Name: evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model
Uploaded: 2022-03-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av opplæringsstipend fra Institutt for obstetrikk og gynekologi, Baylor College of Medicine (ALG) og R-01 forskningsstipend (Grant # DK114689) for CSB, SC og JM fra National Institutes of Health.

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Baylor College of Medicine.
1. Tilberedning av [6,6-2H2]glukose
<ol><li>En dag før prosedyren, lag den stabile isotopglukosesporeren i normal saltvann. For dette eksperimentet ble [6,6-2H2]glukose brukt som sporstoff for å måle plasmaglukoseutseende. MERK: I dette eksperimentet ble glukoseproduksjon under faste og glukoserike forhold m...

<ol>
	<li>March, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+polycystic+ovary+syndrome+in+a+community+sample+assessed+under+contrasting+diagnostic+criteria.">The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).</li><li>Yildiz, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+phenotype+and+cardiometabolic+risk+of+polycystic+ovary+syndrome+under+different+diagnostic+criteria.">Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+2003+consensus+on+diagnostic+criteria+and+long-term+health+risks+related+to+polycystic+ovary+syndrome.">Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).</li><li>Goodarzi, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+ovary+syndrome:+etiology,+pathogenesis+and+diagnosis.">Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).</li><li>Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction:+Determinants+of+polycystic+ovary+syndrome.">Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).</li><li>Baskind, N. E., Balen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic-pituitary,+ovarian+and+adrenal+contributions+to+polycystic+ovary+syndrome.">Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome.</a> Best Practice and Research. Clinical Obstetrics &amp; Gynaecology. 37, 80-97 (2016).</li><li>Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+hyperandrogenism+with+hyperinsulinism+in+polycystic+ovarian+disease.">Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).</li><li>Bremer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+ovary+syndrome+in+the+pediatric+population.">Polycystic ovary syndrome in the pediatric population.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+insulin+receptor+serine+phosphorylation+in+cultured+fibroblasts+and+in+skeletal+muscle.+A+potential+mechanism+for+insulin+resistance+in+the+polycystic+ovary+syndrome.">Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).</li><li>H&#248;jlund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin-stimulated+phosphorylation+of+Akt+and+AS160+in+skeletal+muscle+of+women+with+polycystic+ovary+syndrome+is+reversed+by+pioglitazone+treatment.">Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment.</a> Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).</li><li>Moghetti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergences+in+insulin+resistance+between+the+different+phenotypes+of+the+polycystic+ovary+syndrome.">Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).</li><li>Ovalle, F., Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance,+polycystic+ovary+syndrome,+and+type+2+diabetes+mellitus.">Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus.</a> Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).</li><li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profound+peripheral+insulin+resistance,+independent+of+obesity,+in+polycystic+ovary+syndrome.">Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome.</a> Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).</li><li>Hutchison, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+exercise+on+insulin+resistance+and+body+composition+in+overweight+and+obese+women+with+and+without+polycystic+ovary+syndrome.">Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).</li><li>Stepto, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Women+with+polycystic+ovary+syndrome+have+intrinsic+insulin+resistance+on+euglycaemic-hyperinsulaemic+clamp.">Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp.</a> Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).</li><li>Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+fasting+glucose+production+and+disappearance+are+abnormal+in+people+with+&amp;#34;mild&amp;#34;+and+&amp;#34;severe&amp;#34;+type+2+diabetes.">Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with &amp;#34;mild&amp;#34; and &amp;#34;severe&amp;#34; type 2 diabetes.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).</li><li>Blesson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+dependent+dysregulation+of+hepatic+glucose+production+in+lean+Type+2+diabetic+rats.">Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 538 (2019).</li><li>Caldwell, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+reproductive,+metabolic,+and+endocrine+features+of+polycystic+ovary+syndrome+in+female+hyperandrogenic+mouse+models.">Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models.</a> Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).</li><li>Chappell, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+androgen+induced+lean+PCOS+impairs+mitochondria+and+mRNA+profiles+in+oocytes.">Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes.</a> Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+gluconeogenesis+using+glucose+fragments+and+mass+spectrometry+after+ingestion+of+deuterium+oxide.">Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).</li><li>Bier, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&amp;#34;true&amp;#34;+glucose+production+rates+in+infancy+and+childhood+with+6,6-dideuteroglucose.">Measurement of &amp;#34;true&amp;#34; glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose.</a> Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).</li><li>Chacko, S. K., Sunehag, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluconeogenesis+continues+in+premature+infants+receiving+total+parenteral+nutrition.">Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition.</a> Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).</li><li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ghrelin+on+glucose+regulation+in+mice.">Effect of ghrelin on glucose regulation in mice.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-surgical+alternatives+to+invasive+procedures+in+mice.">Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice.</a> Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).</li><li>Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+artery+infusions+for+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+analysis+of+taxanes+in+mice.">Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).</li><li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+conscious,+unrestrained+mice.">Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).</li><li>Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Intravenous+Self+Administration+in+a+Mouse+Model.">Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).</li><li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+urea+kinetic+studies+in+conscious+mice.">In vivo urea kinetic studies in conscious mice.</a> The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).</li><li>Choukem, S. -. P., Gautier, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+hepatic+insulin+resistance.">How to measure hepatic insulin resistance.</a> Diabetes Metabolism. 34 (6), 664-673 (2008).</li></ol>

