Name: evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model
Uploaded: 2022-03-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af uddannelsesstipendier fra Institut for Obstetrik og Gynækologi, Baylor College of Medicine (ALG) og R-01 forskningstilskud (Tilskud # DK114689) til CSB, SC og JM fra National Institutes of Health.

Alle dyreprocedurer blev godkendt af den institutionelle dyrepleje- og anvendelseskomité (IACUC) fra Baylor College of Medicine.
1. Tilberedning af [6,6-2H2]glukose
<ol><li>En dag før proceduren forberedes det stabile isotop glukosesporer i normal saltvand. Til dette eksperiment blev [6,6-2H2]glukose brugt som sporstof til at måle plasmaglukoseudseendeligheden. BEMÆRK: I dette eksperiment blev glukoseproduktionen under faste...

<ol>
	<li>March, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+polycystic+ovary+syndrome+in+a+community+sample+assessed+under+contrasting+diagnostic+criteria.">The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).</li><li>Yildiz, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+phenotype+and+cardiometabolic+risk+of+polycystic+ovary+syndrome+under+different+diagnostic+criteria.">Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+2003+consensus+on+diagnostic+criteria+and+long-term+health+risks+related+to+polycystic+ovary+syndrome.">Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).</li><li>Goodarzi, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+ovary+syndrome:+etiology,+pathogenesis+and+diagnosis.">Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).</li><li>Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction:+Determinants+of+polycystic+ovary+syndrome.">Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).</li><li>Baskind, N. E., Balen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic-pituitary,+ovarian+and+adrenal+contributions+to+polycystic+ovary+syndrome.">Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome.</a> Best Practice and Research. Clinical Obstetrics &amp; Gynaecology. 37, 80-97 (2016).</li><li>Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+hyperandrogenism+with+hyperinsulinism+in+polycystic+ovarian+disease.">Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).</li><li>Bremer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+ovary+syndrome+in+the+pediatric+population.">Polycystic ovary syndrome in the pediatric population.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+insulin+receptor+serine+phosphorylation+in+cultured+fibroblasts+and+in+skeletal+muscle.+A+potential+mechanism+for+insulin+resistance+in+the+polycystic+ovary+syndrome.">Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).</li><li>H&#248;jlund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin-stimulated+phosphorylation+of+Akt+and+AS160+in+skeletal+muscle+of+women+with+polycystic+ovary+syndrome+is+reversed+by+pioglitazone+treatment.">Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment.</a> Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).</li><li>Moghetti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergences+in+insulin+resistance+between+the+different+phenotypes+of+the+polycystic+ovary+syndrome.">Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).</li><li>Ovalle, F., Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance,+polycystic+ovary+syndrome,+and+type+2+diabetes+mellitus.">Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus.</a> Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profound+peripheral+insulin+resistance,+independent+of+obesity,+in+polycystic+ovary+syndrome.">Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome.</a> Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).</li><li>Hutchison, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+exercise+on+insulin+resistance+and+body+composition+in+overweight+and+obese+women+with+and+without+polycystic+ovary+syndrome.">Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).</li><li>Stepto, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Women+with+polycystic+ovary+syndrome+have+intrinsic+insulin+resistance+on+euglycaemic-hyperinsulaemic+clamp.">Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp.</a> Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).</li><li>Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+fasting+glucose+production+and+disappearance+are+abnormal+in+people+with+&amp;#34;mild&amp;#34;+and+&amp;#34;severe&amp;#34;+type+2+diabetes.">Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with &amp;#34;mild&amp;#34; and &amp;#34;severe&amp;#34; type 2 diabetes.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).</li><li>Blesson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+dependent+dysregulation+of+hepatic+glucose+production+in+lean+Type+2+diabetic+rats.">Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 538 (2019).</li><li>Caldwell, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+reproductive,+metabolic,+and+endocrine+features+of+polycystic+ovary+syndrome+in+female+hyperandrogenic+mouse+models.">Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models.</a> Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).</li><li>Chappell, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+androgen+induced+lean+PCOS+impairs+mitochondria+and+mRNA+profiles+in+oocytes.">Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes.</a> Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+gluconeogenesis+using+glucose+fragments+and+mass+spectrometry+after+ingestion+of+deuterium+oxide.">Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).</li><li>Bier, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&amp;#34;true&amp;#34;+glucose+production+rates+in+infancy+and+childhood+with+6,6-dideuteroglucose.">Measurement of &amp;#34;true&amp;#34; glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose.</a> Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).</li><li>Chacko, S. K., Sunehag, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenesis+continues+in+premature+infants+receiving+total+parenteral+nutrition.">Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition.</a> Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ghrelin+on+glucose+regulation+in+mice.">Effect of ghrelin on glucose regulation in mice.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-surgical+alternatives+to+invasive+procedures+in+mice.">Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice.</a> Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).</li><li>Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+artery+infusions+for+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+analysis+of+taxanes+in+mice.">Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).</li><li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+conscious,+unrestrained+mice.">Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).</li><li>Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Intravenous+Self+Administration+in+a+Mouse+Model.">Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+urea+kinetic+studies+in+conscious+mice.">In vivo urea kinetic studies in conscious mice.</a> The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).</li><li>Choukem, S. -. P., Gautier, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+hepatic+insulin+resistance.">How to measure hepatic insulin resistance.</a> Diabetes Metabolism. 34 (6), 664-673 (2008).</li></ol>

