Name: evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model
Uploaded: 2022-03-05T13:30:00
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Diese Arbeit wurde durch Ausbildungsstipendien der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie, des Baylor College of Medicine (ALG) und des R-01-Forschungsstipendiums (Grant # DK114689) für CSB, SC und JM von National Institutes of Health unterstützt.

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Baylor College of Medicine genehmigt.
1. Herstellung von [6,6-2H2]Glucose
<ol><li>Bereiten Sie einen Tag vor dem Eingriff den stabilen Isotopenglukose-Tracer in normaler Kochsalzlösung vor. Für dieses Experiment wurde [6,6-2H2]Glucose als Tracer zur Messung der Plasmaglukose-Erscheinungsrate verwendet. HINWEIS: In diesem Experiment wurde die ...

<ol>
	<li>March, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+polycystic+ovary+syndrome+in+a+community+sample+assessed+under+contrasting+diagnostic+criteria.">The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).</li><li>Yildiz, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+phenotype+and+cardiometabolic+risk+of+polycystic+ovary+syndrome+under+different+diagnostic+criteria.">Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+2003+consensus+on+diagnostic+criteria+and+long-term+health+risks+related+to+polycystic+ovary+syndrome.">Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).</li><li>Goodarzi, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+ovary+syndrome:+etiology,+pathogenesis+and+diagnosis.">Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).</li><li>Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction:+Determinants+of+polycystic+ovary+syndrome.">Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).</li><li>Baskind, N. E., Balen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic-pituitary,+ovarian+and+adrenal+contributions+to+polycystic+ovary+syndrome.">Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome.</a> Best Practice and Research. Clinical Obstetrics &amp; Gynaecology. 37, 80-97 (2016).</li><li>Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+hyperandrogenism+with+hyperinsulinism+in+polycystic+ovarian+disease.">Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).</li><li>Bremer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+ovary+syndrome+in+the+pediatric+population.">Polycystic ovary syndrome in the pediatric population.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+insulin+receptor+serine+phosphorylation+in+cultured+fibroblasts+and+in+skeletal+muscle.+A+potential+mechanism+for+insulin+resistance+in+the+polycystic+ovary+syndrome.">Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).</li><li>H&#248;jlund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin-stimulated+phosphorylation+of+Akt+and+AS160+in+skeletal+muscle+of+women+with+polycystic+ovary+syndrome+is+reversed+by+pioglitazone+treatment.">Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment.</a> Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).</li><li>Moghetti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergences+in+insulin+resistance+between+the+different+phenotypes+of+the+polycystic+ovary+syndrome.">Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).</li><li>Ovalle, F., Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance,+polycystic+ovary+syndrome,+and+type+2+diabetes+mellitus.">Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus.</a> Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profound+peripheral+insulin+resistance,+independent+of+obesity,+in+polycystic+ovary+syndrome.">Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome.</a> Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).</li><li>Hutchison, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+exercise+on+insulin+resistance+and+body+composition+in+overweight+and+obese+women+with+and+without+polycystic+ovary+syndrome.">Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).</li><li>Stepto, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Women+with+polycystic+ovary+syndrome+have+intrinsic+insulin+resistance+on+euglycaemic-hyperinsulaemic+clamp.">Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp.</a> Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).</li><li>Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+fasting+glucose+production+and+disappearance+are+abnormal+in+people+with+&amp;#34;mild&amp;#34;+and+&amp;#34;severe&amp;#34;+type+2+diabetes.">Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with &amp;#34;mild&amp;#34; and &amp;#34;severe&amp;#34; type 2 diabetes.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).</li><li>Blesson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+dependent+dysregulation+of+hepatic+glucose+production+in+lean+Type+2+diabetic+rats.">Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 538 (2019).</li><li>Caldwell, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+reproductive,+metabolic,+and+endocrine+features+of+polycystic+ovary+syndrome+in+female+hyperandrogenic+mouse+models.">Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models.