Name: evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model
Uploaded: 2022-03-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door opleidingsbeurzen van het Department of Obstetrics and Gynecology, Baylor College of Medicine (ALG) en R-01 onderzoeksbeurs (Grant # DK114689) voor CSB, SC en JM van National Institutes of Health.

Alle dierprocedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Baylor College of Medicine.
1. Bereiding van [6,6-2H2]glucose
<ol><li>Bereid een dag voor de procedure de stabiele isotoopglucose tracer voor in een normale zoutoplossing. Voor dit experiment werd [6,6-2H2]glucose gebruikt als tracer om de verschijningssnelheid van plasmaglucose te meten. OPMERKING: In dit experiment werden...

<ol>
	<li>March, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+polycystic+ovary+syndrome+in+a+community+sample+assessed+under+contrasting+diagnostic+criteria.">The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).</li><li>Yildiz, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+phenotype+and+cardiometabolic+risk+of+polycystic+ovary+syndrome+under+different+diagnostic+criteria.">Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+2003+consensus+on+diagnostic+criteria+and+long-term+health+risks+related+to+polycystic+ovary+syndrome.">Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).</li><li>Goodarzi, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+ovary+syndrome:+etiology,+pathogenesis+and+diagnosis.">Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).</li><li>Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction:+Determinants+of+polycystic+ovary+syndrome.">Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).</li><li>Baskind, N. E., Balen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic-pituitary,+ovarian+and+adrenal+contributions+to+polycystic+ovary+syndrome.">Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome.</a> Best Practice and Research. Clinical Obstetrics &amp; Gynaecology. 37, 80-97 (2016).</li><li>Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+hyperandrogenism+with+hyperinsulinism+in+polycystic+ovarian+disease.">Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).</li><li>Bremer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+ovary+syndrome+in+the+pediatric+population.">Polycystic ovary syndrome in the pediatric population.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+insulin+receptor+serine+phosphorylation+in+cultured+fibroblasts+and+in+skeletal+muscle.+A+potential+mechanism+for+insulin+resistance+in+the+polycystic+ovary+syndrome.">Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).</li><li>H&#248;jlund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin-stimulated+phosphorylation+of+Akt+and+AS160+in+skeletal+muscle+of+women+with+polycystic+ovary+syndrome+is+reversed+by+pioglitazone+treatment.">Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment.</a> Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).</li><li>Moghetti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergences+in+insulin+resistance+between+the+different+phenotypes+of+the+polycystic+ovary+syndrome.">Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).</li><li>Ovalle, F., Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance,+polycystic+ovary+syndrome,+and+type+2+diabetes+mellitus.">Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus.</a> Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profound+peripheral+insulin+resistance,+independent+of+obesity,+in+polycystic+ovary+syndrome.">Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome.</a> Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).</li><li>Hutchison, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+exercise+on+insulin+resistance+and+body+composition+in+overweight+and+obese+women+with+and+without+polycystic+ovary+syndrome.">Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).</li><li>Stepto, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Women+with+polycystic+ovary+syndrome+have+intrinsic+insulin+resistance+on+euglycaemic-hyperinsulaemic+clamp.">Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp.</a> Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).</li><li>Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+fasting+glucose+production+and+disappearance+are+abnormal+in+people+with+&amp;#34;mild&amp;#34;+and+&amp;#34;severe&amp;#34;+type+2+diabetes.">Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with &amp;#34;mild&amp;#34; and &amp;#34;severe&amp;#34; type 2 diabetes.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).</li><li>Blesson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+dependent+dysregulation+of+hepatic+glucose+production+in+lean+Type+2+diabetic+rats.">Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 538 (2019).</li><li>Caldwell, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+reproductive,+metabolic,+and+endocrine+features+of+polycystic+ovary+syndrome+in+female+hyperandrogenic+mouse+models.">Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models.</a> Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).</li><li>Chappell, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+androgen+induced+lean+PCOS+impairs+mitochondria+and+mRNA+profiles+in+oocytes.">Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes.</a> Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+gluconeogenesis+using+glucose+fragments+and+mass+spectrometry+after+ingestion+of+deuterium+oxide.">Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).</li><li>Bier, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&amp;#34;true&amp;#34;+glucose+production+rates+in+infancy+and+childhood+with+6,6-dideuteroglucose.">Measurement of &amp;#34;true&amp;#34; glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose.</a> Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).</li><li>Chacko, S. K., Sunehag, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenesis+continues+in+premature+infants+receiving+total+parenteral+nutrition.">Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition.</a> Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ghrelin+on+glucose+regulation+in+mice.">Effect of ghrelin on glucose regulation in mice.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-surgical+alternatives+to+invasive+procedures+in+mice.">Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice.</a> Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).</li><li>Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+artery+infusions+for+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+analysis+of+taxanes+in+mice.">Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).</li><li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+conscious,+unrestrained+mice.">Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).</li><li>Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Intravenous+Self+Administration+in+a+Mouse+Model.">Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+urea+kinetic+studies+in+conscious+mice.">In vivo urea kinetic studies in conscious mice.</a> The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).</li><li>Choukem, S. -. P., Gautier, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+hepatic+insulin+resistance.">How to measure hepatic insulin resistance.</a> Diabetes Metabolism. 34 (6), 664-673 (2008).</li></ol>

