Name: brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors
Uploaded: 2021-12-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la subvención 075-15-2019-1669 del Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación de Rusia (análisis RT-PCR) y por la subvención No. 19-15-00425 de la Fundación Rusa de Ciencia (para todos los demás trabajos). Los autores también agradecen a Pavel Belikov por su ayuda con la edición de video. Las figuras en el manuscrito fueron creadas con BioRender.com.

NOTA: Utilice la técnica estéril en todo el protocolo, excluyendo los pasos 1.2 y 1.3. Calentar todos los medios de cultivo y soluciones a 37 °C antes de aplicar sobre células u organoides. Cultive células en una incubadora de CO2 a 37 °C en 5% de CO2 sobre 80% de humedad. El esquema de protocolo se muestra en la Figura 1.
1. Transformación de placas de Petri en mini biorreactores
<ol><li>Cortar tubos centrífugos es...

<ol>
	<li>Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+neurodegenerative+and+neurodevelopmental+diseases.">Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases.</a> Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).</li><li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+brain+Organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells:+promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders.">3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside+out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+regionally+specified+hPSC+derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration.">Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+region+specific+organoids+using+mini+bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure.">Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region+specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+hippocampal+neurons+from+self-organizing+human+embryonic+stem+cell+derived+dorsomedial+telencephalic+tissue.">Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue.</a> Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).</li><li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease.">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+platforms+for+drug+discovery.">Pluripotent stem cell platforms for drug discovery.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).</li><li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+depletes+neural+progenitors+in+human+cerebral+organoids+through+activation+of+the+innate+immune+receptor+TLR3.">Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).</li><li>Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+tissue-specific+SARS-CoV-2+infection+and+host+responses+using+human+stem+cell-derived+lung+and+cerebral+organoids.">Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).</li><li>Ao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-stop+microfluidic+assembly+of+human+brain+organoids+to+model+prenatal+cannabis+exposure.">One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure.</a> Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).</li><li>Di Nardo, P., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+standardization.">Stem cell standardization.</a> Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).</li><li>Jo, J., Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Matsui, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-month+cultured+cerebral+organoids+from+human+ES+cells+contain+matured+neural+cells.">Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells.</a> Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).</li><li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development.">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).</li><li>Eremeev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necessity+Is+the+mother+of+invention&#8221;+or+inexpensive,+reliable,+and+reproducible+protocol+for+generating+organoids.">Necessity Is the mother of invention&#8221; or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids.</a> Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region&#8211;specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region&#8211;specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).</li><li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+human+brain+organoids.">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li><li>Hall, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned,+organoid-based+cartilaginous+implants+exhibit+zone+specific+functionality+forming+osteochondral-like+tissues+in+vivo.">Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo.</a> Biomaterials. 273, 120820 (2021).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids&#8212;challenges+to+establish+a+brain+prototype.">Cerebral organoids&#8212;challenges to establish a brain prototype.</a> Cells. 10 (7), 1790 (2021).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+Cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).</li></ol>

El protocolo descrito tiene dos pasos cruciales que permiten la generación de organoides de alta calidad de tamaño uniforme. Primero, los organoides crecen a partir de esferoides que son casi idénticos en número de células y madurez celular. En segundo lugar, los biorreactores caseros proporcionan a cada organoide un entorno uniforme, donde los organoides no se amontonan ni se pegan.
La calidad celular y el estado de maduración celular son esenciales para realizar el protocolo. Es fundam...