</a> Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).</li><li>Chappell, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+androgen+induced+lean+PCOS+impairs+mitochondria+and+mRNA+profiles+in+oocytes.">Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes.</a> Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+gluconeogenesis+using+glucose+fragments+and+mass+spectrometry+after+ingestion+of+deuterium+oxide.">Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).</li><li>Bier, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&amp;#34;true&amp;#34;+glucose+production+rates+in+infancy+and+childhood+with+6,6-dideuteroglucose.">Measurement of &amp;#34;true&amp;#34; glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose.</a> Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).</li><li>Chacko, S. K., Sunehag, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenesis+continues+in+premature+infants+receiving+total+parenteral+nutrition.">Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition.</a> Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ghrelin+on+glucose+regulation+in+mice.">Effect of ghrelin on glucose regulation in mice.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-surgical+alternatives+to+invasive+procedures+in+mice.">Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice.</a> Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).</li><li>Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+artery+infusions+for+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+analysis+of+taxanes+in+mice.">Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).</li><li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+conscious,+unrestrained+mice.">Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).</li><li>Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Intravenous+Self+Administration+in+a+Mouse+Model.">Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+urea+kinetic+studies+in+conscious+mice.">In vivo urea kinetic studies in conscious mice.</a> The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).</li><li>Choukem, S. -. P., Gautier, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+hepatic+insulin+resistance.">How to measure hepatic insulin resistance.</a> Diabetes Metabolism. 34 (6), 664-673 (2008).</li></ol>

Hyperglykämie und abnormaler Glukosestoffwechsel / Homöostase sind Merkmale von PCOS. Der Blutzuckerspiegel wird durch eine Kombination von Glukose aus der Nahrung und Glukoseproduktion über Glykogenolyse und Glukoneogenese und Glykogenese unter der Kontrolle von Hormonen und Enzymen aufrechterhalten. Die hepatische Glukoseproduktion wird durch das Vorhandensein erhöhter zirkulierender Glukosespiegel unterdrückt. Bei Störungen des abnormalen Glukosestoffwechsels ist die Regulierung der Unterdrückung der G...

Das polyzystische Ovarialsyndrom (PCOS) ist eine häufige Erkrankung, die bei 12 %-20 % der Frauen im gebärfähigen Alter auftritt1,2. Es ist eine komplexe Erkrankung, die zu variablen Phänotypen führt, an denen polyzystische Eierstöcke, unregelmäßige Menstruationen und klinische oder Labornachweise einer Hyperandrogenämie beteiligt sind, und wird typischerweise diagnostiziert, wenn eine Frau zwei der drei Kriterien erfüllt3. Ein vorherrschender Aspekt von PCOS und ein Schlüsselfaktor für seine Pathogenese sind metabolische Störungen, die bei Frauen mit der Krankheit auftreten. Frauen mit PCOS haben eine höhere Inzidenz von Insulinresistenz, Glukoseintoleranz, Fettleibigkeit und metabolischem Syndrom3,4,5,6. Insulinresistenz ist nicht nur eine Manifestation der Krankheit, sondern es wird angenommen, dass sie zu ihrer Pathogenese beiträgt, indem sie die Wirkung des luteinisierenden Hormons im Eierstock verstärkt und dadurch zu einer erhöhten Androgenproduktion führt7,8. Es wird angenommen, dass die Insulinresistenz mehrere mögliche Ursprünge hat, aber Studien deuten darauf hin, dass sie auf abnormale Muster der Insulinrezeptorsignalisierung zurückzuführen sein könnte9,10. Studien haben die Insulinresistenz bei PCOS-Patienten unter Verwendung der Goldstandardtechnik der hyperinsulinämisch-euglykämischen Clamp11,12,13,14,15 untersucht. Frauen mit PCOS, unabhängig vom BMI, haben im Vergleich zu Kontrollen eine höhere Insulinresistenz. Die Insulinkontrolle über die Glukoseproduktion ist bei Störungen der Insulinresistenz, die zu einer übermäßigen Glukoseproduktion führen, beeinträchtigt. Zum Beispiel haben Diabetiker erhöhte Raten der Glukoneogenese und eine gestörte Unterdrückung der Glykogenolyse16. Darüber hinaus wurde bei diabetischen Ratten eine gestörte Unterdrückung der Glukoseproduktion beobachtet17. Obwohl Clamp-Studien eine Messung der Insulinresistenz liefern können, konzentrieren sich nur wenige Studien in PCOS auf die direkte Messung der Glukoseproduktion im Nüchtern- und Fütterungszustand. Dies erfordert die Verwendung einer nicht-radioaktiven Isotopenglukose-Tracer-Infusion und die Messung mittels Massenspektrometrie.
