Name: brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors
Uploaded: 2021-12-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors at JoVE.com

Данная работа была поддержана грантом 075-15-2019-1669 Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (анализ ОТ-ПЦР) и грантом No 19-15-00425 Российского научного фонда (на все остальные работы). Авторы также благодарят Павла Беликова за помощь в монтаже видео. Рисунки в рукописи были созданы с BioRender.com.

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильный метод во всем протоколе, исключая этапы 1.2 и 1.3. Прогрейте все культуральные среды и растворы до 37 °C перед нанесением на клетки или органоиды. Культивируйте клетки в инкубатореCO2 при 37 °C при 5% CO2 при влажности 80%. Схема протокола показана <strong...

<ol>
	<li>Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+neurodegenerative+and+neurodevelopmental+diseases.">Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases.</a> Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).</li><li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+brain+Organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells:+promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders.">3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside+out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+regionally+specified+hPSC+derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration.">Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+region+specific+organoids+using+mini+bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure.">Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region+specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+hippocampal+neurons+from+self-organizing+human+embryonic+stem+cell+derived+dorsomedial+telencephalic+tissue.">Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue.</a> Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).</li><li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease.">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+platforms+for+drug+discovery.">Pluripotent stem cell platforms for drug discovery.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).</li><li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+depletes+neural+progenitors+in+human+cerebral+organoids+through+activation+of+the+innate+immune+receptor+TLR3.">Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).</li><li>Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+tissue-specific+SARS-CoV-2+infection+and+host+responses+using+human+stem+cell-derived+lung+and+cerebral+organoids.">Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).</li><li>Ao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-stop+microfluidic+assembly+of+human+brain+organoids+to+model+prenatal+cannabis+exposure.">One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure.</a> Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).</li><li>Di Nardo, P., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+standardization.">Stem cell standardization.</a> Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).</li><li>Jo, J., Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Matsui, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-month+cultured+cerebral+organoids+from+human+ES+cells+contain+matured+neural+cells.">Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells.</a> Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).</li><li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development.">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).</li><li>Eremeev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necessity+Is+the+mother+of+invention&#8221;+or+inexpensive,+reliable,+and+reproducible+protocol+for+generating+organoids.">Necessity Is the mother of invention&#8221; or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids.</a> Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region&#8211;specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region&#8211;specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).</li><li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+human+brain+organoids.">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li><li>Hall, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned,+organoid-based+cartilaginous+implants+exhibit+zone+specific+functionality+forming+osteochondral-like+tissues+in+vivo.">Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo.</a> Biomaterials. 273, 120820 (2021).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids&#8212;challenges+to+establish+a+brain+prototype.">Cerebral organoids&#8212;challenges to establish a brain prototype.</a> Cells. 10 (7), 1790 (2021).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+Cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).</li></ol>

Описанный протокол имеет два важных этапа, позволяющих генерацию высококачественных органоидов одинакового размера. Во-первых, органоиды растут из сфероидов, которые почти идентичны по количеству клеток и зрелости клеток. Во-вторых, самодельные биореакторы обеспечивают каждому орга?...