Hyperglykemi og unormal glukosemetabolisme / homeostase er funksjoner i PCOS. Blodsukkernivået opprettholdes av en kombinasjon av glukose fra kosthold og glukoseproduksjon via glykogenolyse og glukonogenese og glykogenese, under kontroll av hormon og enzymer. Leverglukoseproduksjon undertrykkes av tilstedeværelsen av økte sirkulerende glukosenivåer. Ved forstyrrelser i unormal glukosemetabolisme er regulering av undertrykkelse av glukoseproduksjon kompromittert, noe som fører til hyperglykemi. Mens mange st...

Polycystisk eggstokk syndrom (PCOS) er en vanlig lidelse som forekommer hos 12%-20% av reproduktive kvinner1,2. Det er en kompleks sykdom som resulterer i variable fenotyper som involverer polycystiske eggstokkene, uregelmessige mensen og kliniske eller laboratoriebevis for hyperandrogenemi, og diagnostiseres vanligvis når en kvinne oppfyller to av de tre kriteriene3. Et dominerende aspekt av PCOS, og en nøkkelfaktor i patogenesen, er metabolske derangementer som finnes hos kvinner som har sykdommen. Kvinner med PCOS har høyere forekomster av insulinresistens, glukoseintoleranse, fedme og metabolsk syndrom3,4,5,6. Insulinresistens er ikke bare en manifestasjon av sykdommen, men det antas å bidra til patogenesen ved å forsterke virkningen av luteiniserende hormon i eggstokken og dermed føre til økt androgenproduksjon7,8. Insulinresistens antas å ha flere mulige opprinnelser, men studier tyder på at det kan skyldes unormale mønstre av insulinreseptorsignalering9,10. Studier har evaluert insulinresistens hos PCOS-pasienter ved hjelp av gullstandardteknikken til hyperinsulinemisk-euglykemisk klemme11,12,13,14,15. Kvinner med PCOS, uavhengig av BMI, har høyere nivåer av insulinresistens sammenlignet med kontroller. Insulinkontroll over glukoseproduksjon er svekket i forstyrrelser av insulinresistens som fører til overflødig glukoseproduksjon. For eksempel har diabetikere økt forekomst av glukoneogenese og nedsatt undertrykkelse av glykogenolyse16. Videre er nedsatt undertrykkelse av glukoseproduksjon observert hos diabetikerrotter17. Selv om klemmestudier kan gi en måling av insulinresistens, er det få studier i PCOS som fokuserer på direkte måling av glukoseproduksjon i faste- og fed-tilstander. Dette krever bruk av en ikke-radioaktiv isotopisk glukosesporerinfusjon og måling via massespektrometri.
Dyremodeller har blitt mye brukt i PCOS-forskning. Både magre og overvektige PCOS murine modeller har blitt opprettet ved å administrere androgener prenatalt, prepubertally, eller post-pubertally18. Gnager PCOS-modeller viser også metabolske forskjeller sammenlignet med deres respektive kontroller. Tidligere data fra laboratoriet vårt viste unormale glukosetoleransetester (GTT) i PCOS-musemodeller (mager og overvektig), i samsvar med menneskelig PCOS-litteratur19. Bruk av en mager og overvektig dyremodell tillater videre undersøkelse av metabolske forskjeller. Spesielt tillater denne modellen evaluering av hastigheten på glukoseproduksjon direkte ved hjelp av isotopiske glukosesporere. En av de mest brukte stabile isotopiske glukosesporeren er [6,6-2H2]glukose. [6,6-2H2]glukoseberikelse kan måles ved hjelp av et pentaacetatderivat som tidligere beskrevet20.
I denne studien var vårt mål å måle frekvensen av leverglukoseproduksjon i faste og glukoserik tilstand hos PCOS-mus ved hjelp av isotopisk glukoseinfusjon. Disse teknikkene kan brukes på et bredt spekter av eksperimenter som involverer glukosekinetikk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride solution</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>275595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL BD Luer-Lok tip syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75846-756</td>
			<td>Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch clear transpore tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>70200400169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-inch Labeling tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>GS07F161BA</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe containing heparanized saline flush</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>191-MIH-2235</td>
			<td>One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9891620</td>
			<td>5 mm if animal is between 2 and 6 months</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced hot plate stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97042-602</td>
			<td>Brand is example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 27 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Health Warehouse</td>
			<td>A283952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30 gauge 0.5 inch needles</td>
			<td>Medvet</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>63019-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, 1000 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caging pellets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear VOA glass vials with closed-top cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-719-120</td>
			<td>For storage of acetone and blood draw samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper toothless alligator clamp for tourniquet</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose &#62;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose (6,6-D2, 99%)</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td>DLM-349-PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62999-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying glass</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>Ohaus Adventurer Pro</td>
			<td>AV264C</td>
			<td>Any similar model with 0.0001g accuracy can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene bottle, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0158-12EA</td>
			<td>Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD Ultra multi-syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-3024A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglass sheets and dividers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand; used to cage mice during infusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model

