2. Organoidene rekapitulerer til en viss grad 3D-arkitekturen til den embryonale hjernen og tillater mer presis modellering. Mange protokoller er publisert for generering av organoider som representerer forskjellige hjerneregioner: hjernebark3,4,5, cerebellum6, midbrain, forebrain, hypothalamus7,8,9og hippocampus10. Det har vært flere eksempler på bruk av organoider for å studere sykdommer i det menneskelige nervesystemet11. Også organoidene ble implementert i narkotikafunn12 og brukt i studier av smittsomme sykdommer, inkludert SARS-Cov-213,14.
Hjerneorganoidene kan nå opptil flere millimeter i diameter. Så kan organoidens indre sone lide av hypoksi eller underernæring og til slutt bli nekrotisk. Derfor inkluderer mange protokoller spesielle bioreaktorer8, shakers eller mikrofluidiske systemer15. Disse enhetene kan kreve store mengder dyre cellekulturmedier. Kostnaden for slikt utstyr er også vanligvis høy. Noen bioreaktorer består av mange mekaniske deler som gjør dem vanskelige å sterilisere for gjenbruk.
De fleste protokoller lider av "batch effekt"16, som genererer betydelig variasjon blant organoider hentet fra de identiske iPSCene. Denne variasjonen hindrer legemiddeltesting eller prekliniske studier som krever ensartethet. Det høye utbyttet av organoider nok til å velge organoider av jevn størrelse kan delvis løse dette problemet.
Tidsfaktoren er også et betydelig problem. Matsui et al. (2018) viste at hjerneorganoider krever minst seks måneder for å nå modenhet17. Trujillo et al. (2019) viste også at elektrofysiologisk aktivitet skjedde i organoider bare etter seks måneder med dyrking18. På grunn av den lange organoidmodningstiden lanserer forskerne ofte ny differensiering før de fullfører den forrige. Flere parallelle differensieringsprosesser krever ekstra utgifter, utstyr og laboratorieplass.
Vi har nylig utviklet en mini bioreaktor som hovedsakelig løser problemene nevnt ovenfor19. Denne hjemmelagde bioreaktoren består av en ultra-lav vedheft eller ubehandlet Petri-tallerken med en plastknott i midten. Denne plastknotten forhindrer trengsel av organoider og deres konglutinasjon i midten av Petri-parabolen, noe som skyldes ristens rotasjon. Dette dokumentet beskriver hvordan denne billige og enkle hjemmelagde minibioreaktoren gjør det mulig å generere hjerneorganoider av høy kvalitet i store mengder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>DMEM/F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>34425</td>
			<td>24-well culture plate with microwells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuronal supplement B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Serum replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>85850</td>
			<td>Pliripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Antimicrobials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>540220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Y27632</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-538</td>
			<td>Y27632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Dorsomorphin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-466</td>
			<td>Dorsomorphin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS LDN-193189</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-540</td>
			<td>LDN-193189</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS SB431542</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-543</td>
			<td>SB431542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versen solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040066</td>
			<td>0.48 mM EDTA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors

Den iPSC-avledede hjerneorganoiden er en lovende teknologi for in vitro modellering av patologiene i nervesystemet og legemiddelscreening. Denne teknologien har dukket opp i det siste. Det er fortsatt i sin spede begynnelse og har noen begrensninger uløst ennå. De nåværende protokollene tillater ikke å skaffe organoider til å være konsistente nok til narkotikaoppdagelse og prekliniske studier. Modningen av organoider kan ta opptil et år, og presser forskerne til å starte flere differensieringsprosesser samtidig. Det pålegger laboratoriet ekstra kostnader når det gjelder plass og utstyr. I tillegg har hjerneorganoider ofte en nekrotisk sone i midten, som lider av nærings- og oksygenmangel. Derfor bruker de fleste nåværende protokoller et sirkulerende system for kulturmedium for å forbedre ernæring.
I mellomtiden er det ingen billige dynamiske systemer eller bioreaktorer for organoid dyrking. Dette dokumentet beskriver en protokoll for å produsere hjerneorganoider i kompakte og rimelige hjemmelagde minibioreaktorer. Denne protokollen gjør det mulig å skaffe organoider av høy kvalitet i store mengder.

Protokolloppsettet vises i figur 1. Protokollen inkluderte fem medier der iPSCer differensiert til hjerneorganoider i løpet av minst en måned. Differensieringen ble startet da iPSCer nådde 75-90% samløp (Figur 2A, B). De første tegn på differensiering mot nevroner ble observert på dagene 10-11 av iPSC dyrking i middels A da celler begynte å klynge seg inn i "rosetter" (Figur 2C). På dag 14-15 differensiert ...