Los modelos derivados de iPSC humanos son ampliamente utilizados en los estudios de trastornos del neurodesarrollo y neurodegenerativos1. Durante la última década, los modelos de tejido cerebral en 3D, los llamados organoides cerebrales, complementaron esencialmente los cultivos neuronales 2D tradicionales2. Los organoides recapitulan en cierta medida la arquitectura 3D del cerebro embrionario y permiten un modelado más preciso. Se publican muchos protocolos para la generación de organoides que representan diferentes regiones cerebrales: corteza cerebral3,4,5,cerebelo6,mesencéfalo, prosencéfalo, hipotálamo7,8,9e hipocampo10. Ha habido múltiples ejemplos de uso de organoides para estudiar enfermedades del sistema nervioso humano11. Además, los organoides se implementaron en descubrimientos de fármacos12 y se utilizaron en estudios de enfermedades infecciosas, incluido el SARS-Cov-213,14.
Los organoides cerebrales pueden alcanzar hasta varios milímetros de diámetro. Por lo tanto, la zona interna del organoide puede sufrir de hipoxia o desnutrición y eventualmente volverse necrótica. Por lo tanto, muchos protocolos incluyen biorreactores especiales8,agitadores o sistemas microfluídicos15. Estos dispositivos pueden requerir grandes volúmenes de costosos medios de cultivo celular. Además, el costo de dicho equipo suele ser alto. Algunos biorreactores consisten en muchas partes mecánicas que los hacen difíciles de esterilizar para su reutilización.
La mayoría de los protocolos sufren el "efecto lote"16,que genera una variabilidad significativa entre los organoides obtenidos de las iPSC idénticas. Esta variabilidad dificulta las pruebas de drogas o los estudios preclínicos que requieren uniformidad. El alto rendimiento de organoides suficiente para seleccionar organoides de tamaño uniforme puede resolver parcialmente este problema.
El factor tiempo también es un problema importante. Matsui et al. (2018) demostraron que los organoides cerebrales requieren al menos seis meses para alcanzar la madurez17. Trujillo et al. (2019) también demostraron que la actividad electrofisiológica ocurrió en organoides solo después de seis meses de cultivo18. Debido al largo tiempo de maduración de los organoides, los investigadores a menudo lanzan una nueva diferenciación antes de completar la anterior. Múltiples procesos paralelos de diferenciación requieren gastos adicionales, equipos y espacio de laboratorio.
Recientemente hemos desarrollado un mini biorreactor que resuelve principalmente los problemas mencionados anteriormente19. Este biorreactor casero consiste en una placa de Petri de adhesión ultra baja o sin tratar con una perilla de plástico en el centro. Esta perilla de plástico evita el apiñamiento de organoides y su conglutinación en el centro de la placa de Petri, que es causada por la rotación del agitador. Este artículo describe cómo este mini biorreactor casero económico y simple permite generar organoides cerebrales de alta calidad en grandes cantidades.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>DMEM/F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>34425</td>
			<td>24-well culture plate with microwells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuronal supplement B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Serum replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>85850</td>
			<td>Pliripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Antimicrobials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>540220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Y27632</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-538</td>
			<td>Y27632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Dorsomorphin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-466</td>
			<td>Dorsomorphin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS LDN-193189</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-540</td>
			<td>LDN-193189</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS SB431542</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-543</td>
			<td>SB431542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versen solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040066</td>
			<td>0.48 mM EDTA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors

El organoide cerebral derivado de iPSC es una tecnología prometedora para el modelado in vitro de las patologías del sistema nervioso y el cribado de fármacos. Esta tecnología ha surgido recientemente. Todavía está en su infancia y tiene algunas limitaciones aún sin resolver. Los protocolos actuales no permiten que la obtención de organoides sea lo suficientemente consistente para el descubrimiento de fármacos y estudios preclínicos. La maduración de los organoides puede tardar hasta un año, lo que empuja a los investigadores a lanzar múltiples procesos de diferenciación simultáneamente. Impone costos adicionales para el laboratorio en términos de espacio y equipo. Además, los organoides cerebrales a menudo tienen una zona necrótica en el centro, que sufre de deficiencia de nutrientes y oxígeno. Por lo tanto, la mayoría de los protocolos actuales utilizan un sistema circulante para el medio de cultivo para mejorar la nutrición.
Mientras tanto, no hay sistemas dinámicos baratos o biorreactores para el cultivo de organoides. Este artículo describe un protocolo para producir organoides cerebrales en mini biorreactores caseros compactos y económicos. Este protocolo permite obtener organoides de alta calidad en grandes cantidades.

El esquema de protocolo se muestra en la Figura 1. El protocolo incluyó cinco medios en los que las iPSC se diferenciaron en organoides cerebrales durante al menos un mes. La diferenciación se inició entonces las iPSC alcanzaron la confluencia del 75-90%(Figura 2A,B). Los primeros signos de diferenciación hacia las neuronas se observaron en los días 10-11 de cultivo de iPSC en el medio A cuando las células comenzaron a agruparse en "roseta...