Hyperglykæmi og unormal glukose metabolisme / homøostase er funktioner i PCOS. Blodsukkerniveauet opretholdes ved en kombination af glukose fra kost- og glukoseproduktion via glykogenolyse og glukoneogenese og glykogene under kontrol af hormon og enzymer. Leverglukoseproduktion undertrykkes af tilstedeværelsen af øgede cirkulerende glukoseniveauer. I lidelser af unormal glukose metabolisme, regulering af undertrykkelsen af glukoseproduktionen er kompromitteret fører til hyperglykæmi. Mens mange undersøgel...

Polycystisk ovarie syndrom (PCOS) er en almindelig lidelse forekommer hos 12%-20% af reproduktive alderen kvinder1,2. Det er en kompleks sygdom, der resulterer i variable fænotyper, der involverer polycystiske æggestokke, uregelmæssig menstruation og klinisk eller laboratoriebevis for hyperandrogenemi, og er typisk diagnosticeret, når en kvinde opfylder to af de tre kriterier3. Et fremherskende aspekt af PCOS, og en nøglefaktor i sin patogenese, er metaboliske sindsforvirring, der findes hos kvinder, der har sygdommen. Kvinder med PCOS har højere forekomster af insulinresistens, glukoseintolerance, fedme og metabolisk syndrom3,4,5,6. Insulinresistens er ikke kun en manifestation af sygdommen, men det menes at bidrage til sin patogenese ved at forstærke virkningen af luteiniserende hormon i æggestokken og derved føre til øget androgen produktion7,8. Insulinresistens menes at have flere mulige oprindelser, men undersøgelser tyder på, at det kan skyldes unormale mønstre af insulinreceptor signalering9,10. Undersøgelser har evalueret insulinresistens hos PCOS-patienter ved hjælp af guldstandardteknikken hyperinsulinæmisk-euglykæmisk klemme11,12,13,14,15. Kvinder med PCOS, uanset BMI, har højere niveauer af insulinresistens sammenlignet med kontrol. Insulinkontrol over glukoseproduktionen er nedsat i lidelser af insulinresistens, der fører til overskydende glukoseproduktion. For eksempel har diabetikere øget glukoneogenese og nedsat undertrykkelse af glykogenolyse16. Desuden er nedsat undertrykkelse af glukoseproduktionen blevet observeret hos diabetiske rotter17. Selvom klemmeundersøgelser kan give en måling af insulinresistens, fokuserer få undersøgelser i PCOS på direkte måling af glukoseproduktion i faste- og fodrede tilstande. Dette kræver brug af en ikke-radioaktiv isotopisk glukose tracer infusion og måling via massespektrometri.
Dyremodeller er blevet flittigt anvendt i PCOS-forskning. Både lean og fede-type PCOS murine modeller er blevet skabt ved at administrere androgener prænatally, prepubertally, eller post-puberteten18. Gnaver PCOS-modeller viser også metaboliske forskelle sammenlignet med deres respektive kontroller. Tidligere data fra vores laboratorium viste unormale glukosetolerancetest (GTT) i PCOS-musemodeller (lean og fede), i overensstemmelse med human PCOS-litteratur19. Brug af en slank og overvægtig dyremodel giver mulighed for yderligere undersøgelse af metaboliske forskelle. Specifikt tillader denne model evaluering af glukoseproduktionen direkte ved hjælp af isotopiske glukosesporere. En af de mest almindeligt anvendte stabile isotopiske glukose tracer er [6,6-2H2]glukose. Glukoseberigelsen [6,6-2H2] kan måles ved hjælp af et pentaacetatderivater som tidligere beskrevet20.
I denne undersøgelse var vores mål at måle hastigheden af leverglukoseproduktion i faste- og glukoserig tilstand hos PCOS-mus ved hjælp af isotopisk glukoseinfusion. Disse teknikker kan anvendes på en lang række eksperimenter, der involverer glukose kinetiker.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride solution</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>275595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL BD Luer-Lok tip syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75846-756</td>
			<td>Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch clear transpore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200400169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch Labeling tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe containing heparanized saline flush</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>191-MIH-2235</td>
			<td>One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9891620</td>
			<td>5 mm if animal is between 2 and 6 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced hot plate stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-602</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 27 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Health Warehouse</td>
			<td>A283952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Medvet</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, 1000 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caging pellets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear VOA glass vials with closed-top cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-719-120</td>
			<td>For storage of acetone and blood draw samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper toothless alligator clamp for tourniquet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (6,6-D2, 99%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td>DLM-349-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62999-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>Ohaus Adventurer Pro</td>
			<td>AV264C</td>
			<td>Any similar model with 0.0001g accuracy can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene bottle, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0158-12EA</td>
			<td>Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD Ultra multi-syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3024A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheets and dividers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; used to cage mice during infusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model