Watch this Scientific Journal Video about Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors at JoVE.com

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

Her beskriver vi en protokoll for å generere hjerneorganoider fra menneskeskapte pluripotente stamceller (iPSCer). For å oppnå hjerneorganoider i store mengder og av høy kvalitet, bruker vi hjemmelagde minibioreaktorer.

Hjerneorganoid generasjon fra induserte pluripotente stamceller i hjemmelagde minibioreaktorer

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

Til dags dato er hjerneorganoidene differensiert fra pluripotente stamceller en vitro 3D-modell nærmest det innfødte menneskelige hjernevevet. I tillegg er cerebral organoider like egnet for modellering av ulike sentralnervesystempatologier, testing av farmakologisk aktive stoffer, og også for bruk i regenerativ medisin. I mellomtiden er denne teknologien fortsatt i begynnelsen av utviklingen.Protokollen kan deles inn i to grupper avhengig av metoden for å skaffe aggregater og videre dyrking med differensiering. Den første inkluderer protokoll og ordninger for differensiering, forskjellig i dyrkingstid og differensieringsindusere med etterfølgende modning av organoid i shakeren i spesielle lavadhesjonsenheter som markedsrør eller plater. En annen gruppe inkluderer bruk av spesielle bioreaktorer.Analyse av ulike protokoller har vist at organoider bør dyrkes under forhold med sirkulerende næringsmedium. Fraværet av enkle og rimelige systemer for å skaffe organoid med standard størrelse og morfologi krever imidlertid utvikling av slike enheter for skalering av prosessen. I dette arbeidet beskriver vi vår metode for å skaffe og teste enkle og rimelige minibioreaktorer som gjør det mulig å skaffe store mengder organoider av høy kvalitet.Klipp de sterile 15 milliliter sentrifugerørene i ringene, 7 eller 8 millimeter i høyden. Autoklaver ringene. Bryt lavaggregering på behandlede eller mikrobiologiske Petri-retter i krummer.Løs opp ca 1 gram plastkrummer i 10 milliliter kloroform over natten for å forberede en flytende plast. Lag en plastknott i midten av en steril ultra-vedheft 6 centimeter Petri parabolen. Det er to like egnede måter.Den første, legg autoklaven i en plastring på et senter og påfør halvparten milliliter flytende plast på innsiden av ringen. Den andre, uten plastringer, slipper halvparten milliliter flytende plast på midten av Petri-parabolen. La oppvasken stå åpen i 2 eller 3 timer i en laminær strømningshette til den er fullstendig tørr.Dyrk induserte pluripotente stamceller i mediet for pluripotente stamceller, opptil 75 eller 90% samløp i 35 millimeter Petri-retter, forhåndsbelagt med en matrise oppløst i kaldt Dulbecco Modified Eagle Medium og Fisher-12 medium. Forbered medium A pluss serumutskifting. Dyrk induserte pluripotente stamceller i 1 dag i mediet med serumerstatning.Bytt medium for pluripotente stamceller til et serumerstatningsmedium på dag null av differensiering. Forbered medium A.Endre medium til middels A på dag 2 av differensiering. Dyrk celler i middels A i 2 uker, forfriskende medium i Petri-retter hver annen dag.På dag 14 starter du dannelsen av sfæroid ved hjelp av en spesiell 24-brønns kulturplate som inneholder ca. 1200 mikrowells i hver brønn. Forbered en 24-brønns kulturplate med mikrowells. Legg til hver brønn 1 milliliter middels A, sentrifuge kort ved 1300g i 5 minutter i en svingende bøtterotor utstyrt med plateholder.Kontroller under mikroskopet at det ikke er bobler i mikrowells. Forbered mediet B.Fjern mediet fra Petri-parabolen. For celleavløsning, behandle cellene med 1,5 milliliter EDTA-løsning fremstilt på PBS.Kontroller celleavløsning under mikroskopet. Høst cellen i 15 milliliterrør. Tilsett 5 milliliter blandet Dulbecco og Fisher medium i røret mot cellene.Sentrifuge på 200g i 5 minutter. Fjern supernatant og re-suspendere celler i 2 milliliter medium B.Transfer cellene suspensjon som inneholder 1 milliard celler i hver brønn av en 24-brønns plate med mikrowells. Rør forsiktig celler opp til og ned flere ganger og sentrifuger kort 100g i 1 minutt for å fange celle i mikrowells.Kontroller under mikroskopet at cellen er jevnt fordelt i mikrowells. Inkuber platen over natten for celleaggregering i sfæroider. Neste morgen, dag 15, sjekk under mikroskopene kvaliteten på sfæroider, som er gjennomsiktige og glatte hvis de er sunne.Samle forsiktig sfæroidene fra hver brønn inn i et 15 milliliterrør, la sfæroidene utfelle med tyngdekraften i 2 og 3 minutter, og fjern deretter supernatanten. Legg til sfæroidene 2 milliliter av matrisen, tint