Name: evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model
Uploaded: 2022-03-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni di formazione dal Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia, Baylor College of Medicine (ALG) e R-01 research grant (Grant # DK114689) per CSB, SC e JM dal National Institutes of Health.

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Baylor College of Medicine.
1. Preparazione di [6,6-2H2]glucosio
<ol><li>Un giorno prima della procedura, preparare il tracciante di glucosio isotopico stabile in soluzione salina normale. Per questo esperimento, il glucosio [6,6-2H2] è stato usato come tracciante per misurare il tasso di comparsa del glucosio plasmatico....

<ol>
	<li>March, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+polycystic+ovary+syndrome+in+a+community+sample+assessed+under+contrasting+diagnostic+criteria.">The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).</li><li>Yildiz, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+phenotype+and+cardiometabolic+risk+of+polycystic+ovary+syndrome+under+different+diagnostic+criteria.">Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+2003+consensus+on+diagnostic+criteria+and+long-term+health+risks+related+to+polycystic+ovary+syndrome.">Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).</li><li>Goodarzi, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+ovary+syndrome:+etiology,+pathogenesis+and+diagnosis.">Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).</li><li>Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction:+Determinants+of+polycystic+ovary+syndrome.">Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).</li><li>Baskind, N. E., Balen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic-pituitary,+ovarian+and+adrenal+contributions+to+polycystic+ovary+syndrome.">Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome.</a> Best Practice and Research. Clinical Obstetrics &amp; Gynaecology. 37, 80-97 (2016).</li><li>Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+hyperandrogenism+with+hyperinsulinism+in+polycystic+ovarian+disease.">Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).</li><li>Bremer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+ovary+syndrome+in+the+pediatric+population.">Polycystic ovary syndrome in the pediatric population.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+insulin+receptor+serine+phosphorylation+in+cultured+fibroblasts+and+in+skeletal+muscle.+A+potential+mechanism+for+insulin+resistance+in+the+polycystic+ovary+syndrome.">Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).</li><li>H&#248;jlund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin-stimulated+phosphorylation+of+Akt+and+AS160+in+skeletal+muscle+of+women+with+polycystic+ovary+syndrome+is+reversed+by+pioglitazone+treatment.">Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment.</a> Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).</li><li>Moghetti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergences+in+insulin+resistance+between+the+different+phenotypes+of+the+polycystic+ovary+syndrome.">Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).</li><li>Ovalle, F., Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance,+polycystic+ovary+syndrome,+and+type+2+diabetes+mellitus.">Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus.</a> Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profound+peripheral+insulin+resistance,+independent+of+obesity,+in+polycystic+ovary+syndrome.">Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome.</a> Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).</li><li>Hutchison, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+exercise+on+insulin+resistance+and+body+composition+in+overweight+and+obese+women+with+and+without+polycystic+ovary+syndrome.">Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).</li><li>Stepto, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Women+with+polycystic+ovary+syndrome+have+intrinsic+insulin+resistance+on+euglycaemic-hyperinsulaemic+clamp.">Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp.</a> Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).</li><li>Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+fasting+glucose+production+and+disappearance+are+abnormal+in+people+with+&amp;#34;mild&amp;#34;+and+&amp;#34;severe&amp;#34;+type+2+diabetes.">Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with &amp;#34;mild&amp;#34; and &amp;#34;severe&amp;#34; type 2 diabetes.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).</li><li>Blesson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+dependent+dysregulation+of+hepatic+glucose+production+in+lean+Type+2+diabetic+rats.">Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 538 (2019).</li><li>Caldwell, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+reproductive,+metabolic,+and+endocrine+features+of+polycystic+ovary+syndrome+in+female+hyperandrogenic+mouse+models.">Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models.</a> Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).</li><li>Chappell, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+androgen+induced+lean+PCOS+impairs+mitochondria+and+mRNA+profiles+in+oocytes.">Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes.</a> Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+gluconeogenesis+using+glucose+fragments+and+mass+spectrometry+after+ingestion+of+deuterium+oxide.">Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).</li><li>Bier, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&amp;#34;true&amp;#34;+glucose+production+rates+in+infancy+and+childhood+with+6,6-dideuteroglucose.">Measurement of &amp;#34;true&amp;#34; glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose.</a> Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).</li><li>Chacko, S. K., Sunehag, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenesis+continues+in+premature+infants+receiving+total+parenteral+nutrition.">Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition.</a> Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ghrelin+on+glucose+regulation+in+mice.">Effect of ghrelin on glucose regulation in mice.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-surgical+alternatives+to+invasive+procedures+in+mice.">Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice.</a> Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).</li><li>Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+artery+infusions+for+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+analysis+of+taxanes+in+mice.">Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).</li><li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+conscious,+unrestrained+mice.">Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).</li><li>Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Intravenous+Self+Administration+in+a+Mouse+Model.">Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+urea+kinetic+studies+in+conscious+mice.">In vivo urea kinetic studies in conscious mice.</a> The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).</li><li>Choukem, S. -. P., Gautier, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+hepatic+insulin+resistance.">How to measure hepatic insulin resistance.</a> Diabetes Metabolism. 34 (6), 664-673 (2008).</li></ol>

