Name: brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors
Uploaded: 2021-12-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors at JoVE.com

Detta arbete stöddes av anslag 075-15-2019-1669 från Ryska federationens ministerium (RT-PCR-analys) och genom bidrag nr 19-15-00425 från Ryska vetenskapsstiftelsen (för allt annat arbete). Författarna tackar också Pavel Belikov för hans hjälp med videoredigeringen. Figurer i manuskriptet skapades med BioRender.com.

OBS: Använd steril teknik i hela protokollet, med undantag av steg 1.2 och 1.3. Värm alla kulturmedier och lösningar till 37 °C innan du applicerar på celler eller organoider. Odla celler i en CO2-inkubator vid 37 °C i 5% CO2 på 80% fuktighet. Protokollschemat visas i figur 1.
1. Omvandla Petri-rätter till minibioreaktorer
<ol><li>Skär sterila 15 ml centrifugrör i ringar av 7-8 mm i höjd; autoklav ringarna.</li>
...

<ol>
	<li>Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+neurodegenerative+and+neurodevelopmental+diseases.">Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases.</a> Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).</li><li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+brain+Organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells:+promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders.">3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside+out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+regionally+specified+hPSC+derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration.">Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+region+specific+organoids+using+mini+bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure.">Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region+specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+hippocampal+neurons+from+self-organizing+human+embryonic+stem+cell+derived+dorsomedial+telencephalic+tissue.">Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue.</a> Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).</li><li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease.">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).</li><li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+platforms+for+drug+discovery.">Pluripotent stem cell platforms for drug discovery.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).</li><li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+depletes+neural+progenitors+in+human+cerebral+organoids+through+activation+of+the+innate+immune+receptor+TLR3.">Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).</li><li>Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+tissue-specific+SARS-CoV-2+infection+and+host+responses+using+human+stem+cell-derived+lung+and+cerebral+organoids.">Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).</li><li>Ao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-stop+microfluidic+assembly+of+human+brain+organoids+to+model+prenatal+cannabis+exposure.">One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure.</a> Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).</li><li>Di Nardo, P., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+standardization.">Stem cell standardization.</a> Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).</li><li>Jo, J., Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons.">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Matsui, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-month+cultured+cerebral+organoids+from+human+ES+cells+contain+matured+neural+cells.">Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells.</a> Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).</li><li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development.">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).</li><li>Eremeev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necessity+Is+the+mother+of+invention&#8221;+or+inexpensive,+reliable,+and+reproducible+protocol+for+generating+organoids.">Necessity Is the mother of invention&#8221; or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids.</a> Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region&#8211;specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region&#8211;specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).</li><li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+human+brain+organoids.">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li><li>Hall, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned,+organoid-based+cartilaginous+implants+exhibit+zone+specific+functionality+forming+osteochondral-like+tissues+in+vivo.">Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo.</a> Biomaterials. 273, 120820 (2021).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).</li><li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids&#8212;challenges+to+establish+a+brain+prototype.">Cerebral organoids&#8212;challenges to establish a brain prototype.</a> Cells. 10 (7), 1790 (2021).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+Cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).</li></ol>

Det beskrivna protokollet har två avgörande steg som gör det möjligt att generering av högkvalitativa organoider av enhetlig storlek. För det första växer organoiderna från sfäroider som är nästan identiska i cellnummer och cellmognad. För det andra ger de hemgjorda bioreaktorerna varje organoid en enhetlig miljö, där organoider inte trängs eller håller ihop.
Cellkvaliteten och tillståndet för cellmognad är avgörande för att utföra protokollet. Det är viktigt att starta...