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Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

Aquí describimos un protocolo para generar organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC). Para obtener organoides cerebrales en grandes cantidades y de alta calidad, utilizamos mini biorreactores caseros.

Generación de organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas en mini biorreactores caseros

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

Hasta la fecha, los organoides cerebrales diferenciados de las células madre pluripotentes es un modelo 3D vitro más cercano al tejido cerebral humano nativo. Además, los organoides cerebrales son igualmente adecuados para modelar diversas patologías del sistema nervioso central, probar sustancias farmacológicamente activas y también para su uso en medicina regenerativa. Mientras tanto, esta tecnología aún se encuentra en la etapa inicial de desarrollo.El protocolo se puede dividir en dos grupos dependiendo del método de obtención de agregados y el cultivo posterior con diferenciación. El primero incluye protocolo y esquemas de diferenciación, diferentes en el tiempo de cultivo e inductores de diferenciación con posterior maduración de organoides en el agitador en dispositivos especiales de baja adherencia como tubos o placas de mercado. Otro grupo incluye el uso de biorreactores especiales.El análisis de varios protocolos ha demostrado que los organoides deben cultivarse en condiciones con medio nutriente circulante. Sin embargo, la ausencia de sistemas simples y económicos para obtener organoides con un tamaño y morfología estándar requiere el desarrollo de tales dispositivos para escalar el proceso. En este trabajo, describimos nuestro método para obtener y probar mini biorreactores simples y económicos que permiten obtener grandes cantidades de organoides de alta calidad.Cortar los tubos de centrífuga estériles de 15 mililitros en los anillos, de 7 u 8 milímetros de altura. Autoclave los anillos. Divida en migas las bajas agregaciones en placas de Petri tratadas o microbiológicas.Disuelva aproximadamente 1 gramo de migas de plástico en 10 mililitros de cloroformo durante la noche para preparar un plástico líquido. Haga una perilla de plástico en el centro de una placa de Petri estéril de ultra baja adherencia de 6 centímetros. Hay dos formas igualmente adecuadas.El primero, coloque el autoclave en un anillo de plástico en un centro y aplique medio mililitro de plástico líquido en el interior del anillo. El segundo, sin anillos de plástico, deja caer medio mililitro de plástico líquido en el centro de la placa de Petri. Deje los platos abiertos durante 2 o 3 horas en una campana de flujo laminar hasta que se seque por completo.Cultivar células madre pluripotentes inducidas en el medio para células madre pluripotentes, hasta un 75 o 90% de confluencia en las placas de Petri de 35 milímetros, pre-recubiertas con una matriz disuelta en Dulbecco Modified Eagle Medium frío, y medio Fisher-12. Prepare el reemplazo de suero medio A plus. Cultivar células madre pluripotentes inducidas durante 1 día en el medio con reemplazo sérico.Cambie el medio para las células madre pluripotentes a un medio de reemplazo sérico en el día cero de la diferenciación. Preparar medio A.Cambiar el medio a medio A en el día 2 de diferenciación. Cultivar células en medio A durante 2 semanas, medio refrescante en placas de Petri cada 2 días.En el día 14, comience la formación de esferoides utilizando una placa de cultivo especial de 24 pozos que contiene aproximadamente 1, 200 microagres en cada pozo. Prepare una placa de cultivo de 24 pozos con microagres. Agregue a cada pozo 1 mililitro de A medio, centrífuga brevemente a 1, 300 g durante 5 minutos en un rotor de cucharón oscilante equipado con soporte de placa.Controle bajo el microscopio que no hay burbujas en los microbuzos. Prepare el medio B.Retire el medio de la placa de Petri. Para el desprendimiento celular, trate las células con una solución de EDTA de 1,5 mililitros preparada en PBS.Controlar el desprendimiento celular bajo el microscopio. Cosecha la célula en un tubo de 15 mililitros. Agregue 5 mililitros mezclados de Dulbecco y medio Fisher en el tubo hacia las células.Centrifugar a 200g durante 5 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 