Tiermodelle wurden in der PCOS-Forschung ausgiebig verwendet. Sowohl schlanke als auch fettleibige PCOS-Murinenmodelle wurden durch pränatale, präpubertelle oder postpubertale Verabreichung von Androgenen erstellt18. Nagetier-PCOS-Modelle zeigen auch metabolische Unterschiede im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollen. Frühere Daten aus unserem Labor zeigten abnormale Glukosetoleranztests (GTT) in PCOS-Mausmodellen (mager und fettleibig), die mit der menschlichen PCOS-Literatur übereinstimmen19. Die Verwendung eines schlanken und fettleibigen Tiermodells ermöglicht die weitere Untersuchung von Stoffwechselunterschieden. Insbesondere ermöglicht dieses Modell die Bewertung der Rate der Glukoseproduktion direkt unter Verwendung von Isotopenglukose-Tracern. Einer der am häufigsten verwendeten stabilen Isotopenglukose-Tracer ist [6,6-2H2]Glucose. Die [6,6-2H2]Glucoseanreicherung kann mit einem Pentaacetatderivat wie zuvor beschrieben gemessen werden20.
In dieser Studie war es unser Ziel, die Rate der hepatischen Glukoseproduktion im nüchternen und glukosereichen Zustand bei PCOS-Mäusen mit Isotopenglukoseinfusion zu messen. Diese Techniken können auf eine Vielzahl von Experimenten mit Glukosekinetik angewendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride solution</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>275595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL BD Luer-Lok tip syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75846-756</td>
			<td>Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch clear transpore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200400169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch Labeling tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe containing heparanized saline flush</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>191-MIH-2235</td>
			<td>One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9891620</td>
			<td>5 mm if animal is between 2 and 6 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced hot plate stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-602</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 27 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Health Warehouse</td>
			<td>A283952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Medvet</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, 1000 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caging pellets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear VOA glass vials with closed-top cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-719-120</td>
			<td>For storage of acetone and blood draw samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper toothless alligator clamp for tourniquet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (6,6-D2, 99%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td>DLM-349-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62999-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>Ohaus Adventurer Pro</td>
			<td>AV264C</td>
			<td>Any similar model with 0.0001g accuracy can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene bottle, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0158-12EA</td>
			<td>Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD Ultra multi-syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3024A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheets and dividers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; used to cage mice during infusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model

Das polyzystische Ovarialsyndrom (PCOS) ist eine häufige Erkrankung, die zu Störungen des Glukosestoffwechsels wie Insulinresistenz und Glukoseintoleranz führt. Der fehlregulierte Glukosestoffwechsel ist eine wichtige Manifestation der Krankheit und der Schlüssel zu ihrer Pathogenese. Daher sind Studien zur Bewertung des Glukosestoffwechsels bei PCOS von größter Bedeutung. Nur sehr wenige Studien haben die hepatische Glukoseproduktion direkt in PCOS-Modellen mit nicht-radioaktiven Glukose-Tracern quantifiziert. In dieser Studie diskutieren wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Quantifizierung der Rate der hepatischen Glukoseproduktion in einem PCOS-Mausmodell durch Messung der M+2-Anreicherung von [6,6-2H2]Glucose, einem stabilen Isotopenglukose-Tracer, mittels Gaschromatographie - Massenspektrometrie (GCMS). Dieses Verfahren beinhaltet die Herstellung einer stabilen isotopenförmigen Glucose-Tracer-Lösung, die Verwendung der Platzierung des Schwanzvenenkatheters und die Infusion des Glucose-Tracers sowohl im nüchternen als auch im glucosereichen Zustand in derselben Maus im Tandem. Die Anreicherung von [6,6-2H2]Glucose wird mit Pentaacetatderivat in GCMS gemessen. Diese Technik kann auf eine Vielzahl von Studien angewendet werden, die eine direkte Messung der Rate der hepatischen Glukoseproduktion beinhalten.

Unter Verwendung zuvor beschriebener Isotopenverdünnungsgleichungen wurde die Gesamtplasmaglukoserate (glucoseRa) aus der M+2-Anreicherung von [6,6-2H2]Glucose unter nüchternen und glucosereichen Bedingungen unter Verwendung des Pentaacetatderivats21 berechnet. Unter stationären Bedingungen wird angenommen, dass die Rate des Auftretens von Glukose gleich der Rate des Verschwindens von Glukose ist. In der Kontrollgruppe betrug die GesamtglucoseRa 19,98 ± 2,53 mg...

