Name: evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model
Uploaded: 2022-03-05T13:30:00
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이 연구는 산부인과, 베일러 의과 대학 (ALG) 및 R-01 연구 보조금 (그랜트 # DK114689)의 국립 보건 원의 교육 보조금에 의해 지원되었습니다.

모든 동물 절차는 베일러 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. [6,6-2H2]포도당 준비
<ol><li>시술 하루 전에, 정상 식염수에 안정된 동위원소 포도당 추적자를 준비합니다. 이 실험을 위해, [6,6-2H2]포도당은 혈장 포도당 외관 비율을 측정하는 트레이서로서 사용되었다. 참고: 이 실험에서는 ?...

<ol>
	<li>March, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+polycystic+ovary+syndrome+in+a+community+sample+assessed+under+contrasting+diagnostic+criteria.">The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).</li><li>Yildiz, B. 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A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).</li><li>H&#248;jlund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin-stimulated+phosphorylation+of+Akt+and+AS160+in+skeletal+muscle+of+women+with+polycystic+ovary+syndrome+is+reversed+by+pioglitazone+treatment.">Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment.</a> Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).</li><li>Moghetti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergences+in+insulin+resistance+between+the+different+phenotypes+of+the+polycystic+ovary+syndrome.">Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).</li><li>Ovalle, F., Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance,+polycystic+ovary+syndrome,+and+type+2+diabetes+mellitus.">Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus.</a> Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profound+peripheral+insulin+resistance,+independent+of+obesity,+in+polycystic+ovary+syndrome.">Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome.</a> Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).</li><li>Hutchison, S. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+reproductive,+metabolic,+and+endocrine+features+of+polycystic+ovary+syndrome+in+female+hyperandrogenic+mouse+models.">Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models.</a> Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).</li><li>Chappell, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+androgen+induced+lean+PCOS+impairs+mitochondria+and+mRNA+profiles+in+oocytes.">Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes.</a> Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+gluconeogenesis+using+glucose+fragments+and+mass+spectrometry+after+ingestion+of+deuterium+oxide.">Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).</li><li>Bier, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&amp;#34;true&amp;#34;+glucose+production+rates+in+infancy+and+childhood+with+6,6-dideuteroglucose.">Measurement of &amp;#34;true&amp;#34; glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose.</a> Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).</li><li>Chacko, S. K., Sunehag, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenesis+continues+in+premature+infants+receiving+total+parenteral+nutrition.">Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition.</a> Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ghrelin+on+glucose+regulation+in+mice.">Effect of ghrelin on glucose regulation in mice.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+conscious,+unrestrained+mice.">Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).</li><li>Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Intravenous+Self+Administration+in+a+Mouse+Model.">Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+urea+kinetic+studies+in+conscious+mice.">In vivo urea kinetic studies in conscious mice.</a> The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).</li><li>Choukem, S. -. P., Gautier, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+hepatic+insulin+resistance.">How to measure hepatic insulin resistance.</a> Diabetes Metabolism. 34 (6), 664-673 (2008).</li></ol>

고혈당증 및 비정상적인 포도당 대사/항상성 PCOS의 특징입니다. 혈당 수준은 호르몬과 효소의 통제 하에 글리코게놀리시스와 글루코네오발생 및 글리코발생을 통해 식이요법과 포도당 생산에서 포도당의 조합에 의해 유지된다. 간 포도당 생산은 증가 순환 포도당 수준의 존재에 의해 억제된다. 비정상적인 포도당 대사의 장애에서, 포도 당 생산의 억제의 조절은 고혈당증으로 이어지는 손...