2 mililitros de medio B.Transfiera la suspensión de células que contiene 1.000 millones de células a cada pozo de una placa de 24 pozos con micropios. Pipete suavemente las células hacia arriba y hacia abajo varias veces y centrífuga brevemente 100 g durante 1 minuto para capturar la célula en micropisos.Controlar bajo el microscopio que las células están distribuidas uniformemente en microburos. Incubar la placa durante la noche para la agregación celular en esferoides. A la mañana siguiente, día 15, verifique bajo los microscopios la calidad de los esferoides, que son transparentes y suaves si están sanos.Recoja cuidadosamente los esferoides de cada pozo en un tubo de 15 mililitros, deje que los esferoides se precipiten por gravedad durante 2 y 3 minutos, y luego retire el sobrenadante. Añadir a los esferoides 2 mililitros de la matriz, descongelados y ex tempore sobre hielo. Mezclar suavemente mediante pipeteo e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.Para lavar el exceso de la matriz, agregue al tubo 8 mililitros de B.Pipette medio suavemente, luego centrífique el tubo durante 1 minuto a 100 g. Retire el sobrenadante. Agregue al tubo 20 mililitros de medio B, pipete suavemente, luego divida la suspensión esferoide entre mini biorreactores.Luego coloque los mini biorreactores en una placa de Petri de 15 centímetros, que evita la evaporación del agua y la contaminación. Coloque la placa de Petri con mini biorreactores en un agitador orbital. Cultive los organoides a una velocidad de rotación de 70, 75 rpm.El día 16, prepare el C mediano C.Transfiera el organoide en un tubo de 50 mililitros. Durante 5 minutos, déjalos caer al fondo. Aspirar el sobrenadante y añadir 5 mililitros del medio C.Volver a unir los organoides en los mini biorreactores.Cultiva los esferoides en C medio durante 2 semanas, refrescando el medio cada 2 días. Durante estas 2 semanas, seleccione alrededor de 100 esferoides por mini biorreactores para el siguiente cultivo. El día 30, prepare el medio D.Cambie el medio de cultivo al medio D, que es un medio de maduración.Refrescar el medio de cultivo cada 2 o 3 días durante 3 semanas. Luego use el medio D disuelto en F y GDNF. Después de 1 mes de cultivo consecutivo en medio A y B, se obtienen organoides estandarizados en tamaño y morfología.A medida que crece, necesitan cambiar el medio con más frecuencia, hasta 4 veces a la semana también aumenta. Después de 2 meses de cultivo, alcanzan los 4 y 5 milímetros de diámetro. Y después de otro mes, 5 y 6 milímetros y el crecimiento se detiene.La figura muestra la apariencia de la enzima organoide, secciones claras pintadas con hematoxilina y eosina. El análisis inmunohistoquímico durante 1 mes muestra la presencia de grupos SOX2 positivos de células progenitoras, incluso dentro de la parte central. En el periférico de los organoides, la proteína ácida fibrilar glial, la proteína 2 asociada a microtúbulos y la tiazina hidrolasa positiva.Las células están concentradas, lo que corresponde a la forma madura de las neuronas. En algunos casos, se forman grupos de blancos en el área necrótica en la parte central. Esto indica la limitación de este protocolo para la obtención de organoides más grandes.Lo más probable es que el factor limitante del crecimiento sea la tasa de difusión de nutrientes y oxígeno. Los diversos medios y tipos celulares de esferoides y probar nuestro sistema para algunos tipos de organoides. Mucho cerebro y retina, organoides combinados de células de carcinoma hepático y células madre mesenquimales, organoides combinados de llamadas madre mesenquimales de explosión capital y la diferenciación de células madre hematopoyéticas de células madre pluripotentes inducidas y organoides intestinales.¿Fue variable en la composición inicial de las células? Factores de diferenciación, cultivo y medio, matriz extracelular, y posiblemente también la composición de la mezcla de gases, la velocidad de rotación de la plataforma y otros parámetros. Será posible obtener organoides con la misma forma, tamaño o modelo de morfología en varios órganos y tejidos.El uso de mini biorreactores propuestos en este trabajo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Investigación

Biología del Desarrollo

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