Name: evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model
Uploaded: 2022-03-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הכשרה על ידי המחלקה למיילדות וגינקולוגיה, מכללת ביילור לרפואה (ALG) ומענק מחקר R-01 (מענק # DK114689) עבור CSB, SC ו- JM מהמכונים הלאומיים לבריאות.

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של מכללת ביילור לרפואה.
1. הכנת [6,6-2H2]גלוקוז
<ol><li>יום אחד לפני ההליך, להכין את מאתר גלוקוז איזוטופ יציב מלוחים רגילים. בניסוי זה, [6,6-2H2]גלוקוז שימש כמעקב למדידת קצב ...

<ol>
	<li>March, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+polycystic+ovary+syndrome+in+a+community+sample+assessed+under+contrasting+diagnostic+criteria.">The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).</li><li>Yildiz, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+phenotype+and+cardiometabolic+risk+of+polycystic+ovary+syndrome+under+different+diagnostic+criteria.">Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+2003+consensus+on+diagnostic+criteria+and+long-term+health+risks+related+to+polycystic+ovary+syndrome.">Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).</li><li>Goodarzi, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+ovary+syndrome:+etiology,+pathogenesis+and+diagnosis.">Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).</li><li>Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction:+Determinants+of+polycystic+ovary+syndrome.">Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).</li><li>Baskind, N. E., Balen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic-pituitary,+ovarian+and+adrenal+contributions+to+polycystic+ovary+syndrome.">Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome.</a> Best Practice and Research. Clinical Obstetrics &amp; Gynaecology. 37, 80-97 (2016).</li><li>Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+hyperandrogenism+with+hyperinsulinism+in+polycystic+ovarian+disease.">Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).</li><li>Bremer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+ovary+syndrome+in+the+pediatric+population.">Polycystic ovary syndrome in the pediatric population.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+insulin+receptor+serine+phosphorylation+in+cultured+fibroblasts+and+in+skeletal+muscle.+A+potential+mechanism+for+insulin+resistance+in+the+polycystic+ovary+syndrome.">Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).</li><li>H&#248;jlund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin-stimulated+phosphorylation+of+Akt+and+AS160+in+skeletal+muscle+of+women+with+polycystic+ovary+syndrome+is+reversed+by+pioglitazone+treatment.">Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment.</a> Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).</li><li>Moghetti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergences+in+insulin+resistance+between+the+different+phenotypes+of+the+polycystic+ovary+syndrome.">Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).</li><li>Ovalle, F., Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance,+polycystic+ovary+syndrome,+and+type+2+diabetes+mellitus.">Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus.</a> Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profound+peripheral+insulin+resistance,+independent+of+obesity,+in+polycystic+ovary+syndrome.">Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome.</a> Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).</li><li>Hutchison, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+exercise+on+insulin+resistance+and+body+composition+in+overweight+and+obese+women+with+and+without+polycystic+ovary+syndrome.">Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).</li><li>Stepto, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Women+with+polycystic+ovary+syndrome+have+intrinsic+insulin+resistance+on+euglycaemic-hyperinsulaemic+clamp.">Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp.</a> Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).</li><li>Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+fasting+glucose+production+and+disappearance+are+abnormal+in+people+with+&amp;#34;mild&amp;#34;+and+&amp;#34;severe&amp;#34;+type+2+diabetes.">Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with &amp;#34;mild&amp;#34; and &amp;#34;severe&amp;#34; type 2 diabetes.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).</li><li>Blesson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+dependent+dysregulation+of+hepatic+glucose+production+in+lean+Type+2+diabetic+rats.">Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 538 (2019).</li><li>Caldwell, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+reproductive,+metabolic,+and+endocrine+features+of+polycystic+ovary+syndrome+in+female+hyperandrogenic+mouse+models.">Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models.</a> Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).</li><li>Chappell, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+androgen+induced+lean+PCOS+impairs+mitochondria+and+mRNA+profiles+in+oocytes.">Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes.</a> Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+gluconeogenesis+using+glucose+fragments+and+mass+spectrometry+after+ingestion+of+deuterium+oxide.">Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).</li><li>Bier, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&amp;#34;true&amp;#34;+glucose+production+rates+in+infancy+and+childhood+with+6,6-dideuteroglucose.">Measurement of &amp;#34;true&amp;#34; glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose.</a> Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).</li><li>Chacko, S. K., Sunehag, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenesis+continues+in+premature+infants+receiving+total+parenteral+nutrition.">Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition.</a> Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ghrelin+on+glucose+regulation+in+mice.">Effect of ghrelin on glucose regulation in mice.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-surgical+alternatives+to+invasive+procedures+in+mice.">Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice.</a> Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).</li><li>Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+artery+infusions+for+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+analysis+of+taxanes+in+mice.">Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).</li><li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+conscious,+unrestrained+mice.">Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).</li><li>Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Intravenous+Self+Administration+in+a+Mouse+Model.">Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+urea+kinetic+studies+in+conscious+mice.">In vivo urea kinetic studies in conscious mice.</a> The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).</li><li>Choukem, S. -. P., Gautier, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+hepatic+insulin+resistance.">How to measure hepatic insulin resistance.</a> Diabetes Metabolism. 34 (6), 664-673 (2008).</li></ol>