다낭성 난소 증후군 (PCOS)은 생식 노인 여성의 12%-20%에서 발생하는 일반적인 장애입니다1,2. 다낭성 난소, 불규칙한 수막 및 고안드로제네미아의 임상 또는 실험실 증거를 포함하는 가변 표현형을 초래하는 복잡한 질환이며, 여성이 3가지 기준 중 2개를 만날 때 전형적으로 진단된다3. PCOS의 주요 한 측면, 그리고 그것의 병인에 있는 중요한 요인은, 질병이 있는 여자에서 찾아낸 신진 대사 혼란입니다. PCOS를 가진 여자는 인슐린 저항의 더 높은 부각이, 포도당 편협, 비만, 및 대사 증후군3,4,5,6. 인슐린 저항은 질병의 표현일 뿐 아니라 난소에 있는 황호르몬을 전형화하여 그것의 병기 생성에 기여하는 것으로 생각됩니다 7,8 증가한 안드로겐 생산으로 이끌어 냅니다. 인슐린 저항은 몇몇 가능한 기원이 있기 위하여 생각됩니다 그러나 연구 결과는 인슐린 수용체 신호의 이상한 패턴 때문일 지도 모르다 건의합니다9,10. 연구는 고인슐린 -유글리세믹 클램프의 금 표준 기술을 사용하여 PCOS 환자에서 인슐린 저항성을 평가11,12,13,14,15. PCOS를 가진 여자는, BMI에 관계없이, 통제에 비해 인슐린 저항의 상부가 있습니다. 포도 당 생산에 인슐린 제어 는 과잉 포도 당 생산으로 이어지는 인슐린 저항의 장애에 손상. 예를 들면, 당뇨병 환자는 글루코네오발생의 비율을 증가하고 글리코게놀리시스16의 손상한 억제가 있습니다. 더욱이, 포도당 생산의 손상된 억제는 당뇨병 쥐17에서 관찰되었습니다. 클램프 연구는 인슐린 저항의 측정을 줄 수 있지만, PCOS에서 몇 가지 연구는 금식 및 공급 상태에서 포도당 생산의 직접 측정에 초점을 맞추고. 이를 위해서는 방사성 이소성 포도당 추적기 주입 및 질량 분석법을 통한 측정의 사용이 필요합니다.
동물 모델은 PCOS 연구에 광범위하게 사용되어 왔습니다. 마른 모델과 비만 형 PCOS 뮤린 모델 모두 안드로겐을 prenatally 투여하여 만들어졌으며, preubertally 또는 사춘기 후18. 설치류 PCOS 모델은 또한 각각의 대조군과 비교하여 신진 대사 차이를 보여줍니다. 우리의 실험실에서 이전 데이터는 PCOS 마우스 모델 (린 및 비만)에서 비정상적인 포도당 내성 테스트 (GTT)를 입증, 인간의 PCOS 문학과 일치19. 마른 동물 모델의 사용은 신진 대사 차이에 추가 조사를 할 수 있습니다. 구체적으로, 본 모델은 동위원소 포도당 추적기를 직접 사용하여 포도당 생산 속도를 평가할 수 있게 한다. 가장 일반적으로 사용되는 안정동위피 포도당 추적기 중 하나는 [6,6-2H2]포도당입니다. [6,6-2H2]포도당 농축은 이전에 설명된 바와 같이 펜타아세테이트 유도체를 사용하여 측정될 수 있다20.
이 연구에서는, 우리의 목표는 동위원소 포도당 주입을 사용하여 PCOS 마우스에 있는 금식 및 포도당 이풍부한 상태에서 간 포도당 생산의 비율을 측정하는 것이었습니다. 이러한 기술은 포도당 운동과 관련된 광범위한 실험에 적용될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride solution</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>275595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL BD Luer-Lok tip syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75846-756</td>
			<td>Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch clear transpore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200400169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch Labeling tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe containing heparanized saline flush</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>191-MIH-2235</td>
			<td>One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9891620</td>
			<td>5 mm if animal is between 2 and 6 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced hot plate stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-602</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 27 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Health Warehouse</td>
			<td>A283952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Medvet</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, 1000 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caging pellets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear VOA glass vials with closed-top cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-719-120</td>
			<td>For storage of acetone and blood draw samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper toothless alligator clamp for tourniquet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (6,6-D2, 99%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td>DLM-349-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62999-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>Ohaus Adventurer Pro</td>
			<td>AV264C</td>
			<td>Any similar model with 0.0001g accuracy can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene bottle, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0158-12EA</td>
			<td>Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD Ultra multi-syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3024A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheets and dividers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; used to cage mice during infusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model