Polycystisk ovarie syndrom (PCOS) er en almindelig sygdom, der resulterer i lidelser i glukosemetabolismen, såsom insulinresistens og glukoseintolerance. Dysreguleret glukosemetabolisme er en vigtig manifestation af sygdommen og er nøglen til dens patogenese. Derfor er undersøgelser, der involverer evaluering af glukosemetabolisme i PCOS, af allerstørste betydning. Meget få undersøgelser har kvantificeret hepatisk glukoseproduktion direkte i PCOS-modeller ved hjælp af ikke-radioaktive glukosesporere. I denne undersøgelse diskuterer vi trinvise instruktioner til kvantificering af satsen for hepatisk glukoseproduktion i en PCOS-musemodel ved at måle M+2-berigelse af [6,6-2H2]glukose, en stabil isotopisk glukose tracer, via gaskromatografi - massespektrometri (GCMS). Denne procedure indebærer oprettelse af stabil isotop glukose tracer opløsning, brug af hale venekateter placering og infusion af glukose tracer i både faste og glukose-rige stater i samme mus i tandem. Berigelsen af [6,6-2H2]glukose måles ved hjælp af pentaacetatderivater i GCMS. Denne teknik kan anvendes på en lang række undersøgelser, der involverer direkte måling af hastigheden af leverglukoseproduktion.

Ved hjælp af tidligere beskrevne isotopfortyndingsligninger blev den samlede plasmaglukoserate (glucoseRa) beregnet ud fra M+2-berigelse af [6,6-2H2]glukose under faste- og glukoserige forhold ved hjælp af pentaacetatderivater21. Under steady-state betingelser antages det, at glukosehastigheden er lig med glukosehastigheden. I kontrolgruppen var den samlede glukoseregne 19,98 ± 2,53 mg/(kg·min) efter 6 timers faste og 25,80 ± 1,76 mg/(kg·min) under...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model at JoVE.com

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Denne undersøgelse beskriver den direkte måling af leverglukoseproduktion i en polycystisk ovarie syndrom musemodel ved hjælp af en stabil isotop glukose tracer via hale vene i både faste og glukose-rige stater i tandem.