Модели, полученные из iPSC человека, широко используются в исследованиях нейроразвития и нейродегенеративных расстройств1. За последнее десятилетие 3D-модели мозговой ткани, так называемые органоиды мозга, существенно дополнили традиционные 2D-нейронные культуры2. Органоиды в некоторой степени повторяют 3D-архитектуру эмбрионального мозга и позволяют более точно моделировать. Опубликовано много протоколов для генерации органоидов, представляющих различные области мозга: кора головного мозга3,4,5,мозжечок6,средний мозг, передний мозг, гипоталамус7,8,9и гиппокамп10. Было несколько примеров использования органоидов для изучения заболеваний нервной системы человека11. Также органоиды были внедрены в лекарственные открытия12 и использованы в исследованиях инфекционных заболеваний, в том числе SARS-Cov-213,14.
Органоиды головного мозга могут достигать до нескольких миллиметров в диаметре. Так, внутренняя зона органоида может страдать от гипоксии или неправильного питания и со временем становиться некротической. Поэтому многие протоколы включают специальные биореакторы8,шейкеры или микрофлюидные системы15. Эти устройства могут потребовать больших объемов дорогостоящих клеточных культур. Также стоимость такого оборудования обычно высока. Некоторые биореакторы состоят из множества механических частей, которые затрудняют их стерилизацию для повторного использования.
Большинство протоколов страдают от «пакетного эффекта»16,который порождает значительную вариабельность среди органоидов, полученных из идентичных ИПСК. Эта изменчивость препятствует тестированию лекарств или доклиническим исследованиям, требующим единообразия. Высокий выход органоидов, достаточный для выбора органоидов однородного размера, может частично решить эту проблему.
Фактор времени также является существенной проблемой. Matsui et al. (2018) показали, что органоидам мозга требуется не менее шести месяцев, чтобы достичь зрелости17. Trujillo et al. (2019) также продемонстрировали, что электрофизиологическая активность возникала у органоидов только после шести месяцев культивирования18. Из-за длительного времени созревания органоидов исследователи часто запускают новую дифференциацию до завершения предыдущей. Множественные параллельные процессы дифференциации требуют дополнительных затрат, оборудования и лабораторного пространства.
Недавно мы разработали мини-биореактор, который в основном решает проблемы, упомянутые выше19. Этот самодельный биореактор состоит из сверхнизкой адгезии или необработанная чашка Петри с пластиковой ручкой в центре. Эта пластиковая ручка предотвращает скопление органоидов и их смешение в центре чашки Петри, что вызвано вращением шейкер. В данной работе описано, как этот недорогой и простой самодельный мини-биореактор позволяет генерировать высококачественные органоиды мозга в больших количествах.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>DMEM/F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>34425</td>
			<td>24-well culture plate with microwells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuronal supplement B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Serum replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>85850</td>
			<td>Pliripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Antimicrobials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>540220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Y27632</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-538</td>
			<td>Y27632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Dorsomorphin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-466</td>
			<td>Dorsomorphin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS LDN-193189</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-540</td>
			<td>LDN-193189</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS SB431542</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-543</td>
			<td>SB431542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versen solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040066</td>
			<td>0.48 mM EDTA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors

Органоид мозга, полученный из iPSC, является перспективной технологией для моделирования in vitro патологий нервной системы и скрининга лекарств. Эта технология появилась недавно. Он все еще находится в зачаточном зачаточном начале и имеет некоторые ограничения, которые еще не решены. Существующие протоколы не позволяют получить органоиды, чтобы быть достаточно последовательными для открытия лекарств и доклинических исследований. Созревание органоидов может занять до года, подталкивая исследователей к запуску нескольких процессов дифференцировки одновременно. Это налагает дополнительные расходы на лабораторию с точки зрения площади и оборудования. Кроме того, органоиды головного мозга часто имеют некротическую зону в центре, которая страдает от дефицита питательных веществ и кислорода. Следовательно, большинство современных протоколов используют циркулирующую систему для культивирования среды для улучшения питания.
Между тем, не существует недорогих динамических систем или биореакторов для культивирования органоидов. В этой статье описывается протокол производства органоидов головного мозга в компактных и недорогих самодельных мини-биореакторах. Этот протокол позволяет получать высококачественные органоиды в больших количествах.

Схема протокола показана на рисунке 1. Протокол включал пять сред, в которых IPSCs дифференцировались на органоиды мозга в течение как минимум одного месяца. Дифференциация была начата, после чего ИПСК достигли 75-90% слияния(Рисунок 2А,В). Первые приз...

Watch this Scientific Journal Video about Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors at JoVE.com

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

Здесь мы описываем протокол генерации органоидов мозга из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs). Для получения органоидов головного мозга в больших количествах и высокого качества мы используем самодельные мини-биореакторы.