다낭성 난소 증후군(PCOS)은 인슐린 저항성 및 포도당 편협과 같은 포도당 대사 장애를 초래하는 일반적인 질병입니다. Dysregulated 포도당 물질 대사는 질병의 중요한 표현이고 그것의 병기발생의 열쇠입니다. 따라서, PCOS에서 포도 당 물질 대사의 평가와 관련 된 연구는 가장 중요 한. 비 방사성 포도당 추적기를 사용하여 PCOS 모델에서 직접 간 포도당 생산을 정량화한 연구는 거의 없습니다. 이 연구에서는, 가스 크로마토그래피를 통해 안정적인 동위원소 포도당 추적자인 [6,6-2H2]포도당의 M+2 농축을 측정하여 PCOS 마우스 모델에서 간 포도당 생산 속도의 정량화에 대한 단계별 지침을 논의합니다- 질량 분광법 (GCMS). 이 절차는 안정적인 동위원소 포도당 추적제 의 생성을 포함, 꼬리 정맥 카테터 배치의 사용과 함께 같은 마우스에서 금식과 포도당이 풍부한 상태 모두에서 포도당 추적자의 주입. [6,6-2H2]의 농축은 GCMS에서 펜타아세테이트 유도체를 사용하여 측정된다. 이 기술은 간 포도당 생산의 비율의 직접 측정을 관련시키는 연구의 다양한에 적용될 수 있습니다.

이전에 설명된 동위원소 희석 방정식을 사용하여, 총 혈장 포도당 비율(glucoseRa)은 펜타아세테이트 유도체21을 이용하여 금식 및 포도당이 풍부한 조건에서 [6,6-2H2]포도당의 M+2 농축으로부터 계산되었다. 꾸준한 상태 조건에서, 포도 당의 외관의 비율은 포도 당의 실종의 비율과 동일하다는 것을 가정합니다. 대조군에서, 총 포도당Ra는 포도당이 ?...

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Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

이 연구는 다낭성 난소 증후군 마우스 모델에서 간 포도당 생산의 직접적인 측정을 설명하며, 꼬리 정맥을 통해 안정적인 동위 원소 포도당 추적자를 사용하여 단식과 포도당이 풍부한 상태 모두에서 함께 한다.