L'iperglicemia e il metabolismo anormale del glucosio / omeostasi sono caratteristiche della PCOS. Il livello di glucosio nel sangue è mantenuto da una combinazione di glucosio dalla dieta e produzione di glucosio attraverso la glicogenolisi e la gluconeogenesi e la glicogenesi, sotto il controllo di ormoni ed enzimi. La produzione epatica di glucosio è soppressa dalla presenza di un aumento dei livelli di glucosio circolante. Nei disturbi del metabolismo anormale del glucosio, la regolazione della soppression...

La sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) è una malattia comune che si verifica nel 12%-20% delle donne in età riproduttiva1,2. È una malattia complessa che provoca fenotipi variabili che coinvolgono ovaie policistiche, mestruazioni irregolari e prove cliniche o di laboratorio di iperandrogenemia, e viene tipicamente diagnosticata quando una donna soddisfa due dei tre criteri3. Un aspetto predominante della PCOS, e un fattore chiave nella sua patogenesi, sono gli squilibri metabolici che si trovano nelle donne che hanno la malattia. Le donne con PCOS hanno una maggiore incidenza di insulino-resistenza, intolleranza al glucosio, obesità e sindrome metabolica3,4,5,6. La resistenza all'insulina non è solo una manifestazione della malattia, ma si pensa che contribuisca alla sua patogenesi potenziando l'azione dell'ormone luteinizzante nell'ovaio portando così ad un aumento della produzione di androgeni7,8. Si ritiene che la resistenza all'insulina abbia diverse possibili origini, ma gli studi suggeriscono che potrebbe essere dovuta a modelli anormali di segnalazione del recettore dell'insulina9,10. Gli studi hanno valutato la resistenza all'insulina nei pazienti con PCOS utilizzando la tecnica gold standard del morsetto iperinsulinemico-euglicemico11,12,13,14,15. Le donne con PCOS, indipendentemente dal BMI, hanno livelli più elevati di insulino-resistenza rispetto ai controlli. Il controllo dell'insulina sulla produzione di glucosio è compromesso nei disturbi della resistenza all'insulina che portano alla produzione eccessiva di glucosio. Ad esempio, i pazienti diabetici hanno un aumento dei tassi di gluconeogenesi e una ridotta soppressione della glicogenolisi16. Inoltre, è stata osservata una ridotta soppressione della produzione di glucosio nei ratti diabetici17. Sebbene gli studi sui morsetti possano fornire una misurazione della resistenza all'insulina, pochi studi sulla PCOS si concentrano sulla misurazione diretta della produzione di glucosio negli stati di digiuno e alimentazione. Ciò richiede l'uso di un'infusione di traccianti di glucosio isotopico non radioattivo e la misurazione tramite spettrometria di massa.
I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca sulla PCOS. Sia i modelli murini di PCOS magri che quelli obesi sono stati creati somministrando androgeni prenatale, prepubertale o post-puberale18. I modelli di PCOS dei roditori dimostrano anche differenze metaboliche rispetto ai rispettivi controlli. Dati precedenti del nostro laboratorio hanno dimostrato test di tolleranza al glucosio anormali (GTT) in modelli murini PCOS (magri e obesi), coerenti con la letteratura PCOS umana19. L'uso di un modello animale magro e obeso consente ulteriori indagini sulle differenze metaboliche. Nello specifico, questo modello consente di valutare il tasso di produzione di glucosio direttamente utilizzando traccianti isotopici del glucosio. Uno dei traccianti isotopici del glucosio stabile più comunemente usato è il glucosio [6,6-2H2]. L'arricchimento del glucosio [6,6-2H2] può essere misurato utilizzando un derivato del pentaacetato come descritto in precedenza20.
In questo studio, il nostro obiettivo era misurare il tasso di produzione di glucosio epatico a digiuno e allo stato ricco di glucosio nei topi PCOS utilizzando l'infusione isotopica di glucosio. Queste tecniche possono essere applicate a una vasta gamma di esperimenti che coinvolgono la cinetica del glucosio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride solution</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>275595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL BD Luer-Lok tip syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75846-756</td>
			<td>Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch clear transpore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200400169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch Labeling tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe containing heparanized saline flush</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>191-MIH-2235</td>
			<td>One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9891620</td>
			<td>5 mm if animal is between 2 and 6 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced hot plate stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-602</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 27 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Health Warehouse</td>
			<td>A283952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Medvet</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, 1000 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caging pellets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear VOA glass vials with closed-top cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-719-120</td>
			<td>For storage of acetone and blood draw samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper toothless alligator clamp for tourniquet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (6,6-D2, 99%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td>DLM-349-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62999-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>Ohaus Adventurer Pro</td>
			<td>AV264C</td>
			<td>Any similar model with 0.0001g accuracy can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene bottle, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0158-12EA</td>
			<td>Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD Ultra multi-syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3024A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheets and dividers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; used to cage mice during infusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model

La sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) è una malattia comune che provoca disturbi del metabolismo del glucosio, come l'insulino-resistenza e l'intolleranza al glucosio. Il metabolismo disregolato del glucosio è una manifestazione importante della malattia ed è la chiave della sua patogenesi. Pertanto, gli studi che coinvolgono la valutazione del metabolismo del glucosio nella PCOS sono della massima importanza. Pochissimi studi hanno quantificato la produzione di glucosio epatico direttamente in modelli PCOS utilizzando traccianti di glucosio non radioattivi. In questo studio, discutiamo le istruzioni passo-passo per la quantificazione del tasso di produzione di glucosio epatico in un modello murino PCOS misurando l'arricchimento M + 2 di [6,6-2H2] glucosio, un tracciante isotopico stabile del glucosio, tramite gascromatografia - spettrometria di massa (GCMS). Questa procedura prevede la creazione di una soluzione stabile di tracciante isotopico del glucosio, l'uso del posizionamento del catetere della vena della coda e l'infusione del tracciante del glucosio sia a digiuno che ricchi di glucosio nello stesso topo in tandem. L'arricchimento del glucosio [6,6-2H2] viene misurato utilizzando il derivato del pentaacetato in GCMS. Questa tecnica può essere applicata a un'ampia varietà di studi che coinvolgono la misurazione diretta del tasso di produzione epatica di glucosio.

Utilizzando equazioni di diluizione isotopica precedentemente descritte, il tasso di glucosio plasmatico totale (glucoseRa) è stato calcolato dall'arricchimento M+2 di [6,6-2H2]glucosio in condizioni di digiuno e ricche di glucosio utilizzando il derivato pentaacetato21. In condizioni di stato stazionario, si presume che il tasso di comparsa del glucosio sia uguale al tasso di scomparsa del glucosio. Nel gruppo di controllo, il glugerba totale è stato ...

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Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Questo studio descrive la misurazione diretta della produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dell'ovaio policistico utilizzando un tracciante di glucosio isotopico stabile attraverso la vena della coda sia a digiuno che in stati ricchi di glucosio in tandem.

Valutazione della produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dell'ovaio policistico