Генерация органоидов мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в самодельных мини-биореакторах

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

На сегодняшний день церебральные органоиды, дифференцированные от плюрипотентных стволовых клеток, представляет собой 3D-модель vitro, наиболее близкую к нативной ткани мозга человека. Дополнительно церебральные органоиды одинаково подходят для моделирования различных патологий центральной нервной системы, тестирования фармакологически активных веществ, а также для применения в регенеративной медицине. Между тем, эта технология все еще находится на начальной стадии развития.Протокол можно разделить на две группы в зависимости от способа получения агрегатов и дальнейшего культивирования с дифференцировкой. Первый включает протокол и схемы дифференцировки, различные по времени культивирования и дифференцировке индуляторы с последующим созреванием органоида в шейкере в специальных устройствах с низкой адгезией, таких как рыночные трубки или пластины. Другая группа включает использование специальных биореакторов.Анализ различных протоколов показал, что органоиды следует культивировать в условиях с циркулирующей питательной средой. Однако отсутствие простых и недорогих систем получения органоида со стандартными размерами и морфологией требует разработки таких устройств для масштабирования процесса. В данной работе мы описываем наш метод получения и тестирования простых и недорогих мини-биореакторов, которые позволяют получать большие количества высококачественных органоидов.Нарежьте стерильные 15-миллилитров центрифужные трубки на кольца высотой 7 или 8 миллиметров. Автоклав колец. Разбейте низкоагрегации на обработанных или микробиологических чашках Петри на крошки.Растворите около 1 грамма пластиковой крошки в 10 миллилитрах хлороформа на ночь, чтобы приготовить жидкий пластик. Сделайте пластиковую ручку в центре стерильной сверхнизкой адгезии 6 сантиметров чашки Петри. Есть два одинаково подходящих способа.Первый, поместите автоклав в пластиковое кольцо по центру и нанесите полмиллилитров жидкого пластика на внутреннюю часть кольца. Второй, без каких-либо пластиковых колец, опускает полмиллилитров жидкого пластика на центр чашки Петри. Оставьте посуду открытой на 2 или 3 часа в ламинарной вытяжке до полного высыхания.Культивируют индуцированные плюрипотентные стволовые клетки в среде для плюрипотентных стволовых клеток, до 75 или 90% слияния в 35-миллиметровых чашках Петри, предварительно покрытых матрицей, растворенной в холодной среде Dulbecco Modified Eagle Medium и среде Fisher-12. Подготовьте среду А плюс замену сыворотки. Культивируют индуцированные плюрипотентные стволовые клетки в течение 1 дня в среде с заменой сыворотки.Замена среды для плюрипотентных стволовых клеток на среду замещения сыворотки в нулевой день дифференцировки. Приготовить среду А.Измените среду на среду А на 2 день дифференцировки. Культивируют клетки в среде А в течение 2 недель, освежая среду в чашках Петри каждые 2 дня.На 14-й день начинают формирование сфероида с помощью специальной 24-скважинной культуральной пластины, которая содержит примерно 1 200 микроядер в каждой скважине. Подготовьте 24-скважинную культурную пластину с микроукладками. Добавьте к каждой лунке 1 миллилитр среды А, центрифугу ненадолго по 1, 300 г в течение 5 минут в ротор с качающимся ковшом, оснащенным держателем пластины.Контролируйте под микроскопом, чтобы в микровеллах не было пузырьков. Приготовьте среду B.Выньте среду из чашки Петри. Для отслоения клеток обработают клетки 1,5 миллилитрами раствора ЭДТА, приготовленным на PBS.Контролируйте отсоединение клеток под микроскопом. Соберите клетку в 15-миллилитровую трубку. Добавьте 5 миллилитров, смешанных дульбекко и среды Фишера в трубку по направлению к клеткам.Центрифуга по 200г в течение 5 минут. Удаляют супернатант и повторно суспендированы клетки в 2 миллилитра среды В. Перенесите суспензию клеток, содержащую 1 миллиард клеток, в каждую лунку из 24-луночной пластины с микроэлементами. Осторожно пипетку клеток вверх и вниз несколько раз и центрифуг ненадолго 100 г в течение 1 минуты, чтобы захватить ячейку в микроэлементах.Контролируйте под микроскопом, чтобы клетки равномерно распределялись в микроэлементах. Инкубировать пластину на ночь для агрегации клеток в сфероидах. На следующее утро, на 15-й день, проверьте под микроскопами качество сфероидов, которые прозрачны и гладки, если здоровы.Осторожно соберите сфероиды из каждой лунки в 15-миллилитровую трубку, оставьте сфероиды выпадать в осадок под действием силы тяжести в течение 2 и 3 минут, а затем удалите супернатант. Добавьте к сфероидам 2 миллилитра матрицы, размороженных и временных на льду. Аккуратно перемешайте путем пипетки и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.