og eks tempore på is. Bland forsiktig ved pipettering og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.For å vaske overflødig av matrisen, legg til røret 8 milliliter middels B.Pipette forsiktig, og sentrifuger deretter røret i 1 minutter ved 100g. Fjern supernatanten. Legg til røret 20 milliliter middels B, pipette forsiktig, og del deretter sfæroidfjæringen mellom mini bioreaktorer.Plasser deretter minibioreaktorer i en 15 centimeter Petri-tallerken, som forhindrer fordampning av vann og forurensning. Sett Petri-parabolen med mini bioreaktorer på en orbital shaker. Dyrk organoidene med rotasjonshastighet 70, 75rpm.På dag 16, forberede medium C.Transfer organoid i 50 milliliter rør. I 5 minutter, la dem falle til bunnen. Aspirer supernatanten og tilsett 5 milliliter av mediet C.Rejoin organoidene i minibioreaktorer.Dyrk sfæroider i middels C i 2 uker, forfriskende mediet hver annen dag. I løpet av disse 2 ukene velger du ca. 100 sfæroider per mini bioreaktorer for følgende dyrking. På dag 30, forberede medium D.Change dyrking middels til middels D, som er et modningsmedium.Oppdater dyrkingsmediet hver 2 eller 3 dager i 3 uker. Bruk deretter medium D oppløst i F og GDNF. Etter 1 måned med påfølgende dyrking i middels A og B oppnås organoider standardisert i størrelse og morfologi.Etter hvert som det vokser, må de bytte medium oftere, opptil 4 ganger i uken øker også. Etter 2 måneder med dyrking når de 4 og 5 millimeter i diameter. Og etter en annen måned stopper 5 og 6 millimeter og veksten.Figuren viser utseendet på organoid enzym, klare seksjoner malt med hematoksylin og eosin. Immunhiistokjemisk analyse i 1 måned viser tilstedeværelsen av SOX2 positive klynger av stamceller, inkludert inne i sentral del. I periferien av organoidene, glial fibrillary surt protein, mikrotubule-assosiert protein 2, og tiazine hydrolase positiv.Celler er konsentrert, noe som tilsvarer moden form for nevroner. I noen tilfeller dannes klynger av hvite på nekrotisk område i den sentrale delen. Dette indikerer begrensningen av denne protokollen for å skaffe større organoider.Mest sannsynlig er den begrensende vekstfaktoren spredningshastigheten for næringsstoffer og oksygen. De ulike mediene og celletypen av sfæroider og testing av systemet vårt for noen typer organoider. Mye hjerne og netthinne, kombinerte organoider fra leverkarsinomceller og mesenchymale stamceller, kombinerte organoider fra kapitalblåsing mesenchymale stammeanrop og hematopoietiske stamceller differensiering fra induserte pluripotente stamceller og tarmorganoider.Var det variabelt i den første sammensetningen av celler? Differensieringsfaktorer, kultur og middels, ekstracellulær matrise, og muligens også gassblandingssammensetningen, hastigheten på plattformrotasjonen og andre parametere. Det vil være mulig å oppnå organoid med samme form, størrelse eller morfologimodell i ulike organer og vev.Bruken av mini bioreaktorer foreslått i dette arbeidet.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generering av Induced Pluripotent stamceller fra Frozen Buffy Coats bruker Non-integrere episomal Plasmider

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generering av Induced Pluripotent stamceller fra menneske perifere T-celler Bruke Sendai Virus i Feeder-free betingelser

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Generering av indusert-pluripotente stamceller ved hjelp av fibroblast synoviocytter Isolert fra ledd av pasienter med revmatoid artritt

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generering av Induced Pluripotent stamceller fra humane melanom Tumor-infiltrerende lymfocytter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Induced pluripotent stamcelle Generation fra Blood Cells hjelp Sendai Virus og sentrifugering

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generasjon Integrerings--frie Utførte Pluripotent stamceller fra menneskelige perifere mononukleære blodceller Bruke episomale vektorer

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definert og Scalable Generation of hepatocytter lignende celler fra menneskelige Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Kondrogen pelletsdannelse fra Cord Blood-avledede Induced Pluripotent Stamceller

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon av standardiserte og reproduserbar Forebrain-type Cerebral Organoids fra menneske indusert Pluripotent stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon 3D huden Organoid fra ledningen blod-avledet indusert Pluripotent stamceller

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...