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

L'obiettivo di questa procedura è determinare la produzione epatica di glucosio in una sindrome dell'ovaio policistico o modello murino PCOS. Il metabolismo disregolato del glucosio è una manifestazione importante della PCOS ed è la chiave per la sua patogenesi. Pertanto, gli studi che coinvolgono la valutazione del metabolismo del glucosio nella PCOS sono della massima importanza.In questo studio, discutiamo le istruzioni passo-passo per la quantificazione del tasso di produzione di glucosio epatico in un modello murino PCOS misurando l'arricchimento M più due di sei sei glucosio deuterato, un tracciante di glucosio isotopico stabile, tramite gascromatografia, spettrometria di massa o GCMS. Questa procedura prevede la creazione di una soluzione stabile di tracciante isotopico del glucosio, l'uso del posizionamento del catetere della vena della coda e l'infusione del tracciante del glucosio sia a digiuno che ricchi di glucosio nello stesso topo in tandem. Un giorno prima della procedura, preparare il tracciante di glucosio isotopico stabile in soluzione salina normale.Per questo esperimento, la produzione di glucosio durante il digiuno in condizioni ricche di glucosio è stata misurata in modo che l'isotopo del glucosio sia stato preparato in due diversi preparati. Il tracciante è stato preparato in condizioni sterili sciogliendo sei sei semideterminati sterili e privi di pirogeni e soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9% con o senza glucosio. Il primo infuso è stato preparato con solo il tracciante.Il secondo infuso conteneva sia il tracciante che il glucosio non isotopico. Una volta preparate le soluzioni, sono state filtrate sterili con il filtro da 0,22 micron e conservate a quattro gradi Celsius. Le soluzioni sono state preparate in modo tale che la dose finale di infusione fosse vicina a un milligrammo per chilogrammo e minuto e due milligrammi per chilogrammo e minuto rispettivamente.Per la misurazione del tasso di comparsa del glucosio durante la condizione basale in condizioni ricche di glucosio, è stata utilizzata un'infusione media a velocità costante innescata di sei sei glucosio deuterato a 1,08 milligrammi per chilogrammo e minuto e 1,9 milligrammi per chilogrammo al minuto rispettivamente. Al fine di imitare lo stato di alimentazione, abbiamo impiegato una velocità media di infusione di D-glucosio di 18,8 milligrammi per chilogrammo e minuto durante la condizione ricca di glucosio. Rimuovi i topi dalle loro gabbie domestiche e mettili nelle loro gabbie di digiuno tre ore prima dell'inizio dell'esperimento.Per questo esperimento, abbiamo usato topi femmina di quattro mesi del ceppo C57BL6J. Assemblare l'attrezzatura di ingabbiamento raggruppando i topi in un determinato numero di topi per pompa di insulina. Posiziona le partizioni sopra una base piatta e stabile per creare stalli individuali per i topi.Le gabbie sono chiare e realizzate in plexiglass. C'è una base piatta e stabile su cui si trovano le partizioni. La porta della gabbia scorre per chiudersi e ha una tacca nella parte inferiore per consentire alla coda di passare.Assemblare le siringhe contenenti un millilitro di infuso basale, quindi collegarsi al tubo della pompa di infusione utilizzando il tubo di polietilene. Preparare la pompa di infusione impostando la velocità su 150 microlitri all'ora, che è la velocità basale. Riscaldare un bagno d'acqua a 48 gradi Celsius.Preparare la stazione di inserimento del catetere adiacente al bagno d'acqua contenente gli aghi da mezzo pollice calibro 30, tubi silastici e nastro di trasporto trasparente da un pollice. Selezionare un mouse e posizionarlo in un supporto sicuro con accesso alla coda. Posizionare un pezzo di nastro adesivo sopra la porzione prossimale della coda per consentire lo spazio per l'inserimento del catetere in modo più distale.Portare il mouse a bagnomaria e inserire la coda nel bagno d'acqua per circa 30-45 secondi. Questo aiuta a dilatare la vascolarizzazione della coda per il posizionamento del catetere. L'inserimento del catetere deve essere effettuato in condizioni sterili.Una volta riscaldata la coda, pulisci la coda e posiziona un piccolo morsetto di alligatore senza denti di rame come laccio emostatico all'estremità prossimale della coda. Visualizza la vena laterale della coda sotto una lente d'ingrandimento. Quindi, inserire con attenzione il catetere nella vena della coda e lavare delicatamente la soluzione per garantire la pervietà del catetere.Avvolgere un pezzo di nastro di trasporto attorno al sito di inserimento per fissare il catetere e rimuovere il piccolo laccio emostatico dalla coda. Posiziona il topo nella sua gabbia individuale e chiudi la porta scorrevole, assicurandoti che la coda sporga attraverso la tacca e rimanga all'esterno della gabbia. Posizionare un ulteriore pezzo di nastro adesivo su tutto il catetere e la coda per fissarlo alla piastra di base della gabbia.Scollegare il filo dal catetere della vena di coda e posizionare il piccolo morsetto sul tubo silastico del catetere per evitare il riflusso mentre si collega