다낭성 난소 증후군 마우스 모형에 있는 간 포도당 생산의 평가

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

이 절차의 목표는 다낭성 난소 증후군, 또는 PCOS 마우스 모형에 있는 간 포도당 생산을 결정하는 것입니다. Dysregulated 포도당 물질 대사는 PCOS의 중요한 표현이고 그것의 병기발생에 열쇠입니다. 따라서, PCOS에서 포도 당 물질 대사의 평가와 관련 된 연구는 가장 중요 한.이 연구에서는 가스 크로마토그래피, 질량 분석법 또는 GCMS를 통해 6개의 유족 포도당, 안정적인 동위원소 포도당 추적기의 M 플러스 2개의 농축을 측정하여 PCOS 마우스 모델에서 간 포도당 생산 속도의 정량화를 위한 단계별 지침을 논의합니다. 이 절차는 안정적인 동위원소 포도당 추적제 용액의 생성, 꼬리 정맥 카테터 배치 의 사용 및 같은 마우스에서 금식 및 포도당이 풍부한 상태 모두에서 포도당 추적자의 주입을 포함한다. 시술 하루 전에, 정상 식염수에 안정된 동위원소 포도당 추적자를 준비합니다.이 실험을 위해, 포도당이 풍부한 조건에서 금식 하는 동안 포도당 생산을 측정 하 고 포도 당 동위 원소 두 개의 다른 준비에서 준비 되었다. 트레이서들은 멸균 및 파이로겐이 없는 6개의 중음포도당 및 멸균 0.9%의 염화나트륨 용액을 포도당 유무에 관계없이 용해시킴으로써 멸균 조건하에서 제조하였다. 첫 번째 인퓨아테는 트레이서만 으로 준비하였다.두 번째 비중화는 비이소토성 포도당과 함께 추적자를 모두 포함했다. 일단 해결책이 준비되면, 그들은 0.22 미크론 필터로 여과하고 섭씨 4도에 저장멸하였다. 용액은 최종 주입 복용량킬로그램 당 1 밀리 그램에 가까운 것 같은 방법으로 준비 하 고 분 당 킬로그램과 분 당 2 밀리 그램.포도당이 풍부한 상태에서 기저 조건 동안 포도당 외관 속도 측정을 위해, 킬로그램 당 1.08 밀리그램과 분당 1.9 밀리그램에서 6개의 중음포도당의 프라이밍 평균 일정한 비율 주입을 분단위로 각각 사용했습니다. 공급 상태를 모방하기 위해, 우리는 포도당이 풍부한 상태 동안 킬로그램 당 18.8 밀리그램과 분의 평균 D 포도당 주입률을 사용했습니다. 홈 케이지에서 마우스를 제거하고 실험 시작 3 시간 전에 금식 케이지에 놓습니다.이 실험을 위해, 우리는 C57BL6J 균주에서 4 개월 된 암컷 마우스를 사용했다. 인슐린 펌프당 마우스의 집합 수로 마우스를 그룹화하여 caging 장비를 조립한다. 평평하고 안정적인 베이스 위에 파티션을 배치하여 생쥐의 개별 노점을 만듭니다.케이지는 명확하고 플렉시 유리로 만들어집니다. 파티션이 있는 평평하고 안정적인 베이스가 있습니다. 케이지의 문이 닫히고 꼬리가 들어갈 수 있도록 바닥에 노치가 있습니다.기저 비소 1밀리리터가 들어있는 주사기를 조립한 다음 폴리에틸렌 튜브를 사용하여 주입 펌프 튜브에 연결합니다. 시간당 150 마이크로리터로 속도를 설정하여 주입 펌프를 준비합니다. 수조를 섭씨 48도로 가열합니다.30 게이지 반인치 바늘, 살약 튜브 및 1인치 의 투명한 운송 테이프가 들어 있는 수조에 인접한 카테터 삽입 스테이션을 준비합니다. 마우스 하나를 선택하고 꼬리에 액세스 할 수있는 보안 홀더에 배치합니다. 카테터 삽입공간을 더 dis탈리게 할 수 있도록 꼬리의 근위 부분에 테이프 조각을 놓습니다.마우스를 수조에 가져와 서 약 30~45초 동안 수조에 꼬리를 삽입합니다. 이것은 카테터 배치를 위한 꼬리 혈관을 넓이시키는 것을 돕습니다. 카테터 삽입은 멸균 조건하에서 수행해야 합니다.꼬리가 따뜻해지면 꼬리를 청소하고 꼬리의 근간끝에 지혈대로 작은 구리 이빨이 없는 악어 클램프를 놓습니다. 돋보기 아래에 측면 꼬리 정맥을 시각화합니다. 그런 다음 카테터를 테일 정맥에 조심스럽게 삽입하고 용액을 부드럽게 플러시하여 카테터의 가제성을 보장합니다.카테터를 고정하고 꼬리에서 작은 지혈대를 제거하기 위해 삽입 부위 주위에 전송 테이프 조각을 감쌉니다. 마우스를 개별 케이지에 놓고 슬라이딩 도어를 닫아 꼬리가 노치를 통해 튀어 나와 케이지 외부에 남아 있는지 확인합니다. 카테터 전체와 꼬리에 테이프를 추가하여 케이지의 베이스 플레이트에 고정합니다.꼬리 정맥 카테터에서 플러시를 분리하고, 펌프에서 인퓨아산 라인을 연결하는 동안 역류를 방지하기 위해 카테터의 silastic 튜브에 작은 클램프를 배치합니다. 단단히 연결되면 클램프를 제거하고 인퓨산으로 구성된 프라이밍 솔루션을 플러시합니다. 용액이 튜브에 명확하고 혈액 얼룩이 아닌지 확인하십시오.