Hyperglycemie en abnormaal glucosemetabolisme / homeostase zijn kenmerken van PCOS. De bloedsuikerspiegel wordt gehandhaafd door een combinatie van glucose uit voeding en glucoseproductie via glycogenolyse en gluconeogenese en glycogenese, onder controle van hormoon en enzymen. De productie van leverglucose wordt onderdrukt door de aanwezigheid van verhoogde circulerende glucosespiegels. Bij aandoeningen van abnormaal glucosemetabolisme wordt de regulatie van de onderdrukking van glucoseproductie aangetast, wat ...

Polycysteus ovariumsyndroom (PCOS) is een veel voorkomende aandoening die voorkomt bij 12%-20% van de vrouwen in de reproductieve leeftijd1,2. Het is een complexe ziekte die resulteert in variabele fenotypen met polycysteuze eierstokken, onregelmatige menstruatie en klinisch of laboratoriumbewijs van hyperandrogeenemie, en wordt meestal gediagnosticeerd wanneer een vrouw aan twee van de drie criteria voldoet3. Een overheersend aspect van PCOS, en een belangrijke factor in de pathogenese, is metabole verstoringen die worden aangetroffen bij vrouwen die de ziekte hebben. Vrouwen met PCOS hebben een hogere incidentie van insulineresistentie, glucose-intolerantie, obesitas en metabool syndroom3,4,5,6. Insulineresistentie is niet alleen een manifestatie van de ziekte, maar er wordt gedacht dat het bijdraagt aan de pathogenese door de werking van luteïniserend hormoon in de eierstok te versterken, wat leidt tot een verhoogde androgeenproductie7,8. Insulineresistentie wordt verondersteld verschillende mogelijke oorzaken te hebben, maar studies suggereren dat het te wijten kan zijn aan abnormale patronen van insulinereceptorsignalering9,10. Studies hebben insulineresistentie bij PCOS-patiënten geëvalueerd met behulp van de gouden standaardtechniek van hyperinsulinemisch-euglycemische clamp11,12,13,14,15. Vrouwen met PCOS, ongeacht de BMI, hebben hogere niveaus van insulineresistentie in vergelijking met controles. Insulinecontrole over glucoseproductie is verminderd bij aandoeningen van insulineresistentie die leiden tot overmatige glucoseproductie. Diabetespatiënten hebben bijvoorbeeld verhoogde gluconeogenese en verminderde onderdrukking van glycogenolyse16. Bovendien is een verminderde onderdrukking van de glucoseproductie waargenomen bij diabetische ratten17. Hoewel klemstudies een meting van insulineresistentie kunnen geven, richten weinig studies in PCOS zich op directe meting van glucoseproductie in nuchtere en gevoede toestanden. Dit vereist het gebruik van een niet-radioactieve isotopische glucose tracer infusie en meting via massaspectrometrie.
Diermodellen zijn op grote schaal gebruikt in PCOS-onderzoek. Zowel magere als zwaarlijvige PCOS-muizenmodellen zijn gemaakt door androgenen prenataal, prepubertaal of post-pubertaal toe te dienen18. Knaagdier PCOS-modellen tonen ook metabole verschillen in vergelijking met hun respectieve controles. Eerdere gegevens uit ons laboratorium toonden abnormale glucosetolerantietests (GTT) aan in PCOS-muismodellen (mager en zwaarlijvig), in overeenstemming met de menselijke PCOS-literatuur19. Het gebruik van een mager en zwaarlijvig diermodel maakt verder onderzoek naar metabole verschillen mogelijk. In het bijzonder maakt dit model het mogelijk om de snelheid van glucoseproductie rechtstreeks te evalueren met behulp van isotopische glucose tracers. Een van de meest gebruikte stabiele isotopische glucose tracers is [6,6-2H2]glucose. De [6,6-2H2]glucoseverrijking kan worden gemeten met behulp van een pentaacetaatderivaat zoals eerder beschreven20.