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Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Diese Studie beschreibt die direkte Messung der hepatischen Glukoseproduktion in einem Mausmodell mit polyzystischem Ovarialsyndrom unter Verwendung eines stabilen Isotopenglukose-Tracers über die Schwanzvene sowohl im nüchternen als auch im glukosereichen Zustand im Tandem.

Evaluierung der hepatischen Glukoseproduktion in einem Mausmodell mit polyzystischem Ovarialsyndrom

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, die hepatische Glukoseproduktion in einem polyzystischen Ovarialsyndrom oder PCOS-Mausmodell zu bestimmen. Der fehlregulierte Glukosestoffwechsel ist eine wichtige Manifestation von PCOS und der Schlüssel zu seiner Pathogenese. Daher sind Studien zur Bewertung des Glukosestoffwechsels bei PCOS von größter Bedeutung.In dieser Studie diskutieren wir Schritt-für-Schritt-Anweisungen für die Quantifizierung der Rate der hepatischen Glukoseproduktion in einem PCOS-Mausmodell durch Messung des M plus zwei Anreicherungen von sechs sechs deuterierten Glukosen, einem stabilen Isotopenglukose-Tracer, mittels Gaschromatographie, Massenspektrometrie oder GCMS. Dieses Verfahren beinhaltet die Schaffung einer stabilen isotopenförmigen Glucose-Tracer-Lösung, die Verwendung der Platzierung des Schwanzvenenkatheters und die Infusion des Glucose-Tracers sowohl im nüchternen als auch im glucosereichen Zustand in derselben Maus im Tandem. Bereiten Sie einen Tag vor dem Eingriff den stabilen Isotopenglukose-Tracer in normaler Kochsalzlösung vor.Für dieses Experiment wurde die Glukoseproduktion während des Fastens unter glukosereichen Bedingungen gemessen, so dass das Glukoseisotop in zwei verschiedenen Präparaten hergestellt wurde. Der Tracer wurde unter sterilen Bedingungen hergestellt, indem sterile und pyrogenfreie sechs sechs deuterierte Glukose und sterile 0,9% Natriumchloridlösung mit oder ohne Glukose gelöst wurden. Das erste Infusat wurde nur mit dem Tracer hergestellt.Das zweite Infusat enthielt sowohl den Tracer als auch die nichtisotopische Glukose. Sobald die Lösungen hergestellt waren, wurden sie mit dem 0,22-Mikron-Filter steril filtriert und bei vier Grad Celsius gelagert. Die Lösungen wurden so hergestellt, dass die endgültige Infusionsdosis nahe einem Milligramm pro Kilogramm und Minute bzw. zwei Milligramm pro Kilogramm und Minute lag.Für die Messung der Glukoseerscheinungsrate während des basalen Zustands im glukosereichen Zustand wurde eine grundierte durchschnittliche Infusion mit konstanter Rate von sechs sechs deuterierten Glukosen bei 1,08 Milligramm pro Kilogramm und Minute bzw. 1,9 Milligramm pro Kilogramm in Minute verwendet. Um den gefütterten Zustand nachzuahmen, verwendeten wir eine durchschnittliche D-Glucose-Infusionsrate von 18,8 Milligramm pro Kilogramm und Minute während eines glukosereichen Zustands. Entfernen Sie die Mäuse aus ihren Heimkäfigen und legen Sie sie drei Stunden vor Beginn des Experiments in ihre Fastenkäfige.Für dieses Experiment verwendeten wir vier Monate alte weibliche Mäuse aus dem Stamm C57BL6J. Stellen Sie die Käfigausrüstung zusammen, indem Sie die Mäuse in eine bestimmte Anzahl von Mäusen pro Insulinpumpe gruppieren. Platzieren Sie Trennwände auf einer flachen, stabilen Basis, um individuelle Ställe für die Mäuse zu schaffen.Die Käfige sind klar und bestehen aus Plexiglas. Es gibt eine flache, stabile Basis, auf der die Trennwände sitzen. Die Tür zum Käfig gleitet zum Schließen und hat eine Kerbe an der Unterseite, damit der Schwanz durchpassen kann.Montieren