Mänskliga iPSC-härledda modeller används ofta i studierna av neurodevelopmental och neurodegenerativa sjukdomar1. Under det senaste decenniet kompletterade 3D-hjärnvävnadsmodeller, så kallade hjärnorganoider, i huvudsak traditionella 2D-neuronala kulturer2. Organoiderna rekapitulerar i viss utsträckning den embryonala hjärnans 3D-arkitektur och tillåter mer exakt modellering. Många protokoll publiceras för generering av organoider som representerar olika hjärnregioner: hjärnbarken3,4,5, lillhjärnan6, midbrain, forebrain, hypotalamus7,8,9och hippocampus10. Det har funnits flera exempel på att använda organoider för att studera sjukdomar i nervsystemet11. Organoiderna genomfördes också i läkemedelsupptäckter12 och användes i studier av infektionssjukdomar, inklusive SARS-Cov-213,14.
Hjärnans organoider kan nå upp till flera millimeter i diameter. Så kan den inre zonen av organoiden drabbas av hypoxi eller undernäring och så småningom bli nekrotisk. Därför innehåller många protokoll speciella bioreaktorer8,shakers eller mikrofluidiska system15. Dessa enheter kan kräva stora volymer dyra cellkulturmedier. Kostnaden för sådan utrustning är också vanligtvis hög. Vissa bioreaktorer består av många mekaniska delar som gör dem svåra att sterilisera för återanvändning.
De flesta protokoll lider av "batcheffekten"16, vilket genererar betydande variabilitet bland organoider som erhållits från identiska iPSCs. Denna variabilitet hindrar drogtester eller prekliniska studier som kräver enhetlighet. Det höga utbytet av organoider tillräckligt för att välja organoider av enhetlig storlek kan delvis lösa detta problem.
Tidsfaktorn är också ett betydande problem. (2018) visade att hjärnorganoider kräver minst sex månader för att nå mognad17. (2019) visade också att elektrofysiologisk aktivitet inträffade i organoider först efter sex månaders odling18. På grund av den långa orgeloidmagnadstiden lanserar forskarna ofta ny differentiering innan de slutför den tidigare. Flera parallella differentieringsprocesser kräver extra kostnader, utrustning och laboratorieutrymme.
Vi har nyligen utvecklat en mini bioreaktor som främst löser de problem som nämns ovan19. Denna hemgjorda bioreaktor består av en ultralåg vidhäftning eller obehandlad Petri-maträtt med en plastknopp i mitten. Denna plastknopp förhindrar trängsel av organoider och deras konglutination i mitten av Petri-skålen, vilket orsakas av skakapparatens rotation. Detta dokument beskriver hur denna billiga och enkla hemgjorda mini bioreaktor gör det möjligt att generera högkvalitativa hjärnorganoider i stora mängder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>DMEM/F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell400</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>34425</td>
			<td>24-well culture plate with microwells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuronal supplement B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Serum replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc</td>
			<td>85850</td>
			<td>Pliripotent stem cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-mpt-1</td>
			<td>Antimicrobials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>540220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Y27632</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-538</td>
			<td>Y27632</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS Dorsomorphin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-466</td>
			<td>Dorsomorphin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS LDN-193189</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-540</td>
			<td>LDN-193189</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemMACS SB431542</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-106-543</td>
			<td>SB431542</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versen solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040066</td>
			<td>0.48 mM EDTA in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in home-made mini bioreactors

Den iPSC-härledda hjärnan organoid är en lovande teknik för in vitro modellering patologier i nervsystemet och drog screening. Denna teknik har dykt upp nyligen. Det är fortfarande i sin linda och har vissa begränsningar olösta ännu. De nuvarande protokollen tillåter inte att erhålla organoider är tillräckligt konsekventa för läkemedelsupptäckt och prekliniska studier. Mognaden av organoider kan ta upp till ett år, vilket driver forskarna att starta flera differentieringsprocesser samtidigt. Det medför extra kostnader för laboratoriet i form av utrymme och utrustning. Dessutom har hjärnorganoider ofta en nekrotisk zon i mitten, som lider av närings- och syrebrist. Därför använder de flesta nuvarande protokoll ett cirkulerande system för odlingsmedium för att förbättra näring.
Under tiden finns det inga billiga dynamiska system eller bioreaktorer för organoid odling. Detta dokument beskriver ett protokoll för att producera hjärnan organoider i kompakta och billiga hemgjorda mini bioreaktorer. Detta protokoll gör det möjligt att erhålla högkvalitativa organoider i stora mängder.

Protokollschemat visas i figur 1. Protokollet inkluderade fem medier där iPSCs differentierades till hjärnan organoider under minst en månad. Differentieringen inleddes sedan iPSCs nådde 75-90% sammanflödet (figur 2A, B). De första tecknen på differentiering mot nervceller observerades på dag 10-11 av iPSC-odling i medium A när cellerna började samlas i "rosetter" (figur 2C). Vid dag 14-15 differentierade ...

Watch this Scientific Journal Video about Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors at JoVE.com

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

Här beskriver vi ett protokoll för att generera hjärnan organoider från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). För att få hjärnorganoider i stora mängder och av hög kvalitet använder vi hemgjorda minibioreaktorer.