In deze studie was ons doel om de snelheid van hepatische glucoseproductie in nuchtere en glucoserijke toestand bij PCOS-muizen te meten met behulp van isotopische glucose-infusie. Deze technieken kunnen worden toegepast op een breed scala aan experimenten met glucosekinetiek.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride solution</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>275595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL BD Luer-Lok tip syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75846-756</td>
			<td>Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch clear transpore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200400169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch Labeling tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe containing heparanized saline flush</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>191-MIH-2235</td>
			<td>One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9891620</td>
			<td>5 mm if animal is between 2 and 6 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced hot plate stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-602</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 27 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Health Warehouse</td>
			<td>A283952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Medvet</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, 1000 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caging pellets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear VOA glass vials with closed-top cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-719-120</td>
			<td>For storage of acetone and blood draw samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper toothless alligator clamp for tourniquet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (6,6-D2, 99%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td>DLM-349-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62999-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>Ohaus Adventurer Pro</td>
			<td>AV264C</td>
			<td>Any similar model with 0.0001g accuracy can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene bottle, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0158-12EA</td>
			<td>Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD Ultra multi-syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3024A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheets and dividers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; used to cage mice during infusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model

Polycysteus ovariumsyndroom (PCOS) is een veel voorkomende ziekte die resulteert in aandoeningen van het glucosemetabolisme, zoals insulineresistentie en glucose-intolerantie. Ontregeld glucosemetabolisme is een belangrijke manifestatie van de ziekte en is de sleutel tot de pathogenese. Daarom zijn studies met betrekking tot de evaluatie van het glucosemetabolisme in PCOS van het grootste belang. Zeer weinig studies hebben de productie van leverglucose rechtstreeks gekwantificeerd in PCOS-modellen met behulp van niet-radioactieve glucose tracers. In deze studie bespreken we stapsgewijze instructies voor de kwantificering van de snelheid van leverglucoseproductie in een PCOS-muismodel door M +2-verrijking van [6,6-2H2] glucose, een stabiele isotopische glucose tracer, te meten via gaschromatografie - massaspectrometrie (GCMS). Deze procedure omvat het creëren van stabiele isotopische glucose tracer oplossing, gebruik van staartader katheter plaatsing en infusie van de glucose tracer in zowel nuchtere als glucose-rijke toestanden in dezelfde muis in tandem. De verrijking van [6,6-2H2]glucose wordt gemeten met pentaacetaatderivaat in GCMS. Deze techniek kan worden toegepast op een breed scala aan studies met directe meting van de snelheid van de leverglucoseproductie.