Sie die Spritzen mit einem Milliliter Basalinfusat und verbinden Sie sie dann mit dem Polyethylenschlauch mit dem Infusionspumpenschlauch. Bereiten Sie die Infusionspumpe vor, indem Sie die Rate auf 150 Mikroliter pro Stunde einstellen, was der Basalrate entspricht. Ein Wasserbad auf 48 Grad Celsius erhitzen.Bereiten Sie die Kathetereinführungsstation neben dem Wasserbad vor, die die 30-Gauge-Halbzoll-Nadeln, den Silastikschlauch und das ein Zoll große, durchsichtige Transportband enthält. Wählen Sie eine Maus aus und legen Sie sie in eine sichere Halterung mit Zugriff auf den Schwanz. Legen Sie ein Stück Klebeband über den proximalen Teil des Schwanzes, um Platz für die Kathetereinführung zu schaffen.Bringen Sie die Maus zum Wasserbad und führen Sie den Schwanz für ca. 30 bis 45 Sekunden in das Wasserbad ein. Dies hilft, das Schwanzgefäßsystem für die Katheterplatzierung zu erweitern. Die Kathetereinführung muss unter sterilen Bedingungen erfolgen.Sobald der Schwanz erwärmt ist, reinigen Sie den Schwanz und platzieren Sie eine kleine zahnlose Alligatorklemme aus Kupfer als Tourniquet am proximalen Ende des Schwanzes. Visualisieren Sie die laterale Schwanzvene unter einer Lupe. Führen Sie dann den Katheter vorsichtig in die Schwanzvene ein und spülen Sie die Lösung vorsichtig, um die Durchgängigkeit des Katheters sicherzustellen.Wickeln Sie ein Stück Transportband um die Einführstelle, um den Katheter zu sichern, und entfernen Sie das kleine Tourniquet vom Schwanz. Legen Sie die Maus in ihren individuellen Käfig und schließen Sie die Schiebetür, um sicherzustellen, dass der Schwanz durch die Kerbe herausragt und außerhalb des Käfigs bleibt. Legen Sie ein zusätzliches Stück Klebeband über den gesamten Katheter und den Schwanz, um es an der Grundplatte des Käfigs zu befestigen.Trennen Sie die Spülung vom Schwanzvenenkatheter und legen Sie die kleine Klemme auf den silastischen Schlauch des Katheters, um einen Rückfluss zu verhindern, während Sie die Infusatleitung von der Pumpe verbinden. Entfernen Sie nach dem sicheren Anschluss die Klemme und spülen Sie die Ansauglösung, die aus dem Infusat besteht. Stellen Sie sicher, dass die Lösung im Röhrchen klar und nicht blutbefleckt ist.Sobald festgestellt wird, dass die Infusionsleitungen ordnungsgemäß funktionieren, entfernen Sie die Abdeckung von der Maus. Legen Sie die Standardbettwäsche um die Maus herum. Beginnen Sie die Infusion mit dem Infusat, das den Tracer enthält, und lassen Sie ihn drei Stunden lang kontinuierlich laufen.Überprüfen Sie für die Dauer der Infusion weiterhin das Wohlbefinden der Mäuse sowie die Infusionsleitungen. Stellen Sie sicher, dass der Infusionsschlauch ordnungsgemäß gesichert ist und dass keine Lecks von den Leitungsanschlusspunkten vorhanden sind. Nachdem die erste Infusion abgeschlossen ist, stoppen Sie die Infusion und legen Sie eine Klemme auf den Schlauch des Katheters, um einen Rückfluss zu verhindern.Entfernte die Mäuse vorsichtig aus ihren Gehegen, ohne den Katheter zu stören, um Blut zu sammeln. Für dieses Experiment unterzogen sich die Mäuse einer Wangenvenenpunktion mit einer vier Millimeter langen Lanzette. Sammeln Sie ca. 75 Mikroliter Blut in Ihre gewünschte Durchstechflasche.Um Proben in Vorbereitung auf die Massenspektrometrie zu deproteinisieren, fügen Sie etwa 15 Mikroliter Blut zu 500 Mikroliter Aceton hinzu. Verbleibendes Blut kann verwendet werden, um den Blutzuckerspiegel über ein Glucometer und/oder eine Zentrifuge zur Trennung des Plasmas für zukünftige Hormonassays zu überprüfen. Entfernen Sie das Infusat aus den