היפרגליקמיה ומטבוליזם גלוקוז חריג/הומאוסטזיס הם תכונות של PCOS. רמת הגלוקוז בדם נשמרת על ידי שילוב של גלוקוז מתזונה וייצור גלוקוז באמצעות גליקוגנוליזה וגלוקונוגנזה וגליקוגנזה, בשליטת הורמון ואנזימים. ייצור גלוקוז בכבד מדוכא על ידי נוכחות של רמות גלוקוז במחזור מוגבר. בהפרעות של חילוף ...

תסמונת השחלות הפוציסטיות (PCOS) היא הפרעה נפוצה המתרחשת ב 12%-20% של נשים בגיל הרבייה1,2. זוהי מחלה מורכבת וכתוצאה מכך פנוטיפים משתנים מעורבים שחלות פוליציסטיות, menses לא סדיר וראיות קליניות או מעבדה של hyperandrogenemia, והוא מאובחן בדרך כלל כאשר אישה עומדת בשניים משלושת הקריטריונים3. היבט דומיננטי של PCOS, וגורם מפתח בפתוגנזה שלה, הוא דעים מטבוליים שנמצאים אצל נשים שיש להם את המחלה. נשים עם PCOS יש שכיחות גבוהה יותר של תנגודת לאינסולין, אי סבילות לגלוקוז, השמנת יתר, תסמונת מטבולית3,4,5,6. תנגודת לאינסולין היא לא רק ביטוי של המחלה, אבל הוא חשב לתרום פתוגנזה שלה על ידי potentiating הפעולה של הורמון תחליב בשחלה ובכך מוביל ייצור אנדרוגן מוגבר7,8. תנגודת לאינסולין נחשבת יש מספר מקורות אפשריים אבל מחקרים מראים שזה יכול להיות בגלל דפוסים חריגים של קולטן אינסולין איתות9,10. מחקרים העריכו עמידות לאינסולין בחולי PCOS באמצעות טכניקת הזהב הסטנדרטית של מלחציים היפראינסולנמיים-אוגליקמיים11,12,13,14,15. לנשים עם PCOS, ללא קשר ל- BMI, יש רמות גבוהות יותר של תנגודת לאינסולין בהשוואה לבקרות. בקרת אינסולין על ייצור גלוקוז נפגעת בהפרעות של תנגודת לאינסולין המובילה לייצור עודף גלוקוז. לדוגמה, חולי סוכרת יש שיעורים מוגברים של gluconeogenesis ודיכוי לקוי של גליקוגנוליזה16. יתר על כן, דיכוי לקוי של ייצור גלוקוז נצפתה בחולדות סוכרת17. למרות שמחקרים מהדקים יכולים לתת מדידה של תנגודת לאינסולין, מחקרים מעטים ב- PCOS מתמקדים במדידה ישירה של ייצור גלוקוז במדינות צום ומזון. זה דורש שימוש עירוי מעקב איזוטופי איזוטופי לא רדיואקטיבי ומדידה באמצעות ספקטרומטריית מסה.
דגמים של בעלי חיים שימשו בהרחבה במחקר PCOS. מודלים מוריניים PCOS רזה והשמנת יתר נוצרו על ידי מתן אנדרוגנים לפני ההפלגה, prepubertally, או לאחר pubertally18. דגמי PCOS מכרסמים מדגימים גם הבדלים מטבוליים בהשוואה לבקרות שלהם. נתונים קודמים מהמעבדה שלנו הדגימו בדיקות סובלנות גלוקוז חריגות (GTT) בדגמי עכבר PCOS (רזה והשמנת יתר), העולים בקנה אחד עם ספרות PCOS אנושית19. שימוש במודל בעלי חיים רזה והשמנת יתר מאפשר חקירה נוספת של הבדלים מטבוליים. באופן ספציפי, מודל זה מאפשר הערכה של קצב ייצור הגלוקוז ישירות באמצעות מעקב גלוקוז איזוטופי. אחד ממעקב הגלוקוז האיזוטופי היציב הנפוץ ביותר הוא [6,6-2H2]גלוקוז. ניתן למדוד את העשרת הגלוקוז [6,6-2H2]באמצעות נגזרת פנטאצטאט כפי שתואר קודם לכן20.
במחקר זה, המטרה שלנו הייתה למדוד את קצב ייצור הגלוקוז בכבד בצום ובמצב עשיר בגלוקוז בעכברים PCOS באמצעות עירוי גלוקוז איזוטופי. טכניקות אלה ניתן ליישם על מגוון רחב של ניסויים מעורבים קינטיקה גלוקוז.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride solution</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>275595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL BD Luer-Lok tip syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75846-756</td>
			<td>Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch clear transpore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200400169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch Labeling tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe containing heparanized saline flush</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>191-MIH-2235</td>
			<td>One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9891620</td>
			<td>5 mm if animal is between 2 and 6 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced hot plate stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-602</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 27 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Health Warehouse</td>
			<td>A283952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Medvet</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, 1000 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caging pellets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear VOA glass vials with closed-top cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-719-120</td>
			<td>For storage of acetone and blood draw samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper toothless alligator clamp for tourniquet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (6,6-D2, 99%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td>DLM-349-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62999-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>Ohaus Adventurer Pro</td>
			<td>AV264C</td>
			<td>Any similar model with 0.0001g accuracy can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene bottle, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0158-12EA</td>
			<td>Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD Ultra multi-syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3024A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheets and dividers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; used to cage mice during infusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model