Brain Organoid Generation från inducerade pluripotenta stamceller i hemgjorda minibioreaktorer

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

Hittills är cerebrala organoider differentierade från pluripotenta stamceller en vitro 3D-modell närmast den inhemska mänskliga hjärnvävnaden. Dessutom är cerebrala organoider lika lämpliga för modellering av olika patologier i centrala nervsystemet, testning av farmakologiskt aktiva substanser och även för användning i regenerativ medicin. Samtidigt befinner sig denna teknik fortfarande i inledningsskedet av utvecklingen.Protokollet kan delas in i två grupper beroende på metoden för att erhålla aggregat och den fortsatta odlingen med differentiering. Den första omfattar protokoll och differentieringssystem, olika i odlingstiden och differentieringsinducerare med efterföljande mognad av organoid i skakapparaten i speciella låg vidhäftningsanordningar som marknadsrör eller plattor. En annan grupp inkluderar att använda en speciell bioreaktor.Analys av olika protokoll har visat att organoider bör odlas under förhållanden med cirkulerande näringsmedium. Frånvaron av enkla och billiga system för att erhålla organoid med standardstorlek och morfologi kräver dock utveckling av sådana enheter för skalning av processen. I detta arbete beskriver vi vår metod för att erhålla och testa enkla och billiga minibioreaktorer som gör det möjligt att få stora mängder högkvalitativa organoider.Skär de sterila 15 ml centrifugrören i ringarna, 7 eller 8 millimeter i höjd. Autoklav ringarna. Bryt lågaggregeringar på behandlade eller mikrobiologiska Petri-rätter i smulor.Lös upp ca 1 gram plastsmulor i 10 milliliter kloroform över natten för att förbereda en flytande plast. Gör en plastknopp i mitten av en steril ultralåg vidhäftning 6 centimeter Petri-maträtt. Det finns två lika lämpliga sätt.Den första, sätt autoklaven i en plastring på ett centrum och applicera halv milliliter flytande plast på insidan av ringen. Den andra, utan några plastringar, släpper halv milliliter flytande plast på mitten av Petri-skålen. Låt disken vara öppen i 2 eller 3 timmar i en laminär flödeshuva tills den är helt torr.Odla inducerade pluripotenta stamceller i mediet för pluripotenta stamceller, upp till 75 eller 90% sammanflöde i 35 millimeter Petri-rätter, förbelagda med en matris upplöst i kallt Dulbecco Modified Eagle Medium och Fisher-12 medium. Förbered medium A plus serumersättning. Odla inducerade pluripotenta stamceller i 1 dag i mediet med serumersättning.Byt medium för pluripotenta stamceller till ett serumersättningsmedium på dagen noll av differentiering. Förbered medium A.Byt medel till medium A dag 2 av differentiering. Odla celler i medium A i 2 veckor, uppfriskande medium i Petri-rätter varannan dag.På dag 14, börja bildandet av sfäroid med en speciell 24-brunnskulturplatta som innehåller cirka 1 200 mikrobrunn i varje brunn. Förbered en 24-väl kulturplatta med mikrobrunn. Tillsätt 1 milliliter medium A i varje brunn, centrifugera en kort stund vid 1 300 g i 5 minuter i en svängskopator försedd med plåthållare.Kontrollera under mikroskopet att det inte finns några bubblor i mikrobrunn. Förbered mediet B.Ta bort mediet från Petriskålen. För cellavlossningen, behandla cellerna med 1,5 milliliter EDTA-lösning som bereds på PBS.Styr cellavlossningen under mikroskopet. Skörda cellen i 15 milliliterrör. Tillsätt 5 ml blandat Dulbecco och Fisher medium i röret mot cellerna.Centrifugera vid 200g i 5 minuter. Ta bort supernatanten och suspendera cellerna igen i 2 milliliter medium B.Överför cellernas suspension som innehåller 1 miljard celler i varje brunn på en 24-välplatta med mikrobrunn. Rör försiktigt cellerna upp till och ner flera gånger och centrifugera kort 100 g i 1 minut för att fånga cell i mikrobrunn.Kontroll under mikroskopet att cellen är jämnt fördelad i mikrobrunn. Inkubera plattan över natten för cellaggregering i sfäroider. Nästa morgon, dag 15, kontrollera under mikroskopen kvaliteten på sfäroider, som är transparenta och släta om de är friska.Samla försiktigt sfäroiderna från varje brunn i ett 15 milliliter rör, låt sfäroiderna fälla ut gravitationen i 2 och 3 minuter och ta sedan bort supernatanten. Lägg till 2 milliliter av matrisen, tinad och ex tempore på is. Blanda försiktigt genom pipettering och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter.För att tvätta överskottet av matrisen, lägg till 8 ml medium B.Pipette försiktigt i röret och centrifugera sedan röret i 1 minut vid 100 g. Ta bort supernatanten. Lägg till 20 ml medium B i röret, rör försiktigt och dela sedan upp sfäroidfjädringen mellan minibioreaktorer.Placera sedan minibioreaktorerna i en 15 centimeter Petriskål, vilket förhindrar avdunstning av vatten och förorening. Lägg Petri-skålen med minibioreaktorer på en orbital shaker. Odla organoiderna med rotationshastighet 70, 75rpm.På dag 16, förbered medium C.