Met behulp van eerder beschreven isotoopverdunningsvergelijkingen werd de totale plasmaglucosesnelheid (glucoseRa) berekend uit M+2-verrijking van [6,6-2H2]glucose in nuchtere en glucoserijke omstandigheden met behulp van het pentaacetaatderivaat21. Onder steady-state omstandigheden wordt aangenomen dat de snelheid van verschijning van glucose gelijk is aan de snelheid van het verdwijnen van glucose. In de controlegroep was de totale glucoseRa 19,98 ± 2...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model at JoVE.com

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Deze studie beschrijft de directe meting van de leverglucoseproductie in een polycysteus ovariumsyndroom muismodel door gebruik te maken van een stabiele isotopische glucose tracer via staartader in zowel nuchtere als glucoserijke toestanden in tandem.

Evaluatie van leverglucoseproductie in een muismodel met polycysteus ovariumsyndroom

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Het doel van deze procedure is om de leverglucoseproductie te bepalen in een polycysteus ovariumsyndroom of PCOS-muismodel. Ontregeld glucosemetabolisme is een belangrijke manifestatie van PCOS en is de sleutel tot de pathogenese. Daarom zijn studies met betrekking tot de evaluatie van het glucosemetabolisme in PCOS van het grootste belang.In deze studie bespreken we stapsgewijze instructies voor de kwantificering van de snelheid van leverglucoseproductie in een PCOS-muismodel door de M plus twee verrijking van zes gedeutereerde glucose, een stabiele isotopische glucosetracer, te meten via gaschromatografie, massaspectrometrie of GCMS. Deze procedure omvat het creëren van een stabiele isotopische glucose traceroplossing, het gebruik van de plaatsing van de staartaderkatheter en infusie van de glucose tracer in zowel nuchtere als glucoserijke toestanden in dezelfde muis in combinatie. Bereid een dag voor de procedure de stabiele isotoopglucose tracer voor in een normale zoutoplossing.Voor dit experiment werd de glucoseproductie tijdens het vasten in glucoserijke omstandigheden gemeten, zodat de glucose-isotoop in twee verschillende preparaten werd bereid. De tracer werd onder steriele omstandigheden bereid door steriele en pyrogeenvrije zes gedeutereerde glucose en steriele 0,9% natriumchlorideoplossing met of zonder glucose op te lossen. Het eerste infusaat werd bereid met alleen de tracer.Het tweede infundaat bevatte zowel de tracer als de niet-isotopische glucose. Nadat de oplossingen waren bereid, werden ze steriel gefilterd met het filter van 0,22 micron en opgeslagen bij vier graden Celsius. De oplossingen werden zo bereid dat de uiteindelijke infusiedosis dicht bij respectievelijk één milligram per kilogram en minuut en twee milligram per kilogram en minuut lag.Voor de glucose-verschijningssnelheidsmeting tijdens basale toestand in glucoserijke toestand, werd een geprimeerde gemiddelde constante snelheidsinfusie van zes zes gedeutereerde glucose bij respectievelijk 1,08 milligram per kilogram en minuut en 1,9 milligram per kilogram in minuut gebruikt. Om de gevoede toestand na te bootsen, gebruikten we een gemiddelde D-glucose-infusiesnelheid van 18,8 milligram per kilogram en minuut tijdens glucoserijke toestand. Verwijder de muizen uit hun thuiskooien en plaats ze drie uur voor het begin van het experiment in hun vastenkooien.Voor dit experiment gebruikten we vier maanden oude vrouwelijke muizen van de C57BL6J-stam. Monteer de caging-apparatuur door de muizen te groeperen in een vast aantal muizen per insulinepomp. Plaats scheidingswanden bovenop een vlakke, stabiele basis om individuele stallen voor de muizen te maken.Kooien zijn helder en gemaakt van plexiglas. Er is een vlakke, stabiele basis waarop de scheidingswanden zitten. De deur naar de kooi schuift dicht en heeft een inkeping aan de onderkant om de staart door te laten.Monteer de spuiten met één milliliter basaal infundaat en sluit vervolgens aan op de infuuspompbuis met behulp van de polyethyleenbuis. Bereid de infusiepomp voor door de snelheid in