תסמונת השחלות הפוליצסטיות (PCOS) היא מחלה נפוצה המביאה להפרעות בחילוף החומרים של גלוקוז, כגון עמידות לאינסולין ואי סבילות לגלוקוז. חילוף החומרים של גלוקוז Dysregulated הוא ביטוי חשוב של המחלה והוא המפתח לפתוגנזה שלה. לכן, מחקרים מעורבים הערכה של חילוף החומרים גלוקוז ב- PCOS הם בעלי חשיבות עליונה. מעט מאוד מחקרים כימתו את ייצור הגלוקוז בכבד ישירות בדגמי PCOS באמצעות מעקבים לא רדיואקטיביים של גלוקוז. במחקר זה, אנו דנים בהוראות שלב אחר שלב לכימות קצב ייצור הגלוקוז בכבד במודל עכבר PCOS על ידי מדידת העשרה M+2 של [6,6-2H2]גלוקוז, מעקב גלוקוז איזוטופי יציב, באמצעות כרומטוגרפיה של גז - ספקטרומטריית מסה (GCMS). הליך זה כרוך ביצירת פתרון מעקב איזוטופי יציב, שימוש במיקום צנתר וריד הזנב ועירוי של נותב הגלוקוז הן בצום והן במצבים עשירים בגלוקוז באותו עכבר במקביל. ההעשרה של [6,6-2H2]] גלוקוז נמדדת באמצעות נגזרת פנטאצטאט ב- GCMS. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מחקרים מעורבים מדידה ישירה של קצב ייצור הגלוקוז בכבד.

באמצעות משוואות דילול איזוטופ שתוארו בעבר, שיעור הגלוקוז הכולל בפלזמה (גלוקוזRa) חושב מהעשרה M+2 של [6,6-2H2]גלוקוז בתנאי צום וגלוקוז עשירים בגלוקוז באמצעות נגזרת המחומש21. בתנאים יציבים, ההנחה היא כי שיעור המראה של גלוקוז שווה לקצב היעלמות הגלוקוז. בקבוצת הביקורת,...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model at JoVE.com

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

מחקר זה מתאר את המדידה הישירה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי באמצעות מעקב גלוקוז איזוטופי יציב באמצעות וריד הזנב הן בצום והן במצבים עשירים בגלוקוז יחד.