la linea di infusione dalla pompa. Una volta fissato saldamente, rimuovere il morsetto e lavare la soluzione di adescamento che consiste nell'infuso. Assicurarsi che la soluzione sia limpida nel tubo e non macchiata di sangue.Una volta che le linee di infusione sono notate per funzionare correttamente, rimuovere il coperchio dal mouse. Posiziona la biancheria da letto standard attorno al mouse. Iniziare l'infusione con l'infuso contenente il tracciante ed eseguirlo per tre ore ininterrottamente.Per tutta la durata dell'infusione, continuare a controllare il benessere dei topi, così come le linee di infusione. Assicurarsi che il tubo di infusione sia fissato correttamente e che non vi siano perdite dai punti di connessione della linea. Dopo che la prima infusione è stata completata, interrompere l'infusione e posizionare un morsetto sul tubo del catetere per evitare il riflusso.Rimosso delicatamente i topi dai loro recinti senza disturbare il catetere per raccogliere il sangue. Per questo esperimento, i topi sono stati sottoposti a puntura della vena della guancia usando una lancetta di quattro millimetri. Raccogliere circa 75 microlitri di sangue nel flaconcino desiderato.Per deproteinizzare i campioni in preparazione per la spettrometria di massa, aggiungere circa 15 microlitri di sangue a 500 microlitri di acetone. Il sangue rimanente può essere utilizzato per controllare il livello di glucosio nel sangue tramite glucometro e / o una centrifuga per separare il plasma per futuri test ormonali. Rimuovere l'infuso dalle pompe della siringa scollegando il tubo dalle siringhe e sostituirlo con il secondo infusato contenente tracciante insieme al glucosio.Ripetere le fasi di infusione precedenti utilizzando l'infusione isotopica di glucosio ricca di glucosio. Per raggiungere lo stato stazionario, eseguire un bolo del secondo infuso a 600 microlitri all'ora per 15 minuti. Nota l'ora di inizio per ogni gruppo di gabbie.Ridurre la velocità di infusione a 150 microlitri all'ora per completare le tre ore di tempo totale di infusione. Ripetere il prelievo di sangue come descritto in precedenza. Scollegare le infusioni, applicare pressione nei siti del catetere fino a quando l'emorragia si ferma e riportare i topi alle loro gabbie domestiche.Successivamente, i campioni vengono inviati per GCMS. Calcolare l'arricchimento isotopico dell'isotopo del glucosio sotto il picco di glucosio mediante GCCMS utilizzando il derivato del pentaacetato. In breve, questo metodo prevede la preparazione del derivato pentaacetato del glucosio, seguita da analisi del campione utilizzando GCMS nella modalità di ionizzazione chimica positiva.Il monitoraggio selettivo degli ioni del rapporto massa-carica, da 171 a 169, viene eseguito per determinare l'arricchimento M più due dell'isotopo del glucosio. Tutte le misurazioni cinetiche vengono eseguite assumendo condizioni di stato stazionario. Calcola il tasso di comparsa totale del glucosio plasmatico dall'M più due arricchimenti dell'isotopo del glucosio e del plasma utilizzando equazioni di diluizione isotopica stabilite.In condizioni di stato stazionario, si presume che il tasso di comparsa del glucosio sia uguale al tasso di scomparsa del glucosio. Il tasso di produzione di glucosio endogeno è uguale al tasso di glucosio plasmatico totale meno il glucosio esogeno. La tabella uno include i risultati rappresentativi dello studio.Tutte le unità sono espresse in milligrammo per chilogrammo e minuto. Utilizzando equazioni di diluizione isotopica precedentemente descritte, è stata calcolata la velocità totale del glucosio plasmatico. Nel gruppo di controllo, il tasso medio di glucosio di comparsa era 19,98 nello stato di digiuno.In condizioni ricche di glucosio, il tasso di comparsa del glucosio era 25,8. Il tasso di produzione di glucosio era 19,08 nello stato di digiuno e 8,56 nello stato ricco di glucosio. Il metabolismo anormale del glucosio e l'omeostasi sono comuni nella PCOS.Nei disturbi del metabolismo anormale del glucosio, la regolazione della soppressione della produzione di glucosio è compromessa portando all'iperglicemia. In questo studio, descriviamo un modo semplice per misurare il tasso di produzione di glucosio epatico in più topi contemporaneamente. I componenti critici di questo esperimento sono l'inserimento del catetere e la definizione delle misurazioni esatte dell'isotopo del glucosio e del glucosio naturale al fine di eseguire adeguatamente GCMS.I vantaggi dello studio sono la realizzazione dell'infusione in modo minimamente invasivo a causa dell'inserimento del catetere della vena della coda, nonché l'uso di un tracciante del glucosio stabile e facilmente raggiungibile. Ci sono alcune limitazioni allo studio, tra cui la richiesta tecnica della procedura e la necessità di possibili competenze aggiuntive. Nel complesso, descriviamo un modo semplice e accurato per misurare il tasso di produzione totale di glucosio epatico in un modello murino PCOS.Questa tecnica potrebbe servire come base per più studi che coinvolgono il metabolismo del glucosio di modelli murini.

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