Для промывания излишков матрицы добавляют в трубку 8 миллилитров среды B.Pipette аккуратно, затем центрифугируют трубку в течение 1 минуты по 100г. Удалите супернатант. Добавьте в трубку 20 миллилитров среды В, аккуратно пипетку, затем разделите сфероидную суспензию между мини-биореакторами.Затем поместите мини-биореакторы в 15-сантиметровую чашку Петри, которая предотвращает испарение воды и загрязнение. Поместите чашку Петри с мини-биореакторами на орбитальный шейкер. Культивируют органоиды со скоростью вращения 70, 75 об/мин.На 16 день готовят среду С. Перенесите органоид в 50-миллилитровый тюбик. В течение 5 минут дайте им упасть на дно. Аспирировать супернатант и добавить 5 миллилитров среды C.Воссоединить органоиды в мини-биореакторах.Культивируют сфероиды в среде С в течение 2 недель, освежая среду каждые 2 дня. В течение этих 2 недель выберите около 100 сфероидов на мини-биореактор для последующего культивирования. На 30 день готовят среду D.Измените культивационную среду на среднюю D, которая является средой созревания.Обновляйте культивную среду каждые 2 или 3 дня в течение 3 недель. Затем используйте среду D, растворенный в F и GDNF. После 1 месяца последовательного культивирования в среде А и В получают органоиды, стандартизированные по размеру и морфологии.По мере роста им нужно чаще менять среду, до 4 раз в неделю также увеличивается. После 2 месяцев выращивания они достигают 4 и 5 миллиметров в диаметре. А еще через месяц, 5 и 6 миллиметров и рост прекращается.На рисунке показано появление органоидного фермента, четкие срезы, окрашенные гематоксилином и эозином. Иммуногистохимический анализ за 1 месяц показывает наличие у SOX2 положительных кластеров клеток-прародителя, в том числе внутри центральной части. В периферических органоидах глиальный фибриллярный кислый белок, микротрубоче-ассоциированный белок 2 и тиазингидролаза положительные.Клетки концентрированные, что соответствует зрелой форме нейронов. В некоторых случаях в центральной части образуются скопления белых на некротической области. Это указывает на ограничение данного протокола для получения более крупных органоидов.Скорее всего, ограничивающим фактором роста является скорость диффузии питательных веществ и кислорода. Различные среды и клеточные типы сфероидов и тестирование нашей системы на некоторые виды органоидов. Много мозга и сетчатки, комбинированные органоиды из клеток карциномы печени и мезенхимальных стволовых клеток, комбинированные органоиды из капитальных бластных мезенхимальных стволовых вызовов и дифференцировка гемопоэтических стволовых клеток из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и органоидов кишечника.Был ли он переменным в первоначальном составе клеток? Факторы дифференциации, культуры и среды, внеклеточного матрикса, а возможно также состав газовой смеси, скорость вращения платформы и другие параметры. Можно будет получить органоид с одинаковой формой, размером или морфологической моделью в различных органах и тканях.Использование мини-биореакторов предложено в этой работе.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из замороженных Баффи пальто с помощью неинтегрирующих Эписомные плазмиды

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из человеческой периферической Т-клеток с использованием вируса Сендай в фидерной бесплатно условиях

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Генерация Индуцированные-плюрипотентных стволовых клеток с использованием фибробластоподобных синовиоциты Выделен из суставов больных ревматоидным артритом

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки от меланомы человека Опухоль-инфильтрации лимфоцитами

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Индуцированные плюрипотентные поколение стволовых клеток из клеток крови с помощью вируса Сендай и центрифугирование

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Генерация интеграции свободных индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из человеческих мононуклеарных клеток периферической крови с помощью эписомальные векторы

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Определено и масштабируемая Генерация гепатоцитов-подобных клеток из человеческих плюрипотентные стволовые клетки

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Хондрогенное образование гранул из индуцированных пуповинной клеткой флуоресцентных стволовых клеток

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Поколение стандартизированных и воспроизводимые переднего мозга тип мозгового Organoids от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Поколение 3D кожи органоид из пуповинной крови производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...