Spritzenpumpen, indem Sie den Schlauch von den Spritzen trennen, und ersetzen Sie ihn durch das zweite Infusat, das Tracer zusammen mit Glukose enthält.Wiederholen Sie die vorherigen Infusionsschritte mit der glukosereichen Isotopenglukoseinfusion. Um einen stationären Zustand zu erreichen, lassen Sie einen Bolus der sekundeinfusat mit 600 Mikroliter pro Stunde für 15 Minuten laufen. Notieren Sie sich die Startzeit für jede Gruppe von Käfigen.Verringern Sie die Infusionsrate auf 150 Mikroliter pro Stunde, um die drei Stunden Gesamtinfusionszeit zu vervollständigen. Wiederholen Sie die Blutentnahme wie zuvor beschrieben. Trennen Sie die Infusionen, üben Sie Druck auf die Katheterstellen aus, bis die Blutung aufhört, und bringen Sie die Mäuse in ihre Heimkäfige zurück.Als nächstes werden die Proben für GCMS gesendet. Berechnen Sie die Isotopenanreicherung des Glucoseisotops unter Glucose Peak durch GCCMS unter Verwendung des Pentaacetatderivats. Kurz gesagt, diese Methode beinhaltet die Herstellung des Pentaacetatderivats von Glucose, gefolgt von einer Probenanalyse unter Verwendung von GCMS im positiven chemischen Ionisationsmodus.Eine selektive Ionenüberwachung des Masse-Ladungs-Verhältnisses von 171 zu 169 wird durchgeführt, um das M plus zwei Anreicherungen des Glukoseisotops zu bestimmen. Alle kinetischen Messungen werden unter der Annahme stationärer Bedingungen durchgeführt. Berechnen Sie die Gesamtplasmaglukoseerscheinungsrate aus dem M plus zwei Anreicherungen des Glukoseisotops und des Plasmas unter Verwendung etablierter Isotopenverdünnungsgleichungen.Unter stationären Bedingungen wird angenommen, dass die Rate des Auftretens von Glukose gleich der Rate des Verschwindens von Glukose ist. Die Rate der endogenen Glukoseproduktion entspricht der Gesamtplasmaglukoserate abzüglich der exogenen Glukose. Tabelle eins enthält die repräsentativen Ergebnisse der Studie.Alle Einheiten werden als Milligramm pro Kilogramm und Minute ausgedrückt. Unter Verwendung zuvor beschriebener Isotopenverdünnungsgleichungen wurde die Gesamtplasmaglukoserate berechnet. In der Kontrollgruppe betrug die mittlere Glukoserate im Nüchternzustand 19,98.Unter glukosereichen Bedingungen betrug die Glukoserate des Aussehens 25,8. Die Glukoseproduktionsrate betrug 19,08 im Nüchternzustand und 8,56 im glukosereichen Zustand. Abnormaler Glukosestoffwechsel und Homöostase sind bei PCOS häufig.Bei Störungen des abnormalen Glukosestoffwechsels ist die Regulierung der Unterdrückung der Glukoseproduktion beeinträchtigt, was zu Hyperglykämie führt. In dieser Studie beschreiben wir eine einfache Möglichkeit, die Rate der hepatischen Glukoseproduktion bei mehreren Mäusen gleichzeitig zu messen. Die kritischen Komponenten dieses Experiments sind die Kathetereinführung und die Definition der genauen Messungen des Glukoseisotops und der natürlichen Glukose, um GCMS angemessen durchzuführen.Die Vorteile der Studie bestehen darin, die Infusion auf minimal-invasive Weise aufgrund der Einsetzen des Schwanzvenenkatheters durchzuführen, sowie die Verwendung eines leicht erreichbaren, stabilen Glukose-Tracers. Es gibt einige Einschränkungen für das Studium, einschließlich der technischen Anforderung des Verfahrens und der Notwendigkeit möglicher zusätzlicher Fähigkeiten. Insgesamt beschreiben wir eine einfache, genaue Methode, um die Rate der gesamten hepatischen Glukoseproduktion in einem PCOS-Mausmodell zu messen.Diese Technik könnte als Grundlage für mehrere Studien mit Glukosestoffwechsel von Mausmodellen dienen.

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