Polycystisk eggstokk syndrom (PCOS) er en vanlig sykdom som resulterer i forstyrrelser i glukosemetabolismen, som insulinresistens og glukoseintoleranse. Dysregulert glukosemetabolisme er en viktig manifestasjon av sykdommen og er nøkkelen til patogenesen. Derfor er studier som involverer evaluering av glukosemetabolisme i PCOS av største betydning. Svært få studier har kvantifisert leverglukoseproduksjon direkte i PCOS-modeller ved hjelp av ikke-radioaktive glukosesporere. I denne studien diskuterer vi trinnvise instruksjoner for kvantifisering av hastigheten på leverglukoseproduksjon i en PCOS-musemodell ved å måle M+2-berikelse av [6,6-2H2]glukose, en stabil isotopisk glukosesporer, via gasskromatografi - massespektrometri (GCMS). Denne prosedyren innebærer opprettelse av stabil isotopisk glukosesporerløsning, bruk av hale venekateterplassering og infusjon av glukosesporeren i både faste og glukoserike tilstander i samme mus i tandem. Berikelsen av [6,6-2H2]glukose måles ved hjelp av pentaacetatderivat i GCMS. Denne teknikken kan brukes på et bredt spekter av studier som involverer direkte måling av hastigheten på leverglukoseproduksjon.

Ved hjelp av tidligere beskrevne isotopfortynningsligninger ble den totale plasmaglukosehastigheten (glukoseRa) beregnet fra M+2 berikelse av [6,6-2H2]glukose i faste og glukoserike forhold ved hjelp av pentaacetatderivatet21. Under steady-state forhold antas det at utseendet av glukose er lik hastigheten på forsvinning av glukose. I kontrollgruppen var den totale glukoseRa 19,98 ± 2,53 mg/(kg·min) etter 6 timers faste og 25,80 ± 1,76 mg/(kg·min) un...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model at JoVE.com

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Denne studien beskriver den direkte målingen av leverglukoseproduksjon i en polycystisk eggstokksyndrommusmodell ved å bruke en stabil isotopisk glukosesporer via haleåre i både faste og glukoserike tilstander i tandem.

Evaluering av leverglukoseproduksjon i en musmodell av polycystisk eggstokksyndrom