주입 선이 제대로 작동하도록 되면 마우스에서 덮개를 제거합니다. 표준 침구를 마우스 주위에 놓습니다. 추적자를 포함하는 주입을 시작하고 3 시간 동안 계속 실행합니다.주입 의 기간 동안, 쥐의 웰빙을 확인 계속, 뿐만 아니라 주입 라인. 주입 튜브가 제대로 고정되어 있고 라인 연결 지점에서 누출이 없는지 확인합니다. 첫 번째 주입이 완료된 후 주입을 중지하고 카테터의 튜브에 클램프를 배치하여 역류를 방지합니다.혈액을 수집하기 위해 카테터를 방해하지 않고 인클로저에서 마우스를 부드럽게 제거했습니다. 이 실험을 위해, 마우스는 4 mm 랜싯을 사용하여 뺨 정맥 구멍을 겪었습니다. 원하는 유리병에 약 75 마이크로리터의 혈액을 수집합니다.질량 분광법을 준비하기 위해 시료를 단백질화하려면 약 15 마이크로리터의 혈액을 아세톤 500 마이크로리터에 추가합니다. 남은 혈액은 글루코프터 및/또는 원심분리기를 통해 향후 호르몬 분석약을 위해 혈장 분리를 통해 혈당 수준을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 주사기에서 튜브를 분리하여 주사기 펌프에서 인퓨아를 제거하고 포도당과 함께 추적자를 포함하는 두 번째 비혼으로 교체하십시오.포도당이 풍부한 동위원소 포도당 주입을 사용하여 이전 주입 단계를 반복하십시오. 안정된 상태에 도달하기 위해, 15 분 동안 시간당 600 마이크로 리터에서 두 번째 불경유의 볼러스를 실행합니다. 각 케이지 그룹의 시작 시간을 기록합니다.총 주입 시간의 3 시간을 완료하기 위해 시간당 150 마이크로 리터로 주입 속도를 감소. 이전에 설명한 바와 같이 혈액 샘플링을 반복합니다. 주입을 분리하고 출혈이 멈출 때까지 카테터 부위에 압력을 가하고 마우스를 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.다음으로 GCMS에 대한 샘플이 전송됩니다. 감타세테이트 유도체를 이용하여 GCCMS에 의해 포도당 피크 하에서 포도당 동위원소의 동위원소 농축을 계산한다. 간단히, 이 방법은 포도당의 펜타세테이트 유도체의 준비를 포함하고, 양양성 화학 이온화 모드에서 GCMS를 이용한 샘플 분석이 뒤따릅니다.질량 대 전하 비율의 선택적 이온 모니터링, 171 대 169, 포도당 동위원소의 M 플러스 2 농축을 결정하기 위해 수행된다. 모든 운동 측정은 안정된 상태 조건을 가정하여 수행됩니다. M에서 총 플라즈마 포도당 외관 비율을 계산하고 확립된 동위원소 희석 방정식을 사용하여 포도당 동위원소와 플라즈마의 2개의 농축을 계산합니다.꾸준한 상태 조건하에서, 포도당의 외관의 비율은 포도당의 실종의 비율과 동일하다는 것을 가정합니다. 내인성 포도당 생산의 비율은 총 혈장 포도당 비율을 뺀 외인성 포도당과 동일합니다. 표 1에는 연구의 대표적인 결과가 포함됩니다.모든 유닛은 킬로그램과 분당 밀리그램으로 표현됩니다. 이전에 설명된 동위원소 희석 방정식을 사용하여 총 혈장 포도당 비율을 계산하였다. 대조군에서, 외관의 평균 포도당 비율은 단식 상태에서 19.98이었다.포도당이 풍부한 조건에서, 외관의 포도당 비율은 25.8이었습니다. 포도당 생산율은 금식 상태에서 19.08, 포도당이 풍부한 상태에서 8.56이었다. 비정상적인 포도당 대사와 항상성 PCOS에서 일반적입니다.비정상적인 포도당 대사의 장애에서, 포도 당 생산의 억제의 조절은 고혈당증으로 이어지는 손상. 이 연구에서는, 우리는 동시에 다중 마우스에 있는 간 포도당 생산의 비율을 측정하는 간단한 방법을 기술합니다. 이 실험의 중요한 구성 요소는 GCMS를 적절히 수행하기 위해 포도당 동위원소 및 천연 포도당의 정확한 측정을 카테터 삽입 및 정의하는 것입니다.연구의 장점은 꼬리 정맥 카테터 삽입으로 인해 최소 침습 적 방식으로 주입뿐만 아니라 쉽게 달성 할 수있는 안정적인 포도당 추적기의 사용입니다. 절차에 대한 기술적 요구와 가능한 추가 기술이 필요한 것을 포함하여 연구에 몇 가지 제한이 있습니다. 전반적으로, 우리는 PCOS 마우스 모형에 있는 총 간 포도당 생산의 비율을 측정하는 간단하고 정확한 방법을 기술합니다.이 기술은 마우스 모형의 포도당 물질 대사를 관련시키는 다중 연구 결과를 위한 기초역할을 할 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

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연구

의학

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