הערכה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

מטרת הליך זה היא לקבוע את ייצור הגלוקוז בכבד בתסמונת השחלות הפוליטיות, או במודל העכבר PCOS. חילוף החומרים של גלוקוז Dysregulated הוא ביטוי חשוב של PCOS והוא המפתח לפתוגנזה שלה. לכן, מחקרים מעורבים הערכה של חילוף החומרים גלוקוז ב- PCOS הם בעלי חשיבות עליונה.במחקר זה, אנו דנים בהוראות שלב אחר שלב לכימות קצב ייצור הגלוקוז בכבד במודל עכבר PCOS על ידי מדידת M ועוד שתי העשרה של שישה גלוקוז דויטוש, מעקב גלוקוז איזוטופי יציב, באמצעות כרומטוגרפיה של גז, ספקטרומטריית מסה, או GCMS. הליך זה של כרוך ביצירת פתרון מעקב איזוטופי יציב, שימוש במיקום צנתר וריד הזנב ועירוי של נותב גלוקוז הן בצום והן במצבים עשירים בגלוקוז באותו עכבר במקביל. יום אחד לפני ההליך, להכין את מאתר גלוקוז איזוטופ יציב מלוחים רגילים.לניסוי זה נמדד ייצור גלוקוז במהלך הצום בתנאים עשירים בגלוקוז ולכן איזוטופ הגלוקוז הוכן בשתי תכשירים שונים. העוקב הוכן בתנאים סטריליים על ידי המסת סטרילית ונגירת פירוגן שישה גלוקוז מפורגן ופתרון סטרילי של 0.9% נתרן כלורי עם או בלי גלוקוז. ההטמט הראשון הוכן רק עם הנותב.האינפוזאט השני הכיל גם את העוקב וגם את הגלוקוז הלא-איזוטופי. ברגע שהפתרונות הוכנו, הם היו סטריליים מסוננים עם מסנן 0.22 מיקרון ומאוחסנים בארבע מעלות צלזיוס. הפתרונות הוכנו באופן כזה שמינון ההחדרה הסופי היה קרוב למיליגרם אחד לקילוגרם ודקה ושני מיליגרם לקילוגרם ודקה בהתאמה.למדידת שיעור הופעת הגלוקוז במהלך מצב בסיסי במצב עשיר בגלוקוז, נעשה שימוש בעירוי קבוע ממוצע של שישה 6 גלוקוז מפוברק ב-1.08 מיליגרם לקילוגרם ודקה ו-1.9 מיליגרם לק"ג בדקה בהתאמה. על מנת לחקות את מצב הפד, השתמשנו בשיעור עירוי D-גלוקוז ממוצע של 18.8 מיליגרם לקילוגרם ודקה במהלך מצב עשיר בגלוקוז. מוציאים את העכברים מכלובי הבית שלהם, ומניחים אותם בכלובי הצום שלהם שלוש שעות לפני תחילת הניסוי.לניסוי זה, השתמשנו בעכברות בנות ארבעה חודשים מזן C57BL6J. להרכיב את ציוד caging על ידי קיבוץ העכברים למספר מוגדר של עכברים לכל משאבת אינסולין. מניחים מחיצות על בסיס שטוח ויציב כדי ליצור דוכנים בודדים לעכברים.הכלובים נקיים ועשויים מפלקסיגלס. יש בסיס שטוח ויציב שעליו יושבות המחיצות. הדלת לכלוב מחליקה להיסגר ויש לה חריץ בתחתית כדי לאפשר לזנב להיכנס.להרכיב את המזרקים המכילים מיליליטר אחד של אינפוסאט בזאלי, ולאחר מכן להתחבר צינורות משאבת עירוי באמצעות צינורות פוליאתילן. הכן את משאבת העירוי על ידי הגדרת הקצב ל 150 microliters לשעה, שהוא קצב הבסיס. מחממים אמבט מים ל-48 מעלות צלזיוס.הכן את תחנת החדרת הצנתר הסמוכה לאמבט המים המכילה את מחטי 30 מד חצי אינץ ', צינורות סילאסטיים, וקלטת הובלה באורך אינץ '. בחר עכבר אחד והצב אותו במחזיק מאובטח עם גישה לזנב. מניחים פיסת סרט על החלק הפרוקסימלי של הזנב כדי לאפשר מקום להכנסת הצנתר בצורה מרוקנת יותר.להביא את העכבר לאמבט המים, ולהכניס את הזנב באמבט המים במשך כ 30 עד 45 שניות. זה עוזר להרחיב את כלי הזנב עבור מיקום קטטר. החדרת הצנתר חייבת להיעשות בתנאים סטריליים.