Evaluering af leverglukoseproduktion i en polycystisk ovarie syndrom musemodel

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Målet med denne procedure er at bestemme leverglukoseproduktion i et polycystisk ovariesyndrom eller PCOS-musemodel. Dysreguleret glukosemetabolisme er en vigtig manifestation af PCOS og er nøglen til dens patogenese. Derfor er undersøgelser, der involverer evaluering af glukosemetabolisme i PCOS, af allerstørste betydning.I denne undersøgelse diskuterer vi trinvise instruktioner til kvantificering af satsen for leverglukoseproduktion i en PCOS-musemodel ved at måle M plus to berigelse af seks seks deuterated glukose, en stabil isotopisk glukosesporer via gaskromatografi, massespektrometri eller GCMS. Denne procedure indebærer oprettelse af en stabil isotop glukose tracer opløsning, brug af hale vene kateter placering og infusion af glukose tracer i både faste og glukose-rige stater i samme mus i tandem. En dag før proceduren forberedes det stabile isotop glukosesporer i normal saltvand.Til dette eksperiment blev glukoseproduktionen under faste i glukoserige forhold målt, så glukoseisotopen blev fremstillet i to forskellige præparater. Sporstoffet blev fremstillet under sterile forhold ved at opløse steril og pyrogenfri seks seks deuterated glukose og steril 0,9% natriumchloridopløsning med eller uden glukose. Den første infunderes blev forberedt med kun sporstoffet.Den anden infundaate indeholdt både sporstoffet sammen med den ikkeisotopiske glukose. Når opløsningerne var forberedt, blev de sterile filtreret med 0,22 mikron filter og opbevares ved fire grader Celsius. Løsningerne blev udarbejdet på en sådan måde, at den endelige infusionsdosis var tæt på henholdsvis et milligram pr. kilo og minut og to milligram pr. kg og minut.For glukose udseende måling under basal tilstand i glukose-rige tilstand, en primet gennemsnitlig konstant sats infusion af seks seks deuterated glukose på 1,08 milligram per kilogram og minut og 1,9 milligram per kilogram henholdsvis blev brugt. For at efterligne fed tilstand anvendte vi en gennemsnitlig D-glukoseinfusionshastighed på 18,8 milligram pr. Kg og minut under glukoserig tilstand. Fjern musene fra deres hjemmebure, og læg dem i deres fastebure tre timer før eksperimentets start.Til dette eksperiment brugte vi fire måneder gamle hunmus fra C57BL6J-stammen. Saml caging-udstyret ved at gruppere musene i et bestemt antal mus pr. insulinpumpe. Placer skillevægge oven på en flad, stabil base for at lave individuelle boder til musene.Bure er klare og lavet af plexiglas. Der er en flad, stabil base, hvorpå skillevæggene sidder. Døren til buret glider for at lukke og har et hak i bunden for at lade halen passe igennem.Saml sprøjterne, der indeholder en milliliter basal infundasat, og tilslut derefter infusionspumpeslangen ved hjælp af polyethylenslange. Forbered infusionspumpen ved at indstille hastigheden til 150 mikroliter i timen, hvilket er basalhastigheden. Varm et vandbad til 48 grader Celsius.Forbered kateteret indsættelse station støder op til vandbadet indeholder 30 gauge halv-tommer nåle, silastic slange, og en-tommer, klar transport tape. Vælg en mus og placere den i en sikker holder med adgang til halen. Placer et stykke tape over den proksimale del af halen for at give plads til kateteret indsættelse mere distally.Bring musen til vandbadet, og indsæt halen i vandbadet i ca. 30 til 45 sekunder. Dette hjælper med at spile halen vaskulatur for kateter placering. Kateteret indsættelse skal ske under sterile forhold.Når halen er varmet, rengør halen og læg en lille kobber tandløs alligatorklemme som årepresse i den proksimale ende af halen. Visualiser den laterale haleåre under et forstørrelsesglas. Derefter skal kateteret forsigtigt indsættes i haleåren og skylle opløsningen forsigtigt for at sikre kateterets patency.Pak et stykke transportbånd rundt i indføringsstedet for at sikre kateteret, og fjern den lille årepresse fra halen. Placer musen i sit individuelle bur og luk skydedøren, så halen stikker gennem hakket og forbliver uden for buret. Placer et ekstra stykke tape over hele kateteret og halen for at fastgøre det til burets bundplade.Afbryd skyllen fra haleårekatetret, og placer den lille klemme på kateterets silastiske slange for at forhindre tilbageløb, mens den infundatiske linje forbindes fra pumpen. Når den er forsvarligt tilsluttet, skal du fjerne klemmen og skylle primingopløsningen, som består af infunderes. Sørg for, at opløsningen er klar i røret og ikke blodplettet.Når infusionslinjer er noteret for at fungere korrekt, skal dækslet fjernes fra musen. Placer standard sengetøj omkring musen. Start infusionen med infundaatet, der indeholder sporstoffet, og kør den i tre timer kontinuerligt.I infusionens varighed fortsætter med at kontrollere musenes trivsel samt infusionslinjerne. Sørg for, at infusionsslangen er korrekt sikret, og at der ikke er lækager fra linjeforbindelsespunkterne. Når den første infusion er afsluttet, skal du stoppe infusionen og placere en klemme på kateterets slange for at forhindre