te stellen op 150 microliter per uur, wat de basale snelheid is. Verwarm een waterbad tot 48 graden Celsius.Bereid het katheterinbrengstation voor naast het waterbad met de 30 gauge naalden van een halve inch, silastische slang en doorzichtig transporttape van één inch. Selecteer één muis en plaats deze in een veilige houder met toegang tot de staart. Plaats een stuk tape over het proximale deel van de staart om ruimte te bieden voor het inbrengen van de katheter meer distaal.Breng de muis naar het waterbad en steek de staart ongeveer 30 tot 45 seconden in het waterbad. Dit helpt om de staartvasculatuur te verwijden voor katheterplaatsing. Het inbrengen van de katheter moet onder steriele omstandigheden gebeuren.Zodra de staart is opgewarmd, reinigt u de staart en plaatst u een kleine koperen tandeloze alligatorklem als een tourniquet aan het proximale uiteinde van de staart. Visualiseer de laterale staartader onder een vergrootglas. Breng vervolgens de katheter voorzichtig in de staartader in en spoel de oplossing voorzichtig om de doorgankelijkheid van de katheter te garanderen.Wikkel een stuk transporttape rond de inbrengplaats om de katheter vast te zetten en verwijder het kleine tourniquet van de staart. Plaats de muis in zijn individuele kooi en sluit de schuifdeur, zodat de staart door de inkeping steekt en buiten de kooi blijft. Plaats een extra stuk tape over de hele katheter en de staart om deze aan de basisplaat van de kooi te bevestigen.Koppel de spoeling los van de staartaderkatheter en plaats de kleine klem op de silastische slang van de katheter om terugstroming te voorkomen terwijl de infundaatsleiding van de pomp wordt aangesloten. Eenmaal veilig aangesloten, verwijdert u de klem en spoelt u de aanzuigoplossing die uit het infundaat bestaat. Zorg ervoor dat de oplossing helder is in de buis en niet bebloed.Zodra is vastgesteld dat de infusielijnen goed functioneren, verwijdert u het deksel van de muis. Plaats standaard beddengoed rond de muis. Start de infusie met het infusaat dat de tracer bevat en laat het gedurende drie uur continu uitvoeren.Blijf voor de duur van de infusie het welzijn van muizen controleren, evenals de infusielijnen. Zorg ervoor dat de infuusslang goed is beveiligd en dat er geen lekken zijn van de aansluitpunten van de lijn. Nadat de eerste infusie is voltooid, stopt u de infusie en plaatst u een klem op de slang van de katheter om terugstroming te voorkomen.Verwijder de muizen voorzichtig uit hun behuizingen zonder de katheter te verstoren om bloed te verzamelen. Voor dit experiment ondergingen de muizen een wangaderpunctie met behulp van een lancet van vier millimeter. Verzamel ongeveer 75 microliter bloed in de door u gewenste injectieflacon.Om monsters te deproteiniseren ter voorbereiding op massaspectrometrie, voegt u ongeveer 15 microliter bloed toe aan 500 microliter aceton. Resterend bloed kan worden gebruikt om de bloedsuikerspiegel te controleren via glucometer en / of een centrifuge om plasma te scheiden voor toekomstige hormoontests. Verwijder het infundaat uit de spuitpompen door de slang los te koppelen van de spuiten en vervang het door het tweede infusaat dat tracer bevat, samen met glucose.Herhaal eerdere infusiestappen met behulp van de glucoserijke isotopische glucose-infusie. Om steady state te bereiken, laat je een bolus van het tweede infusaat gedurende 15 minuten met 600 microliter per uur lopen. Noteer de starttijd voor elke groep kooien.Verlaag de infusiesnelheid tot 150 microliter per uur om de drie uur totale infusietijd te voltooien. Herhaal bloedafname zoals eerder beschreven. Koppel infusies los, oefen druk uit op de katheterplaatsen totdat het bloeden stopt en breng de muizen terug naar hun thuiskooien.Vervolgens worden de monsters verzonden voor GCMS. Bereken de isotopische verrijking van de glucose-isotoop onder glucosepiek door GCCMS met behulp van het pentaacetaatderivaat. Kortom, deze methode omvat de bereiding van het pentaacetaatderivaat van glucose, gevolgd door monsteranalyse met behulp van GCMS