לאחר שהזנב מתחמם, נקו את הזנב, והנחו מהדק תנין קטן ללא שיניים מנחושת כחוסם עורקים בקצה הפרוקסימלי של הזנב. דמיינו את וריד הזנב לרוחב תחת זכוכית מגדלת. לאחר מכן, בזהירות להכניס את הקטטר לתוך הווריד הזנב, לשטוף את הפתרון בעדינות כדי להבטיח patency של הקטטר.עטפו פיסת סרט תובלה סביב אתר ההחדרה כדי לאבטח את הקטטר, והסירו את חוסם העורקים הקטן מהזנב. מניחים את העכבר בכלוב הבודד שלו וסוגרים את דלת ההזזה, ומבטיחים שהזנב יתבלט דרך החריץ ויישאר מחוץ לכלוב. מניחים פיסת סרט נוספת על כל הקטטר והזנב כדי לאבטח אותו ללוח הבסיס של הכלוב.נתק את הסומק מצנתר הוורידים האחוריים, והנח את המלחציים הקטנים על הצינור הסילאסטי של הצנתר כדי למנוע זרימה אחורית תוך חיבור קו ההחדרה מהמשאבה. לאחר חיבור מאובטח, להסיר את המהדק לשטוף את פתרון priming אשר מורכב infusate. ודא כי הפתרון ברור בצינור ולא מוכתם בדם.לאחר קווי עירוי הם ציינו לתפקד כראוי, להסיר את הכיסוי מן העכבר. מקם מצעים סטנדרטיים סביב העכבר. התחל את עירוי עם infusate המכיל את המעקב, ולהפעיל אותו במשך שלוש שעות ברציפות.למשך העירוי, להמשיך לבדוק את רווחת העכברים, כמו גם את קווי עירוי. ודא כי צינורות עירוי מאובטח כראוי וכי אין דליפות מנקודות החיבור של הקו. לאחר העירוי הראשון הושלם, לעצור את עירוי ולהניח מלחציים על צינורות של הצנתר כדי למנוע זרימה אחורית.הסירו בעדינות את העכברים מהמתחמים שלהם מבלי להפריע לצנתר כדי לאסוף דם. לניסוי זה, העכברים עברו ניקוב וריד הלחי באמצעות רומח ארבעה מילימטר. לאסוף כ 75 microliters של דם לתוך המשחקון הרצוי שלך.כדי deproteinize דגימות כהכנה ספקטרומטריית מסה, להוסיף כ 15 microliters של דם ל 500 microliters של אצטון. ניתן להשתמש בדם הנותר כדי לבדוק את רמת הגלוקוז בדם באמצעות גלוקומטר ו/או צנטריפוגה כדי להפריד פלזמה לבדיקות הורמונים עתידיות. הסר את infusate מן משאבות המזרק על ידי ניתוק הצינורות מן המזרקים, ולהחליף אותו עם infusate השני המכיל נותב יחד עם גלוקוז.חזור על שלבי עירוי קודמים באמצעות עירוי גלוקוז איזוטופי עשיר גלוקוז. כדי להגיע למצב יציב, הפעל בולוס של החדירה השנייה ב 600 מיקרוליטרים לשעה במשך 15 דקות. שים לב לזמן ההתחלה עבור כל קבוצה של כלובים.להקטין את שיעור עירוי ל 150 microliters לשעה כדי להשלים את שלוש שעות של זמן עירוי הכולל. דגימת דם חוזרת כפי שתואר בעבר. לנתק חליטות, להפעיל לחץ באתרי הצנתר עד הדימום מפסיק, ולהחזיר את העכברים לכלובים הביתיים שלהם.לאחר מכן, הדגימות נשלחות עבור GCMS. חשב את ההעשרה האיזוטופית של איזוטופ גלוקוז תחת שיא גלוקוז על ידי GCCMS באמצעות נגזרת פנטאצטאט. בקצרה, שיטה זו כרוכה בהכנת נגזרת המחומש של גלוקוז, ואחריה ניתוח מדגם באמצעות GCMS במצב יינון כימי חיובי.ניטור יון סלקטיבי של יחס המסה לטעינה, 171 עד 169, מבוצע כדי לקבוע את M ועוד שתי העשרה של איזוטופ גלוקוז. כל המדידות הקינטיות מבוצעות בתנאי מצב יציבים. חשב את קצב המראה הכולל של גלוקוז פלזמה מ M ועוד שני העשרה של איזוטופ גלוקוז ופלזמה באמצעות משוואות דילול איזוטופ הוקמה.