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Målet med denne prosedyren er å bestemme leverglukoseproduksjon i et polycystisk eggstokksyndrom eller PCOS-musemodell. Dysregulert glukosemetabolisme er en viktig manifestasjon av PCOS og er nøkkelen til patogenesen. Derfor er studier som involverer evaluering av glukosemetabolisme i PCOS av største betydning.I denne studien diskuterer vi trinnvise instruksjoner for kvantifisering av hastigheten på leverglukoseproduksjon i en PCOS-musemodell ved å måle M pluss to berikelse av seks seks deutered glukose, en stabil isotopisk glukosesporer, via gasskromatografi, massespektrometri eller GCMS. Denne prosedyren innebærer opprettelse av en stabil isotopisk glukosesporerløsning, bruk av hale venekateterplassering og infusjon av glukosesporeren i både faste og glukoserike tilstander i samme mus i tandem. En dag før prosedyren, lag den stabile isotopglukosesporeren i normal saltvann.For dette eksperimentet ble glukoseproduksjon under faste i glukoserike forhold målt slik at glukoseisotoper ble tilberedt i to forskjellige preparater. Traceren ble fremstilt under sterile forhold ved å oppløse steril og pyrogenfri seks seks deutert glukose og steril 0,9% natriumkloridoppløsning med eller uten glukose. Det første infusatet ble tilberedt med bare traceren.Det andre infusatet inneholdt både traceren sammen med den ikke-isotopiske glukosen. Når løsningene var forberedt, ble de sterile filtrert med 0,22 mikronfilteret og lagret ved fire grader Celsius. Løsningene ble utarbeidet på en slik måte at den endelige infusing dosen var nær ett milligram per kilo og minutt og to milligram per kilo og minutt henholdsvis.For glukoseutseendet under basal tilstand i glukoserik tilstand ble det brukt en primet gjennomsnittlig konstant rateinfusjon på seks seks deutererte glukose på henholdsvis 1,08 milligram per kilo og minutt og 1,9 milligram per kilo i minuttet. For å etterligne matet tilstand brukte vi en gjennomsnittlig D-glukoseinfusjonshastighet på 18,8 milligram per kilo og minutt under glukoserik tilstand. Fjern musene fra deres hjemmebur, og legg dem i deres faste bur tre timer før starten av eksperimentet.For dette eksperimentet brukte vi fire måneder gamle kvinnelige mus fra C57BL6J-stammen. Monter cagingutstyret ved å gruppere musene i et bestemt antall mus per insulinpumpe. Plasser partisjoner på toppen av en flat, stabil base for å lage individuelle boder for musene.Burene er klare og laget av plexiglass. Det er en flat, stabil base som partisjonene sitter på. Døren til buret glir for å lukke og har et hakk i bunnen for å la halen passe gjennom.Monter sprøytene som inneholder en milliliter basal infusat, og koble deretter til infusjonspumperør ved hjelp av polyetylenrørene. Forbered infusjonspumpen ved å sette hastigheten til 150 mikroliter i timen, som er basalhastigheten. Varm et vannbad til 48 grader Celsius.Forbered kateterets innsettingsstasjon ved siden av vannbadet som inneholder 30 gauge halv tomme nåler, silastiske slanger og en tomme, klart transportbånd. Velg en mus og plasser den i en sikker holder med tilgang til halen. Legg et stykke tape over den proksimale delen av halen for å gi plass til kateterets innsetting mer distalt.Ta musen til vannbadet, og sett halen i vannbadet i ca. 30 til 45 sekunder. Dette bidrar til å utvide halevaskulaturen for kateterplassering. Kateterets innsetting må gjøres under sterile forhold.Når halen er oppvarmet, rengjør halen og legg en liten kobber tannløs alligatorklemme som en turniquet i den proksimale enden av halen. Visualiser sidehalevenen under et forstørrelsesglass. Sett deretter kateteret forsiktig inn i halevenen, og skyll oppløsningen forsiktig for å sikre kateterets patency.Pakk et stykke transportbånd rundt innsettingsstedet for å feste kateteret, og fjern den lille turniqueten fra halen. Plasser musen i sitt individuelle bur og lukk skyvedøren, sørg for at halen stikker ut gjennom hakket og forblir utenfor buret. Legg et ekstra stykke tape over hele kateteret og halen for å feste det til grunnplaten på buret.Koble spylingen fra halevenkateteret, og plasser den lille klemmen på kateterets silastiske rør for å forhindre tilbakestrømning mens du kobler den infusate linjen fra pumpen. Når klemmen er ordentlig tilkoblet, fjern den og skyll påfyllingsløsningen som består av det infusate. Pass på at oppløsningen er klar i røret og ikke blodfarget.Når infusjonslinjer er notert å fungere ordentlig, fjern dekselet fra musen. Plasser standard sengetøy rundt musen. Start infusjonen med det infusate som inneholder traceren, og kjør den i tre timer kontinuerlig.For varigheten av infusjonen, fortsett å sjekke musenes velvære, samt infusjonslinjene. Kontroller at infusjonsslangen er ordentlig festet, og at det ikke er noen lekkasjer fra linjetilkoblingspunktene. Etter at den første infusjonen er fullført, stopp infusjonen og plasser en klemme på kateterets slange for å forhindre tilbakestrømning.Forsiktig