in de positieve chemische ionisatiemodus.Selectieve ionenmonitoring van de massa-ladingsverhouding, 171 tot 169, wordt uitgevoerd om de M plus twee verrijking van de glucose-isotoop te bepalen. Alle kinetische metingen worden uitgevoerd uitgaande van steady state condities. Bereken de totale plasmaglucose-verschijningssnelheid van de M plus twee verrijking van de glucose-isotoop en het plasma met behulp van gevestigde isotoopverdunningsvergelijkingen.Onder steady state-omstandigheden wordt aangenomen dat de snelheid van verschijning van glucose gelijk is aan de snelheid van het verdwijnen van glucose. Snelheid van endogene glucoseproductie is gelijk aan de totale plasmaglucosesnelheid minus exogene glucose. Tabel één bevat de representatieve resultaten van het onderzoek.Alle eenheden worden uitgedrukt als milligram per kilogram en minuut. Met behulp van eerder beschreven isotoopverdunningsvergelijkingen werd de totale plasmaglucosesnelheid berekend. In de controlegroep was de gemiddelde glucosesnelheid 19,98 in de nuchtere toestand.In glucoserijke omstandigheden was de glucosesnelheid van het uiterlijk 25,8. Glucoseproductiesnelheid was 19,08 in de nuchtere toestand en 8,56 in de glucoserijke toestand. Abnormaal glucosemetabolisme en homeostase komen vaak voor bij PCOS.Bij aandoeningen van abnormaal glucosemetabolisme wordt de regulatie van de onderdrukking van glucoseproductie aangetast, wat leidt tot hyperglycemie. In deze studie beschrijven we een eenvoudige manier om de snelheid van hepatische glucoseproductie in meerdere muizen tegelijkertijd te meten. De kritieke componenten van dit experiment zijn het inbrengen van de katheter en het definiëren van de exacte metingen van de glucose-isotoop en natuurlijke glucose om GCMS adequaat uit te voeren.De voordelen van de studie is het bereiken van de infusie op een minimaal invasieve manier als gevolg van het inbrengen van de staartaderkatheter, evenals het gebruik van een gemakkelijk bereikbare, stabiele glucose tracer. Er zijn enkele beperkingen aan de studie, waaronder de technische vraag van de procedure en de behoefte aan mogelijke aanvullende vaardigheden. Over het algemeen beschrijven we een eenvoudige, nauwkeurige manier om de snelheid van de totale leverglucoseproductie te meten in een PCOS-muismodel.Deze techniek zou kunnen dienen als basis voor meerdere studies met betrekking tot glucosemetabolisme van muismodellen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

Murine Bioluminescent Lever Tumor Model

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Een preklinisch muizenmodel van levermetastasen

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Een mogelijke zebravis model van PKD: Knockdown van<em&gt; Wnt5a</em&gt; Oorzaken Cysten in zebravis Nieren

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Evaluatie van tumor-infiltrerende leukocyten subsets in een subcutane tumormodel

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

-Lavage geïnduceerde Surfactant Uitputting in Pigs als een model van de Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Genereren van een gehumaniseerd muis lever met behulp van menselijke lever stamcellen

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Invasive Hemodynamic Characterization of the Portal-hypertensive Syndrome in Cirrhotic Rats

Invasieve hemodynamische karakterisering van de Portal-hypertensieve syndroom bij Cirrhotic ratten

This is a detailed protocol describing invasive hemodynamic measurements in cirrhotic rats for the characterization of portal hypertensive syndrome. ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

Oliezuur-injectie bij varkens als een Model voor Acute Respiratory Distress Syndrome

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrische Contractility meting van de muis mesenterische slagader met behulp van draad Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

Gestandaardiseerde Histomormetrische evaluatie van artrose in een chirurgisch muismodel

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...