בתנאי מצב יציבים, ההנחה היא כי שיעור המראה של גלוקוז שווה לקצב היעלמות הגלוקוז. קצב ייצור הגלוקוז האדוגוגני שווה לשיעור הגלוקוז הכולל בפלזמה פחות גלוקוז אקסוגני. טבלה 1 כוללת את התוצאות הייצוגיות מהמחקר.כל היחידות מתבטאות כמיליגרם לקילוגרם ודקה. באמצעות משוואות דילול איזוטופ שתוארו בעבר, חושב שיעור הגלוקוז הכולל של הפלזמה. בקבוצת הביקורת, שיעור הגלוקוז הממוצע של המראה היה 19.98 במצב הצום.בתנאים עשירים בגלוקוז, שיעור הגלוקוז של המראה היה 25.8. קצב ייצור הגלוקוז היה 19.08 במצב הצום ו-8.56 במצב העשיר בגלוקוז. חילוף חומרים חריג של גלוקוז והומיוסטזיס נפוצים ב-PCOS.בהפרעות של חילוף חומרים חריג של גלוקוז, ויסות של דיכוי ייצור גלוקוז נפגעת המובילה להיפרגליקמיה. במחקר זה, אנו מתארים דרך פשוטה למדוד את קצב ייצור הגלוקוז בכבד בעכברים מרובים בו זמנית. המרכיבים הקריטיים של ניסוי זה הם החדרת קטטר והגדרת המדידות המדויקות של איזוטופ הגלוקוז והגלוקוז הטבעי על מנת לבצע כראוי GCMS.היתרונות של המחקר הוא השגת עירוי בצורה זעיר פולשנית עקב החדרת צנתר וריד הזנב, כמו גם שימוש במעקב גלוקוז קל להשגה ויציב. ישנן כמה מגבלות למחקר, כולל הדרישה הטכנית של ההליך והצורך בכישורים נוספים אפשריים. בסך הכל, אנו מתארים דרך פשוטה ומדויקת למדוד את קצב ייצור הגלוקוז הכולל בכבד במודל עכבר PCOS.טכניקה זו יכולה לשמש כבסיס למחקרים מרובים מעורבים חילוף החומרים גלוקוז של מודלים עכבר.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

Tumour Murine Bioluminescent כבדית דגם

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

דגם Murine פרה של גרורות כבדית

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

מודל אפשרי דג הזברה של מחלת כליות פוליציסטיות: מציאה של<em&gt; Wnt5a</em&gt; גורם ציסטות בכליות דג הזברה

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

הערכה של תת-יקוציט חדירת גידול בדגם גידול תת עורי

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

דלדול פעילי שטח הנגרמת שטיפה בחזירים כמודל של תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

דור של כבד עכבר אנושי באמצעות תאי גזע אנושי כבדיה

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Invasive Hemodynamic Characterization of the Portal-hypertensive Syndrome in Cirrhotic Rats

אפיון והמודינמיקה פולשנית של התסמונת פורטל-יתר לחץ דם אצל חולדות זה קשה וחיוור.

This is a detailed protocol describing invasive hemodynamic measurements in cirrhotic rats for the characterization of portal hypertensive syndrome. ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

הזרקת חומצה אולאית חזירים כמודל עבור תסמונת מצוקה נשימתית חריפה

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

מתוקננת הערכה היסטראורמטרית של אוסטיאוארתריטיס במודל עכבר כירורגי

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...