fjernet musene fra sine innkapslinger uten å forstyrre kateteret for å samle blod. For dette eksperimentet gjennomgikk musene kinnvene punktering ved hjelp av en fire millimeter lansett. Samle ca. 75 mikroliter blod i ønsket hetteglass.For å deproteinisere prøver som forberedelse til massespektrometri, tilsett ca. 15 mikroliter blod til 500 mikroliter aceton. Gjenværende blod kan brukes til å sjekke blodsukkernivået via glukometer og/ eller en sentrifuge for å skille plasma for fremtidige hormonanalyser. Fjern infusate fra sprøytepumpene ved å koble slangen fra sprøytene, og erstatt den med det andre infusate som inneholder tracer sammen med glukose.Gjenta tidligere infusjonstrinn ved hjelp av den glukoserike isotopiske glukoseinfusjonen. For å nå steady state, kjør en bolus av den andre infusate på 600 mikroliter i timen i 15 minutter. Legg merke til starttiden for hver gruppe bur.Reduser infusjonshastigheten til 150 mikroliter i timen for å fullføre de tre timene med total infusjonstid. Gjenta blodprøvetaking som tidligere beskrevet. Koble fra infusjoner, legg trykk på kateterstedene til blødningen stopper, og returner musene til deres hjemmebur.Deretter sendes prøvene for GCMS. Beregn isotopens isotop i isotop under glukosetopp ved GCCMS ved hjelp av pentaacetatderivatet. Kort sagt innebærer denne metoden forberedelse av pentaacetatderivatet av glukose, etterfulgt av prøveanalyse ved hjelp av GCMS i positiv kjemisk ioniseringsmodus.Selektiv ionovervåking av masse-til-lading-forholdet, 171 til 169, utføres for å bestemme M pluss to berikelse av glukoseisotoper. Alle kinetiske målinger utføres forutsatt stabile tilstandsforhold. Beregn total plasmaglukoseutseendehastighet fra M pluss to berikelse av glukoseisotoper og plasma ved hjelp av etablerte isotopfortynningsligninger.Under stabile tilstandsforhold antas det at utseendet på glukose er lik hastigheten på forsvinning av glukose. Frekvensen av endogen glukoseproduksjon tilsvarer total plasmaglukosehastighet minus eksogen glukose. Tabell én inneholder de representative resultatene fra studien.Alle enheter uttrykkes som milligram per kilo og minutt. Ved hjelp av tidligere beskrevne isotopfortynningsligninger ble total plasmaglukosehastighet beregnet. I kontrollgruppen var gjennomsnittlig glukosefrekvens for utseende 19,98 i fastende tilstand.Under glukoserike forhold var glukosefrekvensen for utseende 25,8. Glukoseproduksjonsraten var 19,08 i fastende tilstand og 8,56 i glukoserik tilstand. Unormal glukosemetabolisme og homeostase er vanlig i PCOS.Ved forstyrrelser i unormal glukosemetabolisme er regulering av undertrykkelse av glukoseproduksjon kompromittert, noe som fører til hyperglykemi. I denne studien beskriver vi en enkel måte å måle frekvensen av leverglukoseproduksjon hos flere mus samtidig. De kritiske komponentene i dette eksperimentet er kateterets innsetting og definering av de nøyaktige målingene av glukoseisotoper og naturlig glukose for å kunne utføre GCMS tilstrekkelig.Fordelene ved studien er å oppnå infusjonen på en minimalt invasiv måte på grunn av innsetting av halevenekateter, samt bruk av en lett oppnåelig, stabil glukosesporer. Det er noen begrensninger i studien, inkludert den tekniske etterspørselen av prosedyren og behov for mulige tilleggsferdigheter. Totalt sett beskriver vi en enkel, nøyaktig måte å måle frekvensen av total leverglukoseproduksjon i en PCOS-musemodell.Denne teknikken kan tjene som grunnlag for flere studier som involverer glukosemetabolisme av musemodeller.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

En Preklinisk Murine Modell av levermetastaser

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

En Mulig Sebrafisk Modell av Polycystisk Nyresykdom: knockdown av<em&gt; Wnt5a</em&gt; Årsaker Cyster i sebrafisk Nyrer

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Evaluering av Tumor-infiltrere Leukocytt Delsett i en Subkutan Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Kylling-indusert Surfaktantfritt Nedbryting i Pigs som en modell av den Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Generering av en humanisert muselever med humane lever stamceller

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Invasive Hemodynamic Characterization of the Portal-hypertensive Syndrome in Cirrhotic Rats

Invasiv Hemodynamic karakteristikk av Portal-Hypertensiv syndrom i Cirrhotic rotter

This is a detailed protocol describing invasive hemodynamic measurements in cirrhotic rats for the characterization of portal hypertensive syndrome. ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

Oljesyre-injeksjon i griser som en modell for akutt Respiratory Distress syndrom

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk Contractility måling av musen hvem arterien bruker Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

Standardisert histomorfoometrisk evaluering av slitasjegikt i en kirurgisk musemodell

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...