tilbageløb.Forsigtigt fjernet musene fra deres kabinetter uden at forstyrre kateteret for at indsamle blod. Til dette eksperiment gennemgik musene kindårepunktur ved hjælp af en fire millimeter lancet. Saml ca. 75 mikroliter blod i det ønskede hætteglas.For at deproteinisere prøver som forberedelse til massespektrometri, tilsæt ca. 15 mikroliter blod til 500 mikroliter acetone. Resterende blod kan bruges til at kontrollere blodsukkerniveauet via glucometer og / eller en centrifuge til at adskille plasma til fremtidige hormon assays. Fjern infundat fra sprøjtepumperne ved at frakoble slangen fra sprøjterne, og udskift den med den anden infundanat, der indeholder sporstof sammen med glukose.Gentag tidligere infusionstrin ved hjælp af den glukoserige isotopiske glukoseinfusion. For at nå stabil tilstand skal du køre en bolus af den anden infunderes ved 600 mikroliter i timen i 15 minutter. Bemærk starttidspunktet for hver gruppe bure.Reducer infusionshastigheden til 150 mikroliter i timen for at fuldføre de tre timer af den samlede infusionstid. Gentag blodprøvetagningen som tidligere beskrevet. Afbryd infusioner, tryk på kateteret, indtil blødningen stopper, og returner musene til deres hjemmebure.Derefter sendes prøverne til GCMS. Isotopberigelsen af glukoseisotopen under glukosetoppen beregnes ved hjælp af pentaacetatderivatoren. Kort sagt indebærer denne metode fremstilling af pentaacetatderivat af glukose, efterfulgt af prøveanalyse ved hjælp af GCMS i den positive kemiske ioniseringstilstand.Selektiv ionovervågning af masse-til-opladning-forholdet, 171 til 169, udføres for at bestemme M plus to berigelse af glukoseisotopen. Alle kinetiske målinger udføres under forudsætning af stabile tilstandsforhold. Beregn den samlede plasmaglukoseudseendelseshastighed fra M plus to berigelse af glukoseisotopen og plasmaet ved hjælp af etablerede isotopfortyndingsligninger.Under stabile tilstandsforhold antages det, at glukosehastigheden er lig med glukosehastigheden. Hyppigheden af endogen glukoseproduktion svarer til den samlede plasmaglukoserate minus eksogen glukose. Tabel et indeholder de repræsentative resultater fra undersøgelsen.Alle enheder udtrykkes som milligram pr. kilo og minut. Ved hjælp af tidligere beskrevne isotopfortyndingsligninger blev den samlede plasmaglukoserate beregnet. I kontrolgruppen var den gennemsnitlige glukosehastighed på udseende 19,98 i fastetilstand.Under glukoserige forhold var glukosehastigheden 25,8. Glukoseproduktionshastigheden var 19,08 i fastetilstand og 8,56 i glukoserig tilstand. Unormal glukosemetabolisme og homøostase er almindelige i PCOS.I lidelser af unormal glukose metabolisme, regulering af undertrykkelsen af glukoseproduktionen er kompromitteret fører til hyperglykæmi. I denne undersøgelse beskriver vi en enkel måde at måle hastigheden af leverglukoseproduktion i flere mus på samme tid. De kritiske komponenter i dette eksperiment er kateteret indsættelse og definere de nøjagtige målinger af glukoseisotop og naturlige glukose for at kunne udføre GCMS tilstrækkeligt.Fordelene ved undersøgelsen er at udføre infusionen på en minimalt invasiv måde på grund af hale venekateter indsættelse, samt brug af en let opnåelig, stabil glukose tracer. Der er nogle begrænsninger i undersøgelsen, herunder den tekniske efterspørgsel efter proceduren og behovet for mulige yderligere færdigheder. Samlet set beskriver vi en enkel og præcis måde at måle hastigheden af den samlede hepatiske glukoseproduktion i en PCOS-musemodel.Denne teknik kunne tjene som grundlag for flere undersøgelser, der involverer glukose metabolisme af musemodeller.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Et præklinisk musemodel af levermetastaser

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

En mulig Zebrafisk Model af polycystisk nyresygdom: Knockdown af<em&gt; Wnt5a</em&gt; Årsager cyster i zebrafisk Nyrer

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Evaluering af tumorinfiltrerende leukocytundergrupper i en subkutan Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Lavage-induceret Surfactant Udtømmelse i Svin som en model af den Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Generering af en humaniseret Mouse Lever Brug humane lever Stamceller

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Invasive Hemodynamic Characterization of the Portal-hypertensive Syndrome in Cirrhotic Rats

Invasive hæmodynamiske karakterisering af Portal-hypertensive syndrom i Cirrhotic rotter

This is a detailed protocol describing invasive hemodynamic measurements in cirrhotic rats for the characterization of portal hypertensive syndrome. ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

Oliesyre-injektion i svin som en Model for akut respiratorisk Distress syndrom

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet måling af musen mesenterica arterie ved hjælp af Wire blodkar

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

Standardiseret histomorforisk evaluering af slidgigt i en kirurgisk musemodel

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...