Överför organoid till 50 milliliter rör. I 5 minuter, låt dem falla till botten. Aspirera supernatanten och tillsätt 5 milliliter av mediet C.Rejoin organoiderna i mini bioreaktorer.Odla sfäroider i medium C i 2 veckor, uppdatera mediet varannan dag. Under dessa 2 veckor väljer du cirka 100 sfäroider per minibioreaktorer för följande odling. På dag 30, förbered medium D.Ändra odlingsmedium till medium D, vilket är ett mognadsmedium.Uppdatera odlingsmediet varannan eller var 3 dag i 3 veckor. Använd sedan mediet D upplöst i F och GDNF. Efter 1 månads på varandra följande odling i medium A och B erhålls organoider standardiserade i storlek och morfologi.När det växer måste de byta medium oftare, upp till 4 gånger i veckan ökar också. Efter 2 månaders odling når de 4 och 5 millimeter i diameter. Och efter ytterligare en månad, 5 och 6 millimeter och tillväxten slutar.Figuren visar utseendet på organoidenzym, tydliga sektioner målade med hematoxylin och eosin. Immunohistochemical analys för 1 månad visar förekomsten av SOX2 positiva kluster av stamceller, inklusive inuti centrala delen. I periferin av organoiderna, glia fibrillary surt protein, microtubule-associerade protein 2 och tiazin hydrolas positiva.Cellerna är koncentrerade, vilket motsvarar mogen form av nervceller. I vissa fall bildas kluster av vita på nekrotiska området i den centrala delen. Detta indikerar begränsningen av detta protokoll för att erhålla större organoider.Mest sannolikt är den begränsande tillväxtfaktorn diffusionshastigheten av näringsämnen och syre. De olika media och cell typ av sfäroider och testa vårt system för vissa typer av organoider. Massor av hjärna och näthinna, kombinerade organoider från leverkarcinomceller och mesenkymala stamceller, kombinerade organoider från kapital blast mesenkymal stamsamtal och hematopoetiska stamceller differentiering från inducerade pluripotenta stamceller och tarmorganoider.Var det variabelt i cellernas ursprungliga sammansättning? Differentieringsfaktorer, kultur och medium, extracellulär matris, och eventuellt också gasblandningens sammansättning, plattformsrotationens hastighet och andra parametrar. Det kommer att vara möjligt att få organoid med samma form, storlek eller morfologimodell i olika organ och vävnader.Användningen av minibioreaktorer föreslås i detta arbete.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från Frozen Buffy Coats använder icke-integrerande Episomalt plasmider

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från humana perifera T-celler med Sendai virus i Feeder fria förhållanden

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Generering av inducerade-pluripotenta stamceller med hjälp fibroblastliknande synoviocyter Isolerad från fogar av patienter med reumatoid artrit

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från humant melanom tumörinfiltrerande lymfocyter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Inducerade pluripotenta stamceller Generation från blodkroppar med användning Sendai virus och centrifugering

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generation Integrations-fria inducerade pluripotenta stamceller från humant perifert blod mononukleära celler med användning av episomala vektorer

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierade och skalbar generation av hepatocyte-liknande celler från mänskliga pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Kondrogen pelletsbildning från Cord Blood-härledda inducerade Pluripotenta stamceller

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av standardiserade och reproducerbara framhjärnan-typ Cerebral Organoids från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av 3D hud Organoid från sladd blod-derived inducerade pluripotenta stamceller

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...